Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о «перекрестном сшивании» (кросс- линкинг) коллагена роговицы
1.2. Клиническое применение «кросс-линкинга» 28
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 36
2.1. Характеристика клинического материала работы 36
2.2. Характеристика экспериментального материала работы 37
2.3. Офтальмологические методы обследования 38
2.4. Специальные методы исследования 38
2.5. Гистологические методы исследований 42
2.5.1. Трансмиссионная электронная микроскопия 43
2.6. Статистические методы обработки результатов 44
2.7. Условия проведения процедуры формирования «сшивок» коллагена роговицы
2.7.1. Условия проведения ФДТ в клинике 45
2.7.2. Условия проведения ФДТ в эксперименте 45
2.7.3. Характеристика фотосенсибилизатора «Водный раствор рибофлавина 0,1%»
2.7.4. Характеристика фотосенсибилизатора «Раствор рибофлавина на декстране 0,1%»
2.7.5. Теоретическое обоснование применения препарата фталоцианинового ряда «Фотосенс» в качестве фотосенсибилизтора при проведении процедуры «кросс-линкинг»
2.7.6. Характеристика фотосенсибилизатора «Фотосенс» з
ГЛАВА 3.1. Клинические результаты проведения процедуры «кросс-линкинг».
ГЛАВА 4.1. Изучение морфологической картины изменения роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами .
ГЛАВА 5.1. Оценка прижизненных морфологических изменений роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с помощью метода конфокальной микроскопии .
ГЛАВА 6.1. Оценка оптической плотности роговицы после 90
проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами
ГЛАВА 7.1. Исследование биомеханических свойств роговицы кролика после проведения процедуры «кросс-линкинг» с применением различных фотосенсибилизаторов.
Заключение 98
Выводы 104
Список литературы
- Клиническое применение «кросс-линкинга»
- Характеристика экспериментального материала работы
- Условия проведения процедуры формирования «сшивок» коллагена роговицы
- Изучение морфологической картины изменения роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами
Клиническое применение «кросс-линкинга»
В последние годы, в процессе инновационных разработок в области биофизики, биохимии и медицины, появился новый метод лечения эктатических заболеваний роговицы, в основе которого лежит фотодинамический эффект, приводящий к «перекрестной сшивке» - кросс-линкингу (cross-linking) коллагена и «уплотнению» или увеличению прочности роговицы.
Фото динамический эффект был открыт в 1897 г. студентом фармакологического факультета Мюнхенского университета Оскаром Раабом. Первое сообщение об этом явлении сделал профессор Н. Tappiner в 1904 г. Он же официально ввел термин «фотодинамическое действие» для обозначения реакций фотосинтеза в биологии [149]. Суть открытия заключалась в обнаружении у клеток свойства селективно накапливать и удерживать некоторые окрашенные вещества, как находящиеся в организме носителя (эндогенные фотосенсибилизаторы), так и поступающие в него извне (экзогенные фотосенсибилизаторы). При облучении сенсибилизированной ткани лазерным или нелазерным источником света с длиной волны, соответствующей спектру поглощения ФС, в ней происходят следующие процессы: молекула ФС, поглотив квант излучения, переходит в возбужденное триплетное состояние и затем вступает в фотохимические реакции [154]. Для реализации фото динамического эффекта необходимо сочетание фотохимиотерапевтического и физического методов воздействия. Отдельно взятые фотосенсибилизатор или низкоэнергетическое лазерное облучение практически не приводят к необходимому эффекту [113]. ФДТ на нынешнем этапе - способ лечения с помощью химиотерапевтического агента (ФС), инициирующийся благодаря облучению патологического очага светом, длина волны которого соответствует пику поглощения данного ФС. Свет необходим для реализации фотохимического и/или цитотоксического потенциала ФС. При этом ФС представляет собой лекарственный препарат, обладающий тропизмом к быстро размножающимся клеткам. Таким образом, ФДТ даже не двухкомпонентный, а скорее трехкомпонентный метод лечения, где два компонента - ФС и свет являются экзогенными внешними факторами, а третьим обязательным компонентом фотодинамической реакции является эндогенный фактор - кислород [117; 144].
Свет в ФДТ выполняет функции точной доставки адресату -патологическому очагу - источника энергии фотобиохимической реакции, приводящей к образованию в нем цитотоксических агентов (активных форм кислорода). Кроме этого, при химиотерапии с использованием фотоактивируемых лекарственных агентов свет обеспечивает высвобождение лекарственного препарата, переводя его в биологически активную форму [74].
