Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Общая характеристика объектов и методов исследования
2.2. Структура исследований
2.3. Материально-техническое обеспечение аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена .
2.3.1. Метод гидроимпульсной санации
2.3.1.1 Техническое обеспечение метода гидроимпульсной санации
2.3.1.2 Методика проведения гидроимпульсной обработки
2.3.2 Метод аппликационно-инъекционного применения гидроли-зата коллагена
2.3.2.1 Техническое обеспечение метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
2.3.2.2 Принципы работы устройства для обеспечения метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
2.3.2.3 Материальное обеспечение метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
2.4. Описание метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
2.5. Моделирование раны
2.5. Условия проведения и структура экспериментальных исследований
2.6. Группы экспериментальных исследования
2.7. Методы исследования
ГЛАВА 3. Результаты проведенных исследований
3.1. Результаты объективных методов исследования
3.2. Результаты планиметрическихметодов исследования
3.3. Результаты гистологических и гистохимических исследований
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Материально-техническое обеспечение аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
- Техническое обеспечение метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
- Условия проведения и структура экспериментальных исследований
- Результаты планиметрическихметодов исследования
Материально-техническое обеспечение аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
Объектом исследования явилась разработка метода комплексного лечения гнойных ран, основанного на сочетанном применении гидроимпульсных санаций и аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена.
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины.
В качестве лабораторных животных использовались половозрелые самцы белых крыс, что было обусловлено их восприимчивостью к моделированию раневого процесса, удобством в обращении.
Экспериментальные исследования проводились в строгом соответствии с принципами, изложенными в Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (г. Страсбург, Франция, 18.03.1986 г.), Приказом Минздрава Российской Федерации от 19.06.2003 №267 «Об утверждении Правил лабораторной практики».
Экспериментальные исследования проведены на 192 белых крысах с гнойными ранами мягких тканей в 8 группах исследований (24 животных в группе): 2-х опытных и 6-х контрольных.
В 1 контрольной группе лечение не проводилось. Во 2-й контрольной группе проводили гидроимпульсную санацию раневой поверхности 0,9% раствором NaCl. В 3-й контрольной группе выполняли аппликации 16% гид ролизата коллагена. В 4-й контрольной группе – инъекционное введение 16% гидролизата коллагена. В 5-й контрольной группе выполняли гидроимпульсную санацию раневой поверхности 0,9% раствором NaCl в сочетании с аппликационным применением 16% гидролизата коллагена. В 6-й контрольной группе выполняли гидроимпульсную санацию раневой поверхности (ГИС) 0,9% раствором NaCl в сочетании с инъекционным введением 16% гидроли-зата коллагена. В 1-й опытной группе проводили аппликационно-инъекционное введение 16% гидролизата коллагена. В 1 опытной группе лечение ран осуществляли с использованием гидроимпульсной санации раневой поверхности (ГИС) 0,9% раствором NaCl в сочетании с аппликационно-инъекционным введением 16% гидролизата коллагена.
Изучение эффективности сочетанного применения гидроимпульсной санации раневой поверхности 0,9% раствором NaCl в сочетании с апплика-ционно-инъекционным введением 16% гидролизата коллагена оценивали с помощью объективных (общее состояние животных, местные проявления воспаления /гиперемия, отечность, характер отделяемого, болезненность при пальпации/, температурная реакция, сроки появления грануляций и эпители-зации); планиметрических (площадь ран и скорость ее уменьшения за сутки); гистологических (окраски гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону) и гистохимических (содержания PHK). Объективные и планиметрические показатели течения раневого процесса оценивали сразу после моделирования раны и, в последующем, ежедневно. Забор тканей для морфологических исследований осуществляли на 1, 3, 5, 7, 14, 21-е сутки от начала опыта.
Данные, полученные при проведении исследований, приведены в соответствии с международной системой единиц (СИ).
