Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 11
1.1. Принципы тканевой инженерии 12
1.2. Пластические материалы 14
1.3. Роль сульфатированных гликозаминогликанов в процессе регенерации соединительной ткани 22
1.4. Биокомпозиционные материалы на основе костного коллагена, сГАГ и гидроксиапатита 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 28
2.1. Оценка цитотоксичности сГАГ и их влияние на пролиферацию стромальных клеток костного мозга in vitro (МТТ-тест) 28
2.2. Влияние сГАГ на морфологию клеточных культур стромальных клеток костного мозга и пролиферацию клеток in vitro 29
2.3. Исследование свойств костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на модели гетеротопической имплантации 29
2.4. Исследование свойств костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на модели ортотопической имплантации 32
2.5. Оценка внедрения костнопластических материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами в клиническую практику 36
ГЛАВА 3. Результаты исследования свойств сульфатированных гликозаминогликанов на клеточных культурах стромальных клеток in vitro 42
3.1. Влияние сГАГ на морфологию клеточных культур стромальных клеток костного мозга и пролиферацию клеток in vitro 42
3.2. Оценка цитотоксичности сГАГ и их влияние на пролиферацию стромальных клеток костного мозга in vitro (МТТ-тест) 45
ГЛАВА 4. Результаты экспериментального исследования свойств материала на модели ортотопического и гетеропического остеогенеза 49
4.1. Исследование свойств костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на модели гетеротопическои имплантации 49
4.1.1. Опытная серия 49
4.1.2. Состояние контрольных образцов 55
4.2. Исследование свойств костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на модели ортотопическои имплантации 58
4.2.1 Рентгенологическое исследование 58
4.2.2. Гистологический анализ контрольной группы 62
4.2.3. Гистологический анализ опытной группы 68
ГЛАВА 5. Оценка внедрения костнопластических материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами в клиническую практику 85
Заключение 96
Выводы 102
Список литературы 103
Приложение 117
- Роль сульфатированных гликозаминогликанов в процессе регенерации соединительной ткани
- Исследование свойств костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на модели гетеротопической имплантации
- Оценка цитотоксичности сГАГ и их влияние на пролиферацию стромальных клеток костного мозга in vitro (МТТ-тест)
- Гистологический анализ контрольной группы
Введение к работе
Актуальность работы. Разработка новых биопластических материалов для проведения реконструктивных хирургических операций в травматологии и ортопедии, эффективных для получения желаемого результата лечения, остаются актуальными до настоящего времени. Актуальность рассматриваемой темы имеет общепризнанный характер, которая отражается во многих публикациях, дискуссиях, разработках и оценках новых биокомпозиционных материалов, способных активно влиять на течение костной регенерации (Снетков А.И. с соавт. 2001; Миронов СП. 2007; Baas J. et al. 2008; Greiner S.H. et al. 2008; Савельев В.И. с соавт. 2009; Gao Y. et al. 2009).
Многолетний опыт травматологии и ортопедии показал, что биологические материалы часто являются решающим фактором достижения положительного результата лечения патологии костной системы. Известно, что уровень современной медицины и сопредельных научных направлений позволяют создавать костнопластические материалы, которые по своим свойствам не уступают аутотканям, т.н. «золотому стандарту», используемых до настоящего времени для замещения дефектов костной ткани у больных с костной патологией (Langer R. et al. 1993; Spector M. 1999). При этом одним из серьезных требований к материалам является способность обеспечения надежности опорной и/или структурообразующей функции в поврежденной области ткани или органа (Yannas I.V. et. al. 1984; Reddi A.H. et. al. 1987; Reddi A.H. 1998). Во-вторых, наличие у материала остеоидуктивности, то есть способности побуждения остеобластов и других мезенхимальных клеток к формированию кости. И, в-третьих, обладать свойствами биосовместимости, то есть быть биодеградируемыми и не вызывать у реципиента воспалительных и иммунологических реакций. Последнее качество обычно достигается в процессе изготовления материала за счет снижения его антигенных составляющих (Bruck S.D. et al. 1989; Vacanti С.A. et al. 1992; Friess W. 1998). Совокупность этих свойств позволяет подобным имплантатам параллельно с опорной (остеокондуктивной) функцией, обеспечивать биоинтеграцию, т.е. врастание клеток и сосудов в структуры имплантированного материала (Thomson R.C. et. al. 1998).