Для понимания механизмов «кросс-линкинга» рассмотрим также строение основного субстрата - стромы роговицы.
Морфологически строма представлена параллельно расположенными пластинками из коллагеновых фибрилл и составляет приблизительно 90% толщины роговицы. Передние отделы стромы содержат более тонкие и «рыхло» расположенные пластины, задняя строма более компактна и структурна. [92; 102; 114] Количество клеток в строме невелико, кератоциты рассеяны главным образом между пластинами. Нервные волокна и связанные с ними шванновские клетки располагаются в передней и средней третях стромы. Коллаген составляет примерно 71% сухого веса роговицы и является структурообразующей макромолекулой, обеспечивающей основные функции роговицы: оптическую прозрачность и механическую устойчивость. [53; 64; 73; 77; 93; 103]
Молекула коллагена имеет молекулярную массу около 300 тысяч, длину 300 нм и толщину 1,5 нм. Стержневидная структура состоит из трех а-цепей, формирующих правозакрученную тройную спираль таким образом, что один виток спирали а-цепи содержит три аминокислотных остатка. Три а-цепи в свою очередь объединяются в структуру, слегка закрученную в правую спираль. Каждая а-цепь характеризуется высоким содержанием глицина, низким содержанием серосодержащих аминокислот и отсутствием триптофана. Коллаген - один из немногих животных белков, содержащих остатки 3- и 4-гидроксипролина (НО—Pro), а также 5-гидроксилизина (НО— Lys); на них приходится около 21% от всех аминокислотных остатков. Уникальная особенность коллагена - многократно повторяющаяся последовательность в а-цепях триплетов аминокислот глицин—X—Y (X, Y -остаток любой а-аминокислоты, кроме глицина), создающая основу для спирализации а-цепей. Таким образом, коллаген это гликопротеин в зависимости от источника, содержащий на 1000 аминокислотных остатков от 2 до 80 углеводных остатков (в основном в виде моно- или дисахаридов), связанных О-гликозидной связью с НО-группой НО—Lys. Моносахариды представлены D-галактозой, которая связана с остатком аминокислоты Ь-гликозидной связью. В дисахаридах D-глюкоза связана а-1:2 - связью с D-галактозой. Стабилизация молекулы коллагена осуществляется благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям, а также водородными и ковалентными поперечными связями между а-цепями. Водородные связи образованы карбонильной группой и группами NH пептидной связи или НО -группой НО—Pro; возможны также связи с участием Н20. Ковалентные связи между а-цепями (естественные сшивки) образуются в результате альдольной конденсации остатков 2-амино-6-оксогексановой или 2-амино-5-гидрокси-6-оксогексановой кислоты, которые образуются из остатков лизина или 5-гидроксилизина. Сшивки а-цепей соседних молекул коллагена осуществляются в результате образования альдиминов путем взаимодействия остатков 6-оксогексановых кислот с группой NH2 лизина или 5-гидроксилизина. В коллагене обнаружены поперечные естественные сшивки, связывающие 3 или 4 а-цепи соседних молекул. [60; 66; 72; 96]
Характеристика экспериментального материала работы
Все пластинки были помещены в воду и нагревались от 60 до 90 С, причем температура поднималась на 1 градус каждую минуту. Для определения сморщивания каждые 20 секунд определяли длину пластинок, используя микрометр «Feinmesszeugfabrik Suhl». Характер сморщивания в разных группах оказался следующим: В группе 1а сморщивание началось при 67.5 С и оказалось максимальным при 75.0 ± 1.2 С. В группе 16 сморщивание началось при 63 С и было максимальным при 71.2 ± 0.8 С. Во 2-й группе сморщивание началось при 77.5 С и было максимальным при 89.7 ±1.7 С. В 3-й группе сморщивание началось при 62.5 С и было максимальным при 70.3 ± 0.9 С. После термической обработки препараты, подвергшиеся кросс-линкингу, приняли «грибовидную» форму при температуре 70 С. А препараты передней и задней части стромы приняли цилиндрическую форму при температуре 75 С. В процессе термической обработки строма потеряла свою прозрачность, а максимальное сморщивание привело к увеличению толщины верхних слоев. Гистологическое исследование препаратов «грибовидной» формы показало чёткое различие между сморщенной, передней частью роговицы, в которой произошел кросс-линкинг с сохранением двойного лучепреломления волокон коллагена и задней, сморщенной частью с гомогенезированными денатурированными волокнами коллагена и потерей их двунаправленности.