Рандомизация осуществлялась с использованием метода конвертов в два этапа. На первом этапе были заготовлены по 24 листа бумаги с маркировкой «1К», «2К», «3К», «4К», «5К», «6К», «1О», «2О». Получившиеся 192 маркированных листа бумаги были сложены вдвое маркировкой внутрь, пе-24 ремешаны и случайным образом разложены в 192 конверта. После моделирования гнойной раны по стандартной методике, после снятия швов с раны вскрывали один из случайно выбранных конвертов с целью определения дальнейшего лечения. Маркировка на листе «1К» не требовала дополнительных манипуляций (1 контрольная группа). Маркировка «2К» обозначала необходимость проведения гидроимпульсной санацию раневой поверхности (ГИС) 0,9% раствором NaCl (2 контрольная группа); «3К» - аппликационного применения 16% гидролизата коллагена (3 контрольная группа); «4К» - инъекционного введения 16% гидролизата коллагена (4 контрольная группа); «5К» - гидроимпульсной санации раневой поверхности (ГИС) 0,9% раствором NaCl в сочетании с аппликационным применением 16% гидролизата коллагена (5 контрольная группа); «6К» - гидроимпульсной санации раневой поверхности (ГИС) 0,9% раствором NaCl в сочетании с инъекционным введением 16% гидролизата коллагена (6 контрольная группа); «1О» – апплика-ционно-инъекционного применения 16% гидролизата коллагена (1 опытная группа). В случае выпадения листа с маркировкой «2О» лечение ран осуществляли с использованием гидроимпульсной санации раневой поверхности (ГИС) 0,9% раствором NaCl в сочетании с аппликационно-инъекционным введением 16% гидролизата коллагена (2 опытная группа).
Статистическая обработка данных производилась с помощью метода вариационной статистики, критерия Стьюдента (достоверным различие считалось при значении p0,05), критерия Вилкоксона; сравнение не связанных выборок осуществлялось с применением критерия Манна-Уитни; для оценки связи между признаками проведен анализ Спирмена. При оформлении и проведении расчетов статистических данных использовался пакет прикладных компьютерных программ MSExel 2007.
Техническое обеспечение метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
На первом этапе выполняется очистка поверхности раны струей 0,9% раствора NaCl, направленная на удаление крупных инородных тел, некроти-зированных тканей. Используется струя жидкости с максимальным выходным давлением (около 5-7 атм.). Обработка ведется под острым углом расстояния 2-5 см от сопла до обрабатываемых тканей, что позволяет достигать наилучшего очищения поверхности раны. Для качественной поверхностной обработки раны достаточно воздействия струи жидкости в течение 1-2 секунд на 1 см2 площади раневой поверхности.
На втором этапе гидроимпульсной обработки используется струя 0,9% раствора NaCl с выходным давлением до 5 атм. Обработка производится с расстояния 5-8 см, что позволяет обеспечить создание дисперсной струи раствора и сохранение кинетических свойств потока. Обработка направлена на тщательную обработку поверхности раны, направленную как на удаление микробных тел и некротизированных тканей, так и на проведение гидромассажа тканей. Длительность воздействия струи жидкости на ткани 4-5 сек. на 1 см2 поверхности раны. При данном виде воздействия струю также желательно направлять под углом 30-600 к плоскости раны. Второй этап гидроимпульсной обработки проводится от центра раны к периферии.
Применение способа гидроимпульсной санации ран, особенно при наличии гнойного процесса, анаэробной инфекции в малодоступных слоях раны, позволяет ускорить очищение раны от гнойно-некротических тканей, микробов, уменьшить ригидность ее стенок, что облегчает их сопоставление, позволяет ускорить регенераторные процессы. 2.3.2 Метод аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена
Техническое обеспечение метода аппликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена.
Для реализации метода аппликационно-инъекционного введения гидролизата коллагена, совместно с инженерным бюро «Химавтоматика» (г. Воронеж) и сотрудниками НИИ хирургической инфекции Воронежской государственной медицинской академии имени Н.Н.Бурденко разработано специальное устройство /патент №126601 от 10.04.13 г./ (рис. 2).
Устройство (рис. 3) состоит из силового механизма, включающего пружину и поршень со штоком, размещенных в полости корпуса; емкости для препарата соединенной с подпоршневой полостью, являющейся частью полости корпуса; ограниченной поршнем, впускного и выпускного обратного клапанов, установленных в корпусе на входе для подачи препарата и на выходе из корпуса, и регулятора выдавливаемого объема препарата.