Считается, что наиболее подходящими для трансплантации и последующей биоинтеграции являются аутоткани, чье использование полностью исключает иммунологические реакции после заполнения ими тканевых дефектов (Ermeking W.F. et. al. 1980; Reddi A.H. 1985; Summers B.N. et al. 1989; Goldberg V.M. 2000). Однако их получение возможно только непосредственно в процессе оперативного вмешательства, где количество тканей ограничено, особенно у детей, а процедура их забора сопровождается рядом негативных последствий, как в процессе забора, так и после него. Все это существенно ограничивает широкое применение аутотканей (Bos G.D. et. al. 1983; Horowitz M.C. et al. 1991, 1993). Таким образом, задача создания биокомпозиционных материалов, применение которых может обеспечить формирование и восстановление кости в местах ее повреждения с одновременным снижением трудовых и финансовых затрат процесса устранения костных повреждений у больных с костной патологией во многом остается открытой.
Композиция материала может включать в себя несколько составляющих. Как один из вариантов, этими составляющими могут стать гликозами-ногликаны (ГАГ), которые являются компонентом костного матрикса регулирующие репаративные процессы. Известно, что полисахариды, входящие в состав протеогликанов, линейные полимеры, построенные из дисахаридных субъединиц, образованные уроновыми кислотами (глюкуроновой, галактуро-новой и идуроновой), N-ацетилгексозаминами (N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин) и нейтральными сахаридами (галактозой, маннозой и ксилозой) называются гликозаминогликанами (Стейси М. с соавт. 1965). Обоснованием включения ГАГ в состав биокомпозиционных материалов является многолетняя история экспериментальных исследований, которая показала положительное влияние гликозаминогликанов на регенерацию костной, хрящевой, нервной и других тканей (Гамалея Н.Ф. 1946; Richterich R. et al. 1958; Слуцкий Л.И. 1969; Касавина Б.С. с соавт. 1970; Серов В.В. с соавт.
1981; Kalbhen D.A. et al. 1990; Glade M.J. 1990; Bassleer С et al. 1992; Омель-яненко Н.П. с соавт. 2009). Известно, что зрелая костная ткань содержит в основном сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) — хондроитин-4- и хондроитин-6-сульфаты, дерматансульфат и кератансульфат. Они представляют собой линейные полисахаридные полимеры, в физиологических состояниях представленные в виде комплексов с белками. Костный матрикс зрелой кости содержит коллагены, неколлагеновые белки, гликопротеиды и протеогликаны, в состав последних и входят сГАГ (Панасюк А.Ф. с соавт. 2000). Биосинтез протеогликанов в костной ткани осуществляется активиро-ваными остеобластами и в незначительной степени зрелыми остеоцитами (Juliano R. et al. 1993; Wendel M. et al. 1998). Сульфатированные ГАГ участвуют практически во всех процессах обмена соединительной ткани в первую очередь в формировании коллагеновых и эластиновых волокон (Панасюк А.Ф. с соавт. 2000). Очевидно, что роль сГАГ в регуляции остеогенеза достаточно значительная (Burger М. et al. 1962). В последнее время эти положения нашли свое подтверждение по итогам исследования процессов регенерации костной ткани (Pieper J.S. et. al. 2000; Омельяненко Н.П. с соавт. 2009).
Для выполнения опорной функции биокомпозиционного материала может быть использован искусственный или натуральный гидроксиапатит (ГА). В настоящее время для замещения костных дефектов в травматологии и ортопедии активно используются различные формы гидроксиапатита, отличающиеся по форме, величине частиц, пор и т.д. (Jarcho М. et al. 1977; Klein СР. et al. 1983; Parsons J. et al. 1988; Ripamonti U. et al. 1992; Воложин А.И. с соавт. 1993; Friess W. 1998). В этой связи логично использовать природный ГА, который входит в состав костной ткани наряду с коллагеном. Последний при этом сохраняет свою архитектонику. К основным достоинствам коллагена - как пластического биоматериала следует отнести его низкую токсичность и антигенность, высокую механическую прочность и устойчивость к тканевым протеазам (Истранов Л.П. 1976). Известно, что коллаген и ГА взятые по отдельности обладают в основном лишь остеокондуктивными свойст- вами (Parsons J. et al. 1988; Mehlisch D.R. 1989). При объединении этих соединений в комплекс, они способны оказывать определенный остеоиндук-тивный эффект, хотя имеющиеся в литературе данные по этому вопросу достаточно противоречивы. И, наконец, если в данном комплексе будут присутствовать ещё и сГАГ, то такая композиция может иметь дополнительные ос-теоиндуктивные свойства.