Тепловое сморщивание коллагена было вызвано денатурацией и раскручиванием тройной спирали, в связи с чем и происходит потеря двунаправленности волокон коллагена. При нагревании волокон до критической температуры коллагеновые волокна переходят из состояния высокоорганизованных, частично-кристалических (полупрозрачных) в состояние расплавленного геля с беспорядочно расположенными полипептидными цепями. Иногда последний процесс называют геалинизацией, в процессе которого происходит разрыв ковалентных связей между молекулами коллагена. Степень сморщивания также зависит от типа коллагена и содержания в нём гидроксипролина и пролина, являющегося относительно низким для коллагена роговицы I типа. [69; 146]
Различие в степени выраженности поперечного соединения коллагенового волокна было обусловлено быстрой потерей ультрафиолетового излучения при прохождении через роговицу, т.к. большая его часть поглощается фотосенсибилизатором (рибофлавином). Меньший эффект «сшивки» коллагена в задних слоях стромы роговицы выгоден с точки зрения клинического использования, поскольку эндотелий должен быть защищен от ультрафиолетового излучения. Задняя часть стромы роговицы более важна для обеспечения оптических свойств роговицы. Таким образом, проведенное исследование наглядно продемонстрировало наличие «сшивки» коллагена в задних слоях роговицы. Ограничение «сшивок» в задних слоях стромы и эндотелии оказалось клинически благоприятным, т.к повышение жёсткости происходит в передних слоях роговицы, которые являются наиболее важными для стабилизации эктатических поражений. [120; 123; 138; 146]
Подробное изучение биомеханических изменений после проведения кросс-линкинга роговицы в эксперименте провели Gregor Wollensak, Eberhard Spoerl, Theo Seiler. На донорской роговице человека и свиньи проведено сравнительное исследование изменения биомеханических параметров после проведения кросс-линкинга.
В первой группе роговицу человека разрезали на 2 равные полосы, 4 мм шириной, 14 мм длиной, включая по 1 мм склеры с обеих сторон, толщина роговицы была 550 нм. Во второй группе из каждого диска роговицы свиньи были вырезаны полоски толщиной 5 мм, 14 мм длинной, включая по 1 мм склеры с обеих сторон, толщина роговицы 850 нм. В двух группах после механического удаления эпителия 10 препаратов были обработаны следующим образом: с интервалом в 5 минут на роговицу инсталлировали раствор фотосенсибилизатора (10 мг Рибофлавина-5-фосфата, разведённого в 10 мл 20% декстрана-Т-500). Остальные, контрольные, образцы были подвергнуты обработке 20% раствором декстрана. После этого все образцы облучали при помощи специально смоделировано двойного диода ультрафиолетовым светом А спектра с длиной волны 370 нм и плотностью излучения 3 mW/cm2 в течение 30 минут на расстоянии 1 см (что было эквивалентно световой дозе 5.4 J/cm2). Экспоненциальные параметры облучения были такими же, какие используют в клинике для остановки процесса прогрессирования кератоконуса. [156] После этого роговичные полосы были закреплены в контролируемом микрокомпьютером тестере при помощи зажимов в горизонтальной плоскости на расстоянии 8 мм. Для учёта диапазона физиологической нагрузки, была выставлена начальная нагрузка в 5x103 Ра (1 Ра =1 N/m2), из-за разницы в толщине для человеческой роговицы требовалась сила 10 mN и 20 mN - для роговицы свиньи. Нагрузку увеличивали линейно с частотой вращения 1.5 mm mine1. Нагрузка выросла до 2x105 Ра. Значение нагрузки-растяжения было установлено по экспоненциальной функции а =А ехр (В х є) при помощи статистической программы SPSS (SPSS GmbH Software, Munich). Модуль Юнга (E) был подсчитан для 4 %, 6 % и 8 % растяжения как градиент графика нагрузки-растяжения (E=da/ds = А х В ехр (В х є). Сравнили показатели нагрузки необходимые для растяжения на 4 %, 6 % и 8 % обработанных и необработанных полос (отдельно человеческих и свиных глаз).
Условия проведения процедуры формирования «сшивок» коллагена роговицы
В Зй группе по сравнению с первыми двумя, строма роговицы отличается выраженной гиперцеллюлярностью с некоторым преобладанием плотности кератоцитов в поверхностной строме (рис. 21). Кроме того, в поверхностной строме отмечается пролиферативная активность кератоцитов, наличие поперечной исчерченности и более компактное расположение стромальных пластин (рис. 22). Отмеченная фиброплазия в поверхностной строме способствует механическому укреплению каркасных структур роговицы, что, однако, может привести к временному снижению прозрачности роговицы. Это естественный путь встраивания новых клеточных элементов в сохранившийся коллагеновый матрикс. Поперечно расположенные линейные структуры, возможно, являются утолщением поперечных связей, существующих в норме коллагеновых пластин.