Устройство имеет блок управления и индикации температуры, датчик температуры, соединенный с блоком управления и индикации температуры, нажимную рукоятку, соединенную со штоком, рукоятку, закрепленную на корпусе, сменные насадки для инъекции и аппликации, устанавливаемые с фиксацией на выходе из корпуса. Емкость снабжена нагревательным элементом, подключенным к блоку управления, и каналом подвода воздуха. Регулятор вводимого объема выполнен в виде упора, размещенный в торце корпуса напротив выхода для препарата, с частичным погружением в полость и возможностью поступательного перемещения в ней.
Подготовка устройства к работе осуществляется следующим образом: необходимо соединить часть устройства, контактирующую с препаратом, с его механической частью; установить емкость с препаратом; выбрать насадку, в зависимости от типа выполняемых работ, т.е. для выполнения аппликаций или инъекций; установить выбранную насадку на изделие. Путем надавливания на нажимную рукоятку (10) поршнем (9) удалить воздух из подпоршневой полости через выпускной обратный клапан (7). Далее при отпускании нажимной рукоятки (10) под воздействием возвратной пружины (8) поршень (9) возвращается в исходное положение, определяемое позицией регулировочной рукоятки (11), установленной на определенную разовую дозу вводимого препарата, которой сответствует объему подпоршне-вой полости. Выпускной обратный клапан (7) одновременно с обратным движением поршня (9) закрывается, предотвращая поступление атмосферного воздуха в полость устройства (рис. 2). Впускной обратный клапан (6) в ответ на создаваемое разряжение в полостях устройства, открывается, обеспечивая заполнение подпошневой полости устройства веществом из емкости для препарата (4). Для нормализации давления емкость для препарата (4) снабжена каналом подвода атмосферного воздуха (5), оснащенного фильтром. Емкость для препарата (4) оснащена нагревательным элементом (3) для поддержания температуры препарата, контроль которой осуществляется блоком управления и индикации (1) и регистрируется с помощью датчика температуры препарата (2). Для полного удаления воздуха из полостей устройства необходимо произвести 3-5 надавливаний до упора на нажимную рукоятку (10).
При работе с устройством необходимо следить за достаточным количеством препарата в емкости (4) с целью предотвращения попадания воздуха во внутренние полости устройства.
Устройство применяется совместно со сменными насадками. Тип устанавливаемой насадки определяется типом выполняемых работ. Установка насадок производится на срез выпускного обратного клапана (7).
Окончание работы с устройством осуществляется следующим образом: необходимо отсоединить и заменить емкость с препаратом емкостью с дистиллированной водой; произвести необходимое количество нажатий на нажимную рукоятку до начала выхода через выпускной обратный клапан чистой дистиллированной воды; разобрать устройство; произвести его стерилизацию согласно приказа Минздрава СССР от 31.07.78 N 720 «Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией», пункт 9 – стерилизации хирургических инструментов, резиновых перчаток, перевязочного материала, хирургического белья.
Условия проведения и структура экспериментальных исследований
Во 2-й контрольной группе при проведении морфологического исследования ран было выявлено, что на 1-е сутки после лечения поверхность раны покрыта гнойно-некротическим отделяемым. В слоях дермы имеются многочисленные кровоизлияния, отмечается воспалительная лейкоцитарная инфильтрация. Выраженный отек тканей на всем протяжении дефекта. В сетчатом слои дермы наблюдаются единичные скопления тканевых базофи-лов. Сосуды спазмированы.
На 3-и сутки после проведения ГИС (2-я контрольная группа) – на поверхности раны гнойно-некротическое отделяемое, выраженный отек тканей. Воспалительный инфильтрат в пределах дермы содержит лейкоциты и макрофаги. Формирование грануляций не наблюдается.
На 5-е сутки после проведени ГИС (2-я контрольная группа) – некротические массы и отек менее выражены, наблюдаются микроабсцессы. Имеются участки грануляционной ткани.
В 2-й контрольной группе на 7-е сутки имеется дефект эпидермиса, хотя на некоторых участках эпителизация завершена, толщина эпидермиса не сответствует зрелому уровню. Имеются признаки воспалительной реакции, которая проявляется диффузной инфильтрацией. Отмечается формирование грануляционной ткани, прогрессирование ангиогенеза.