Взяв за основу три основных компонента - костный коллаген и ГА, полученные из костной ткани животных (телята и свиньи), а также выделенные сГАГ (Панасюк с соавт. 2000; Панасюк А.Ф. с соавт. 2004) фирма «Конек-тбиофарм» разработала биокомпозиционный материал, который был представлен на рынок медицинских услуг. Продолжением этого направления стала совместная разработка «Конектбиофарма» с тканевым банком ПИТО им. Н.Н. Приорова биокомпозиционного материала на основе аллогенных тканей (Снетков А.И. с соавт. 2001).
Настоящая экспериментально-клиническая работа посвящена оценке свойств биокомпозиционного материала нового поколения на основе алло-генного костного коллагена импрегнированного сГАГ, предназначенного для клинического использования в травматологии и ортопедии.
Цель исследования.
Экспериментальное изучение влияния пластических материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликоза-миногликанами на процесс регенерации костной ткани с использованием различных экспериментальных моделей и внедрение данного вида материалов в клиническую практику.
Задачи исследования.
1. Оценить влияние сГАГ на пролиферацию культур стромальных клеток костного мозга.
Изучить влияние сГАГ на свойства имплантатов на модели гетерото-пической имплантации.
Сравнить интенсивность и характер замещения имплантатов на основе костного коллагена с сГАГ и без них.
Разработать и внедрить в клиническую практику биокомпозиционный материал на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ.
Оценить результаты применения разработанного биокомпозиционного материала в клинике.
Научная новизна.
Проведено исследование влияния сГАГ на пролиферацию культуры стромальных клеток костного мозга.
На экспериментальных моделях гетеротопической и ортотопической имплантации показана целесообразность включения сГАГ в состав остеопла-стических биокомпозиционных материалов.
Разработан и внедрен в клиническую практику новый биокомпозиционный материал на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ.
Показана эффективность клинического применения имплантатов на основе костного аллоколлагена импрегнированного сГАГ при замещении пострезекционных дефектов костной ткани.
Практическая значимость.
Дана экспериментальная оценка влияния сГАГ на процессы регенерации костной ткани.
Доказана целесообразность введения сульфатированных гликозами-ногликанов в состав остеопластических биокомпозиционных материалов
Разработан и внедрен в клиническую практику биокомпозиционный материал «Остеоматрикс» на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген и сГАГ.
Внедрение результатов работы.
Биокомпозиционный материал на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген, сГАГ и гидроксиапатит внедрен в работу отделений косной патологии ФГУ ЦИТО им. Н.Н.Приорова, Московской областной детской ортопедохирургической больницы восстановительного лечения, ДГКБ №13 им. Н.Ф.Филатова г. Москвы.
Апробация работы.
Материалы исследования доложены на:
Симпозиуме «Биоимплантология на пороге XXI века», Москва, 2001; Third World Congress on Tissue Banking and 26th Annual Meeting AATB, Boston, 2002;
11th International Conference on Tissue Banking and EATB Annual Meeting, Bratislava, 2002;
II Всероссийском Симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии», Самара, 2004;
13th International Congress of the European Association of Tissue Banking, Prague, 2004;
4th World Congress on Tissue Banking, Rio de Janeiro, 2005;
5th Congress of Baltic Association for maxillofacial and plastic surgery, Kaunas, 2005;
3 Международном Конгрессе «Современные технологии в травматологии и ортопедии», Москва, 2006;
III Всероссийском Симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Москва, 2007; - IV Всероссийском Симпозиуме с международным участием: «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Санкт-Петербург, 2010;
Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 22 работы. В том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получено 7 патентов на изобретения.
Объем и структура.
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста. Состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 46 работ из отечественных и 100 работ из зарубежных источников, приложения. Иллюстрирована 71 рисунками, 4 таблицами, 4 диаграммами.