Зя группа. Срок наблюдения 1 месяц. Повышенная плотность клеток переднего эпителия и всей стромы, особенно поверхностных ее слоев. Десцеметова оболочка и задний эпителий не изменены. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.х Зя группа. Срок наблюдения 1 месяц. Выраженная поперечная исчерченность (), компактное расположение стромальных пластин, пролиферативная активность кератоцитов в поверхностных соях. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.х 250.
Таким образом, в основных группах через 24 часа после проведения процедуры «кросс-линкинг» наблюдали реактивные изменения в виде межпластинчатого отека стромы, более выраженного в случае применения водного раствора рибофлавина и препарата «Фотосенс» (1й и Зй группах). При этом практически не визуализировались кератоциты вследствие вакуолизации их цитоплазмы и дисперсии ядерного хроматина.
Через 1 неделю в 1й и 2й группах в результате атрофии части кератоцитов отмечали уменьшение их плотности главным образом в поверхностных слоях стромы, тогда как в Зй группе было выявлено незначительное повышение плотности кератоцитов. Смежные коллагеновые пластины сближались между собой, одновременно сохраняя взаимопараллельное пространственное расположение. В задней строме роговицы плотность кератоцитов оставалась в пределах нормы. Через 1 месяц в 1 и 2 группах отмечали в субэпителиальной строме повышение плотности пролиферирующих кератоцитов с гиперхромными ядрами и проминирующими ядрышками. В 3 группе, по сравнению с первыми двумя, вся строма в целом отличалась выраженной гиперцеллюлярностью с некоторым преобладанием плотности кератоцитов в поверхностной строме. Задний эпителий сохранял свое обычное строение и плотность. Смежные коллагеновые пластины при этом плотно прилегали друг к другу, обнаруживая неравномерную поперечную исчерченность за счет проминирования вертикальных межпластинчатых связей. Все это придавало строме более компактное строение. Отмеченная фиброплазия в поверхностной строме способствует механическому укреплению каркасных структур роговицы, что, однако, может привести к временному снижению прозрачности роговицы. Это естественный путь встраивания новых клеточных элементов в сохранившийся коллагеновый матрикс.
В контрольных группах (4-7) подобных изменений отмечено не было. Глава 5.1. Оценка прижизненных морфологических изменений роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с помощью метода конфокальной микроскопии
Для изучения структуры роговицы кролика в норме исследованию в первую очередь подвергли 5 здоровых кроликов.
Роговичный эпителий состоит из 5-6 слоев и трех разных видов клеток: поверхностные плоские (2-3 слоя), шиповидные (крылатые) (2-3) слоя, цилиндрические базальные (1 слой). Цилиндрические базальные клетки обладают митотической активностью. Средняя толщина всего эпителия приблизительно 50 мкм.
Поверхностный слой эпителия представлен полигональными клетками, обычно с четким ядром, четкими границами и гомогенной плотностью. Ядра обычно ярче, чем окружающая их цитоплазма, также можно различить перинуклеарное темное кольцо (рис. 23).
Норма. В фокусе поверхностные полигональные клетки роговичного эпителия (). Конфокальная микроскопия Базальные клетки - вытянутые, полигональные на поперечном срезе, с очень четкими яркими границами. Крылатые клетки обладают переходными характеристиками, ядра могут быть нечеткими или могут не определяться.
Типичная конфокальная микроскопическая картина стромы включает несколько ярких неправильной овальной формы тел, которые являются ядрами кератоцитов и лежат в толще прозрачного (темно-серого или черного) бесклеточного матрикса. В данной контрольной группе отсутствуют патологические изменения стромы, поэтому визуализация внеклеточных структур невозможна изза их прозрачности.
Конфокальная микроскопия. Передние слои стромы в норме Строма может быть условно разделена на субслои: передний (непосредственно под боуменовой мембраной), переднесредний, средний и задний. Средняя плотность кератоцитов выше в передней строме, их количество уменьшается по направлению к задним слоям. В передней строме ядра кератоцитов имеют округлую бобовидную форму (рис. 24), в задней строме - овальную (рис. 25). В ряде случаев кератоциты имеют различную яркость. Различие в рефлективности зависит от их метаболического состояния, поэтому их называют активированными кератоцитами.