На 1 сутки после лечения в моделирования раневого процесса в 1-й опытной группе имеется дефект эпидермиса с краями, густо инфильтрирова-ными полиморфноядерными лейкоцитами. В раневом канале – лимфоциты, плазмоциты и макрофаги. В мягких тканях выражены полнокровие и отек. В глубоких слоях дермы отмечаются отек и набухание коллагеновых волокон, диффузная инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами. Воспалительная инфильтрация, проникает в межмышечные пространства и представлена преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами. Мышечные волокна раздвинуты, некоторые с выраженной дистрофией, отдельные мышечные волокна с явлениями миолиза.
В 3-й, 4-й контрольных и 1 опытной группах (АП 16% ГК, ИВ 16% ГК, АИП 16% ГК) на 1 сутки после лечения имеется дефект эпидермиса с краями, густо инфильтрироваными полиморфноядерными лейкоцитами, определяются лимфоциты, плазмоциты и макрофаги. В мягких тканях выражены полнокровие и отек, набухание коллагеновых волокон, диффузная инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами. Мышечные волокна раздвинуты, некоторые с выраженной дистрофией, отдельные мышечные волокна с явлениями миолиза.
На 3-е сутки после АП 16% ГК, ИВ 16% ГК, АИП 16% ГК отек слабо выражен, местами начинает формироваться молодая грануляционная ткань, представленная фибрином, фибробластами, гистиоцитами, и эндотелиоцита-ми, видны скопления полиморфноядерных лейкоцитов.
На 7-й день в 3-й, 4-й контрольных и 1 опытной группах (АП 16% ГК, ИВ 16% ГК, АИП 16% ГК) наблюдается формирование грануляционной ткани с полнокровием синусоидов (рис. 17). В некоторых зонах видна пролиферация эпителия. Отмечено увеличение количества фибробластов, гистиоци тов, тканевых базофилов и коллагеновых волокон. На 7-е сутки поверхность раны покрыта эпидермисом, под которым лежит грануляционная ткань, богатая сосудами с выраженным полнокровием, фибробластами, коллагеновыми волокнами, гистиоцитами, в некоторых ранах еще присутствуют лейкоциты.
3-я контрольная группа. Седьмые сутки. Мышечные волокна отечны и инфильтрированы полиморфноядерными лейкоцитами. Окраска гематоксилином и эозином. Окуляр 10, объектив 40.
В 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах через сутки после начала лечения морфологическое исследование выявило выраженную нейтро-фильную инфильтрация, отек на протяжении всего дефекта.
На 3-и сутки в 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах – незначительное количество гнойно-некротического содержимого в зоне дефекта, отек, отмечается снижение воспалительного инфильтрата в сетчатом слое дермы. Наблюдаются очаги формирования грануляционной ткани, ангиоге-нез, имеются отдельные коллагеновые волокна, скопления фибробластов и тканевых базофилов.
Результаты планиметрическихметодов исследования
На 1 сутки после лечения в моделирования раневого процесса в 1-й опытной группе (рис. 9) имелся дефект эпидермиса с краями, густо инфильт-рироваными полиморфноядерными лейкоцитами. В раневом канале имеются лимфоциты, плазмоциты и макрофаги. В мягких тканях выражены полнокровие и отек. В глубоких слоях дермы – отмечается отек и набухание коллаге-новых волокон, диффузная инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами (рис. 10). Воспалительная инфильтрация, проникает в межмышечные пространства и представлена преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами. Мышечные волокна раздвинуты, некоторые с выраженной дистрофией, отдельные мышечные волокна с явлениями миолиза.
В 3-й, 4-й контрольных и 1 опытной группах (АП 16% ГК, ИВ 16% ГК, АИП 16% ГК) на 1сутки после лечения имелся дефект эпидермиса с краями, густо инфильтрироваными полиморфноядерными лейкоцитами, имеются лимфоциты, плазмоциты и макрофаги. В мягких тканях выражены полнокровие и отек, набухание коллагеновых волокон, диффузная инфильтрация по-лиморфноядерными лейкоцитами. Мышечные волокна раздвинуты, некоторые с выраженной дистрофией, отдельные мышечные волокна с явлениями миолиза.