Роль сульфатированных гликозаминогликанов в процессе регенерации соединительной ткани
В 60-х годах прошлого столетия в ЦИТО был разработан препарат «Луронит» представляющий собой гиалуроновую кислоту. Его получали из стекловидного тела глаз крупного рогатого скота путем освобождения от балластных веществ гомогенизацией, фильтрацией и обработкой хлороформом с последующим осаждением этанолом и лиофилизацией (Касавина Б.С. с соавт. 1973). Тогда же получили препарат «Хонсурид» из гиалиновых (носовых и трахейных) хрящей крупного рогатого скота, содержащий хондрои-тинсульфаты А и С. Использование разработанных в ЦИТО препаратов базировалась на эффекте вызываемом гиалуроновой кислотой, где под ее влиянием происходит ускорение регенерации костной и нервной ткани, заживление трофических кожных язв (Гамалея Н.Ф. 1946). Создание препарата на основе гиалуроновой кислоты совпали с результатами работ Фриденштейна А.Я. с соавторами (1973), которые пришли к выводу, что основным претендентом на роль индуктора гетеропического остеогенеза в модельной системе является мукополисахарид (в современной терминологии протеогликан). К такому же заключению пришла и Лаврищева Г.И., считая, что протеогликаны могут быть включены в контроль микроокружения над гемопоэзом и другими гистогенезами производных мезенхимы и костной ткани в частности (Hadhazy С. et al. 1989; Лаврищева Г.И. с соавт. 1996). Многообразие протеогликанов затрудняет создание четкой классификации и номенклатуры этих соединений. Обычно указывают тип ткани, из которой получен протеогликан, общий размер молекулы (условно различают «большие» и «малые» протеогликаны), преобладающую структуру углеводных цепей (возможны гибридные формы) и способность к специфическим взаимодействиям с гиалуроновой кислотой («агрегирующие» и «неагрегирующие» протеогликаны).
Термин гликозаминогликаны (ГАГ) был предложен Anseth А. в 1961 году и является в настоящее время общепринятым. Гликозаминогликановые цепи нескольких типов, а также О- и N-олигосахаридные фрагменты, характерные для гликопротеинов входят в состав макромолекулы протеогликанов. По классификации Mathews М.В. (1975) ГАГ разделяются степенью сульфа-тированности и молекулярной массой, где наибольшую величину имеют молекулы гиалуроновой кислоты (Серов В.В., Шехтер А.Б. 1981). В развивающейся костной ткани содержание гиалуроновой кислоты (несульфатирован-ный ГАГ) в два раза выше, чем в зрелой кости (Nowicka-Jankowska Т. 1971). Зрелая костная ткань содержит в основном сульфатированные ГАГ - хонд-роитин-4 и хондироитинульфат-6 сульфат, дерматан сульфат и кератан сульфат (Zou Х.Н. et al. 2009). Хондроитинсульфаты вместе с кератан-, дерматан-, гепарансульфатами и гепарином относятся к группе соединений, которые имеют общее название - сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) (Стейси М. с соавт. 1965).
Всестороннее изучение сГАГ по мнению ряда авторов позволило говорить об их стимулирующем влиянии на процессы регенерации костной и хрящевой ткани практически на всех этапах репарации (Русаков А.В. 1959; Касавина Б.С. с соавт. 1970; Kalbhen D.A. 1990; Bassleer С. et al. 1992; Volpi соавт. 2000). Выяснилось, что они участвуют в формировании коллагеновых волокон в процессе сборки молекулы матрикса (Слуцкий Л.И. 1969; Garg А.К. et al. 1989; Glade M.J. 1990; Bassleer С. et al. 1992). При этом микрофибриллы коллагена сначала связываются олигосахарами гликопротеинов, создаются укрупненные фибриллы, которые затем с помощью цепей ГАГ, объединяются в волокна различной толщины (Серов В.В. с соавт. 1981; Kuijer R. et al. 1985; Омельяненко Н.П. с соавт. 2009). Некоторые исследования показали, что сГАГ играют важную роль в процессе отложения кальция в созревающей костной ткани, действуя как активные хелаторы ионов кальция, обеспечивающие накопление в ткани кальция до концентрации, достаточно высокой для минерализации (Balmain-Oligo N. et al. 1967; Zambotti V. et al. 1972; Schaffrath D. et al. 1976; Tajima T. et al. 1983; Bouvier M. et al. 1990). Ряд исследований показал, что отсутствие или недостаток сГАГ приводит к нарушению процесса костеобразования (Layton L.L. 1951; Duthie R.B. et al. 1955; Richterich R. et al. 1958).