Изучение морфологической картины изменения роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами
Помимо этого, в Зй группе имеет место более выраженная целлюлярность при таком же плотном расположении волокон коллагена, что ив 1й и во 2й группах. Это может иметь положительный эффект, так как гистологическое исследование дисков роговицы, удаленных во время операции кератопластики у пациентов, ранее подвергшихся лечению методом «кросс-линкинг» показало явное снижение плотности кератоцитов в передних слоях стромы в различные сроки после проведения процедуры.
Изучение оптической плотности показало, что применение всех фотосенсибилизаторов в сочетании с УФ-облучением привело к увеличению оптической плотности роговицы через 1 неделю после процедуры с дальнейшим уменьшением денситометрических показателей через 1 месяц после процедуры. Предположительно, это может быть связано с развитием отека роговицы во время манипуляции и его дальнейшим регрессом. В меньшей степени это явление проявилось при инстилляции раствора рибофлавина на декстране, в большей степени - фотосенса. Это может быть обусловлено тем, что в третьей группе наблюдали высокую плотность кератоцитов, которая привела к более выраженному помутнению роговицы. Однако это временный эффект, так как является естественным путем встраивания новых клеточных элементов в сохранившийся коллагеновый матрикс.
В результате исследований биомеханических свойств роговицы с помощью анализатора биомеханических свойств роговицы, как в основных, так и в контрольных группах не было выявлено статистически значимой разницы между показателями, полученными до и через 1 месяц после проведения процедуры. Эти данные согласуются с теми, что получены при изучении изменения биомеханических свойств роговицы у пациентов с кератоконусом, перенесших процедуру «кросс-линкинг».
Таким образом, повышение до субмолекулярного уровня избирательности фотодинамического воздействия на коллагеновый матрикс стромы роговицы с применением нового фотосенсибилизатора может привести к повышению эффективности метода «кросс-линкинг».
1. Впервые на достаточном клиническом (104 глаза с прогрессирующим кератоконусом) и экспериментальном (144 глаза кроликов породы Шиншилла, самцы массой 2-3 кг) материале была исследована эффективность процедуры «кросс-линкинг» коллагена роговицы с различными фотосенсибилизаторами.
2. Клиническое исследование на основании данных визометрии, офтальмометрии, пахиметрии, кератотопографии, а также анализа биомеханических свойств роговицы в группе пациентов с прогрессирующим кератоконусом выявило стабилизацию процесса после стандартной процедуры «кросс-линкинг» в 97 % случаев, тогда как в 3 % случаев была отмечена отрицательная динамика изменений параметров роговицы через 2 года после вмешательства. Во всех случаях наблюдения на парных глазах было отмечено ухудшение состояния кератоконуса.
3. Впервые теоретически обосновано применение препарата фталоцианинового ряда («Фотосенс») в качестве фотосенсибилизатора для процедуры «кросс-линкинг». В эксперименте изучены изменения структуры роговицы при использовании таких фотосенсибилизаторов как водный раствор рибофлавина, раствор рибофлавина на декстране и «Фотосенс» (основные группы наблюдения).
4. По данным морфологического исследования показано, что при использовании в качестве фотосенсибилизатора препарата из группы фталоцианинов («Фотосенс») отмечали большее количество кератоцитов в передних и средних слоях стромы по сравнению с группами, где применяли водный раствор рибофлавина или раствор рибофлавина на декстране через 1 месяц после процедуры. Тогда как отличий в увеличении плотности и компактности коллагеновых волокон по своей морфологической картине в основных исследуемых группах выявлено не было.
5. При конфокальной микроскопии в роговице кролика через 1 месяц после процедуры «кросс-линкинг» обнаружено большое количество «активированных» кератоцитов, находящихся в стадии пролиферации. Увеличение гиперрефлективности было особенно выраженным в группе, где в качестве фотосенсибилизатора использовали «Фотосенс».
6. Исследование оптической плотности роговицы кролика через 1 неделю после проведения процедуры «кросс-линкинг» показало статистически значимое увеличение денситометрических показателей в основных группах, где в качестве фотосенсибилизатора применяли водный раствор рибофлавина, рибофлавина на декстране и раствор «Фотосенс» (в среднем до 40,2±4,5%, 37,1±3,8%, 43,2±4,1% (р 0,1) соответственно), и снижение уровня этих показателей через 1 месяц после процедуры, который при этом оставался выше дооперационных значений.
7. Исследование биомеханических свойств роговицы кролика, как в основных группах, где применяли изучаемые фотосенсибилизаторы по стандартной технологии, так и в контрольных группах не выявило статистически значимой разницы между показателями, полученными до и через 1 месяц после проведения процедуры.