На 3-е сутки: после АП 16% ГК, ИВ 16% ГК, АИП 16% ГК отек слабо выражен, местами начинает формироваться молодая грануляционная ткань, представленная фибрином, фибробластами, гистиоцитами, и эндотелиоцита-ми, видны скопления полиморфноядерных лейкоцитов.
На 7-й день в 3-й, 4-й контрольных и 1 опытной группах (АП 16% ГК, ИВ 16% ГК, АИП 16% ГК) наблюдается формирование грануляционной ткани с полнокровием синусоидов. В некоторых зонах видна пролиферация эпи телия. Отмечено увеличение количества фибробластов, гистиоцитов, тканевых базофилов и коллагеновых волокон. На 7-е сутки поверхность раны покрыта эпидермисом, под которым лежит грануляционная ткань, богатая сосудами с выраженным полнокровием, с фибробластами, коллагеновыми волокнами, гистиоцитами, в некоторых ранах еще присутствуют лейкоциты.
В 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах через сутки после начала лечения морфологическое исследование выявило выраженную нейтро-фильную инфильтрация, выраженный отека на протяжении всего дефекта. Активность ЩФ снижена.
На 3-и сутки в 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах – незначительное количество гнойно-некротического содержимого в зоне дефекта, отек, отмечается снижение воспалительного инфильтрата в сетчатом слое дермы. Наблюдаются очаги формирования грануляционной ткани, ангиоге-нез, имеются отдельные коллагеновые волокна, скопления фиброблатов и тканевых базофилов. Активность ЩФ повышена.
Морфологическая картина на 5-и сутки в 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах – эпителизация раневого дефекта, грануляционная ткань с большим содержанием фибробластов, расположенных вокруг многочисленных коллагеновых волокон. Выраженный ангиогенез. Активность ЩФ выше предыдущего уровня.
На 7-е сутки раны в 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах – практически полная эпителизация зоны дефекта, активный ангиогенез, сосуды полнокровные. Грануляционная ткань различной степени зрелости со скоплениями коллагеновых волокон, фибробластов и тканевых базофилов. Наблюдается рост активности ЩФ по сравнению с 5 сутками.
Повышение активности ЩФ отражало течение раневого процесса и отразило созревание грануляционной ткани. 1, 3 и 4 контрольных группах и 1-й опытной группах уровень изучаемого фермента был минимальный, что было нами связано с недостаточным качеством проведенной санации раневой поверхности. Наиболее выраженные изменения активности щелочной фосфатазы в 1-е сутки после лечения наблюдались при проведении ГИС (2, 5 и 6 контрольные и 2 опытные группы). На 3, 5 сутки после лечения наблюдалась анологическая динамика. На 7-е сутки было отмечено наиболее выраженное повышение изучаемого показателя в 6-й контрольной и 2-й опытной группах, а также отставание значений показателей в 5-й контрольной группе.
Анализ морфологических изменений показал, что по сравнению с ранами 1-й контрольной группы, в 5-й, 6-й контрольных и 2-й опытной группах наблюдались более ранние очищение раны от гнойно-некротического содержимого, миграция и пролиферация фибробластов, восстановление количества тканевых базофилов, организация и созревание коллагеновых волокон.
При анализе результатов лечения особое внимание уделялось выявлению осложнений, противопоказаний для проведения разработанного метода леяения гнойных ран. Осложнений при проведении исследований как в контрольных, так и опытных группах животных выявлено не было.
Таким образом, на основании проведенных экспериментальных исследований было установлено, что применение гидроимпульсной санации и ап-пликационно-инъекционного применения гидролизата коллагена в комплексном лечении гнойных ран мягких тканей способствует ускорению очищения раны от гнойно-некротических масс и микробных тел, сокращению сроков воспалительной инфильтрации и ускоряет течение пролиферации, что выражается в стимуляции ангиогенеза, в образовании и созревании грануляционной ткани с последующей эпителизацией. Выводы.