Экзогенное введение (внутримышечное и внутрисуставное) сГАГ в эксперименте показало положительное влияние на регенерацию поврежденных тканей суставного хряща (Carreno M.R. et al. 1986). Похожие результаты по эффекту воздействия сГАГ получили при их использовании в органной культуре нормальной и артритической хрящевой ткани (Glade M.J. 1990). Результаты экспериментального исследования противовоспалительной активности сГАГ (Setnikar I. et al. 1991) позволили включить их в комплексную терапию больным, страдающим остеоартрозом с хорошим клиническим эффектом (Uebelhart D. et al. 1998; Gaby A.R. 1999).
Появление нового биокомпозиционного материала на основе костного коллагена и сГАГ, выделенных из костной ткани животных (Панасюк А.Ф. с соавт. 2000, 2004) стало, как бы, логическим продолжением научного поиска, анализа и последующей разработки новых имплантатов. Введение в состав материала, предназначенного для замещения костных дефектов, биологически активной субстанции, которой являются сГАГ с их характеристикой, по здравому рассуждению должно было способствовать созданию крайне эффективного продукта медицинского назначения. Непосредственное помещение в костный дефект необходимого количества сГАГ на ранних стадиях репарации, по логике, должно ускорить процессы регенерации костной ткани в максимально короткие физиологические сроки. Разработанная технология получения материала, как и «конечный продукт» явились оригинальными и не имеющие зарубежных аналогов, т.к. каких-либо литературных данных об использовании сГАГ в составе имплантированных материалов, мы не нашли. Источником коллагена и сГАГ явились молодые животные (телята и свиньи), материал, таким образом, является ксеногенным (т.е. используемые у людей ткани животного происхождения).
Исследование свойств костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на модели гетеротопической имплантации
Для фотометрической оценки пролиферации и гибели клеток в культуре использовали МТТ-тест. МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетразолий бромид) восстанавливается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатдегидрогеназы до водонерастворимого темноокрашенно-го формазана. Формазан может быть эллюирован из клеток с помощью органических сольвентов (изопропанол, ДМСО, ДМФА и т.д.) Определено, что оптическая плотность эллюатов при длине волны 570 нм (максимум поглощения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце.
В эксперименте по выявлению цитотоксичности образцов клетки высевали в 24-луночные платы с плотностью 50 тысяч клеток/лун. Через 24 часа, когда клетки распластывались, в лунки вносили раствор сГАГ с таким расчетом, чтобы получить 3 серии. 1 серия с концентрацией сГАГ в культуральной среде 50 мкг/мл, 2 серия с концентрацией 250 мкг/мл, 3 серия с концентрацией 500 мкг/мл. В контрольной группе в культуральную срезу раствор сГАГ не добавляли. Инкубировали клетки в течение 72 часов. Затем в лунки вносили МТТ и инкубировали в присутствии МТТ (0,25 мг/мл, Serva, Германия) в течение еще 3-х часов. Формазан элюировали с помощью ДМСО в течение 30 мин при 37С и проводили измерение оптической плотности эллюата на плашечном фотометре «ЭФОС 9305» при длине волны 570 нм. Для просчета элюат из одной лунки 24-луночной платы переносили на 3 лунки 96-луночного планшета в объеме 100 мкл для получения статистически более достоверных результатов. Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Microsoft Excel. В данном случае был применен метод дисперсионного анализа.
Исследование влияния сульфатированных гликозаминогликанов (с-ГАГ) на пролиферативный рост клеточных культур проводили на культуре стромальных клеток костного мозга барана. Культура стромальных клеток костного мозга - остеогенные клетки-предшественники. Культуру выращивали стандартным методом в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной сыворотки теленка. Эксплантационная плотность клеток культур во всех образцах составляла 5x105. Сульфатированные гликозаминогликаны получили в соответствии с патентом РФ № 2162331. Были приготовлены рабочие растворы сГАГ трех концентраций: 500 мкг/мл, 2500 мкг/мл и 5000 мкг/мл.
Проводили 3 серии исследований сГАГ в клеточных культурах. В культуральные флаконы с клеточной культурой с 10 мл ростовой среды добавляли сГАГ с конечной концентрацией (с учетом количества среды) 50 мкг/мл - 1 серия опытов, 250 мкг/мл - 2 серия, 500 мкг/мл — 3 серия. Каждая серия опытов включала по 4 флакона клеточных культур. В контрольной группе во флаконы с клеточной культурой раствор сГАГ не добавляли. Культивирование проводили в течение 7 дней.
Клетки из 3 флаконов из каждой серии опытов на 7 день культивирования снимали трипсином и подсчитывали количество клеток во флаконе в камере Горяева. По одному флакону клеточных культур из каждой серии опытов на 7 день культивирования фиксировали и окрашивали по методу Гимза-Романовскому для морфологического исследования клеточных культур. Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Microsoft Excel. В данном случае был применен метод дисперсионного анализа.
Для исследования остеоиндуктивного эффекта пластических материалов на основе костного коллагена импрегнированного сульфатированными гликозаминогликанами на гетеропической модели были изготовлены блоки костного коллагена, полученного из губчатого слоя костной ткани размером 3x3x1 мм, которые были насыщены сГАГ дозой 700 мкг/см . Контролем служили аналогичные образцы костного коллагена без насыщения сГАГ.
Исследование проводили на 20 половозрелых крысах породы «Вистар» весом 150-200 грамм. Под тиопенталовым наркозом (внутрибрюшинно из расчета 6 мг на 100 г веса) в стерильных условиях животным делали кожные разрезы по срединной линии живота, затем делали надрез фасции слева и справа от срединной линии и, в образовавшиеся мышечные карманы помещали исследуемые образцы (Рис. 1, 2, 3). Каждому животному был имплантирован один экспериментальный образец и один контрольный. Раны послойно ушивали наглухо. Выводили животных из эксперимента через 1 месяц. Фрагменты тканей с имплантированными блоками вырезали, фиксировали в формалине и при наличии в них твердых уплотнений подвергали деминерализации. Полученные экспериментальные препараты обрабатывали с использованием традиционной гистологической техники их проведения, окрашивания. Для качественного анализа формирования различных типов соединительной ткани препараты окрашивали гематоксилином-эозином.
Оценка цитотоксичности сГАГ и их влияние на пролиферацию стромальных клеток костного мозга in vitro (МТТ-тест)
Для клинического использования был разработан биокомпозиционный материал нового поколения на основе аллогенных тканей, включающий костный коллаген, сГАГ и гидроксиапатит.
Клиническая оценка эффективности разработанного биокомпозиционного материала «Остеоматрикс» была проведена на основе анализа результатов лечения 54 больных с различной костной патологией, где для восстановления целостности костной ткани были использованы как изолированно «Остеоматрикс», так и в сочетание с некоторыми костнопластическими материалами и хирургическими методиками. Хирургическое лечение с использованием «Остеоматрикса» представленным больным (см. приложение) было проведено в период с февраля 2001 года по март 2005 года, возраст больных варьировал от 2 до 73 лет. Нозология патологических процессов, где были использованы «Остеоматрикс» и другие костнопластические материалы, была представлена в основном костными опухолями и опухолеподобными заболеваниями (глава «материалы и методы»). Контроль восстановления костной ткани пациентов осуществляли рентгенологическими и компьютерно-томографическими методами исследования.
«Остеоматрикс» использовали в виде блоков. После выполнения резекции патологического очага, образовавшиеся дефекты заполняли пластическим материалом. При дефектах большего размера вместе с «Остеоматриксом» использовали «Перфоост» или кортикальные замороженные аллоимплантаты, «Коллапан». 33 пациента были прооперированы с использованием только материала «Остеоматрикс», у остальных «Остеоматрикс» использовался в сочетании с другими материалами.
В раннем послеоперационном периоде в случаях использования «Остеоматрикса» нагноений или формирования гематом отмечено не было. Во всех случаях раны зажили в обычные физиологические сроки и инфекционных осложнений и рецидивов заболевания на протяжении раннего периода наблюдения (до года) выявлено не было.
Анализ рентгенограмм показал, что в большинстве случаев через 4-11 месяцев у больных область, куда помещался «Остеоматрикс», по плотности рентгенологического изображения практически не отличалась от окружающей костной ткани. Приводим несколько клинических примеров. Больной Е. 5 лет. Поступил с жалобами на боль в области нижней трети правой голени в травматологическое отделение Московской областной детской ортопедо-хирургической больницы и/б 17955. Рентгенологически был поставлен диагноз: Метафизарный фиброзный дефект нижней трети правой болынеберцовой кости (рис 67а). 06.08.2002 была произведена краевая резекция правой болынеберцовой кости с удалением патологического очага. Образовавшийся дефект был заполнен «Остеоматриксом» (Рис 676). Послеоперационный период протекал без осложнений. На контрольных рентгенологических снимках через 4 месяца после операции видно, что дефект полностью заполнен собственной костной тканью (Рис 67в). Еще один клинический пример использования «Остеоматрикса». Больной С 13 лет. Находился на лечении в 11 отделении ЦИТО с диагнозом Остеоидная остеома верхней трети левой большеберцовой кости и/б 535 (Рис. 68а). 08.02.2001 была произведена краевая резекция большеберцовой кости на протяжении 5-6 см с удалением патологического очага (Рис. 686). Пострезекционный дефект был заполнен «Остеоматриксом». Послеоперационный период протекал без осложнений. На контрольных рентгенограммах выполненных через 5 месяцев видна зона повышенной плотности вокруг дефекта. Края дефекта размыты, видно образование облаковидной костной мозоли в зоне дефекта (Рис. 68в). На контрольных рентгенограммах выполненных через 10 месяцев видно, что целостность кости восстановлена, «Остеоматрикс» полностью перестроился (Рис. 68г). Больная К. 16 лет. Находилась на стационарном лечении в Детской городской клинической больнице № 13 им.Н.Ф.Филатова (и/б 371). В ходе кли-нико-рентгенологического обследования был установлен диагноз: Метафи-зарный фиброзный дефект правой бедренной кости (Рис.69а). 15.02.2003 была произведена краевая резекция с удалением патологического очага. Образовавшийся после резекции дефект был заполнен «Остеоматриксом» (Рис.696). На контрольных рентгенограммах через 3 месяца после операции виден процесс перестройки костной ткани вокруг дефекта, образование костного регенерата(Рис.69в). Через 9 месяцев дефект полностью закрыт костным регенератом (Рис. 69г). Через 1 год и 8 месяцев зона имплантации «Остео-матрикса» практически не определяется.
Гистологический анализ контрольной группы
Современная травматология и ортопедия остро нуждается в костнопластических материалах, способствующих восстановлению целостности костной ткани при любых ситуациях, будь то травма или хроническое заболевание, ведущие к повреждению костной системы. Драматизм каждой конкретной ситуации, где существует необходимость в костнопластических материалах, может быть представлен или несрощенным переломом или значительным дефектом кости, вызванный онкологическим заболеванием, а также другими ситуациями, где для восстановления костной ткани нужны «импланта-ты». Выбор оптимально удобного материала с точки зрения хирурга для возмещения костного дефекта всегда представляет для последнего определенные трудности. Известно, что современные костнопластические материалы должны быть безопасными, где возможность переноса инфекций материалом полностью исключена. Они должны обеспечивать опорную и структурообразующую функцию в области поврежденной костной ткани, обладать остео-индуктивностью и биологической совместимостью, быть биодеградируемы-ми и не вызывать у реципиентов воспалительных и иммунологических реакций. К сожалению, большинство используемых в России материалов в реконструктивной хирургии не отвечают в полной мере всем вышеперечисленным требованиям.
Известно, что в процессе остеогенеза принимают активное участие основные компоненты межклеточного матрикса такие, как протеогликаны, гли-копротеины и коллаген, а также костные морфогенетические белки и факторы роста. Протеогликаны представляют собой белки, в состав которых входят сложные полисахариды, главным образом сульфатированные гликозами-ногликаны (сГАГ). В кости сГАГ представлены хондроитин-, дерматан- и ке-ратансульфатами, именно они и определяют основные функциональные характеристики костных протеогликанов. В ряде работ было показано, что сГАГ способны модулировать обмен клеток соединительной ткани и влиять на их дифференцировку (Серов В.В., Шехтер А.Б. 1981; Панасюк А.Ф. с со авт. 2000). В научной литературе существуют единичные сообщения о влиянии сГАГ на репарацию костной ткани (Burger М. et al. 1962) при этом их роль в процессах её восстановления остается недостаточно изученной. Учитывая теоретическую обоснованность включения сГАГ в биокомпозиционные материалы и хорошие результаты использования подобных материалов в челюстно-лицевой хирургии, мы были вправе ожидать от «Остеоматрикса» подобных результатов в травматологии и ортопедии. В данной работе были рассмотрены возможность, эффективность и целесообразность использования сульфатированных гликозаминогликанов в составе биокомпозиционного материала, предназначенного для полноценного (органотипического) восстановления поврежденной опорной костной ткани. С этой целью были сделаны предварительные экспериментальные исследования.
Для исследования свойств сульфатированных гликозаминогликанов, выделенных в соответствие с патентом РФ № 2162331, в клеточных культурах стромальных клеток костного мозга мы использовали культуры стро-мальных клеток костного мозга с эксплантационной плотностью 5x105 ядерных клеток костного мозга по 4 флакона в каждой серии.
Проводили 3 серии исследований сГАГ в клеточных культурах. В культуральные флаконы с клеточной культурой с 10 мл ростовой среды добавляли сГАГ с конечной концентрацией (с учетом количества среды) 50 мкг/мл - 1 серия опытов, 250 мкг/мл — 2 серия, 500 мкг/мл — 3 серия. Каждая серия опытов включала по 4 флакона клеточных культур. В контрольной группе во флаконы с клеточной культурой раствор сГАГ не добавляли. Культивирование проводили в течение 7 дней.
Клетки из 3 флаконов из каждой серии опытов на 7 день культивирования снимали трипсином и подсчитывали количество клеток во флаконе в камере Горяева. По одному флакону клеточных культур из каждой серии опытов на 7 день культивирования фиксировали и окрашивали по методу Гимза-Романовскому для морфологического исследования клеточных культур. Одновременно была проведена оценка возможной цитотоксичности растворов сульфатированных гликозаминогликанов и пролиферативной активности образцов. Для фотометрической оценки пролиферации и гибели клеток в культуре использовали МТТ-тест. МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил-тетразолий бромид) восстанавливается в митохондриях живых клеток под действием сукцинатдегидрогеназы до водонерастворимого тем-ноокрашенного формазана. Формазан был элюирован из клеток с помощью ДМСО. Определено, что оптическая плотность элюатов при длине волны 570 нм (максимум поглощения формазана) пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце.
Результаты проведенных исследований с использованием культураль-ных сред показали отсутствие какого-либо стимулирующего влияния растворов сГАГ на скорость деления стромальных клеток костного мозга барана не зависимо от концентрации растворов сульфатированных гликозаминогликанов (50 мкг/мл, 250 мкг/мл и 500 мкг/мл). Между тем, очевидно, что сульфа-тированные гликозаминогликаны, выделенные в соответствие с патентом РФ № 2162331, не обладают цитотоксичностью, что, в свою очередь, не препятствует их использованию в клинической практике.
Образование или отсутствие элементов костной ткани в области помещения какого-либо материала в мягкие ткани является общепризнанным тестом на выявление остеоиндуктивных свойств исследуемых материалов — это, так называемая модель гетеропической имплантации. Для оценки эффекта остеоиндуктивности исследуемого материала 20 половозрелым крысам породы «Вистар» внутримышечно поместили коллагеновые блоки с сГАГ, кон-центрацией 700 мкг/см . Блоки состояли из костного коллагена, полученного из губчатого слоя аллогенной костной ткани размером 3x3 мм. Контролем служили аналогичные образцы костного коллагена без сГАГ. Срок эксперимента составил 1 месяц.
![Влияние факторов роста и биоантиоксиданта тиофана на репаративную регенерацию костной ткани в эксперименте [Электронный ресурс]](/i/i/4300/186913.png "Влияние факторов роста и биоантиоксиданта тиофана на репаративную регенерацию костной ткани в эксперименте [Электронный ресурс] Жуков Дмитрий Викторович")
![Регенерация костной ткани при холодовой травме в условиях лечения изотоирбамином [Электронный ресурс]](/i/i/4301/177944.png "Регенерация костной ткани при холодовой травме в условиях лечения изотоирбамином [Электронный ресурс] Киреев Андрей Александрович")
