Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материалы и методы исследования 16
1.1. Препарат флавоноидов корней солодки 17
1.2. Лабораторные животные 25
1.3. Клетки периферической крови человека 26
1.4. Клетки лимфоидных органов мышей 27
1.5. Клетки бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей 30
1.6. Клетки опухолевых культур и штаммов 30
1.7. Бактериальные штаммы 33
1.8. Методы оценки ростовых характеристик клеток in vitro 34
1.9. Методы оценки функциональной активности иммунокомпе-тентных клеток in vitro 40
1.10. Моделирование иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности на экспериментальных животных 46
1.11. Модели для оценки функциональной активности клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vivo 50
1.12. Моделирование злокачественного новообразования на экспериментальных животных 51
1.13. Статистическая обработка результатов 54
Глава 2. Влияние флавоноидов корней солодки на активность лимфоцитов при индукции адаптивного иммунного ответа IN VITRO 5 5
2.1. Флавоноиды - полифенолы растительного происхождения, обладающие фармакологической активностью 55
2.2. Современные представления об адаптивном иммунном ответе и влиянии на него полифенольных соединений 59
2.3. Изучение влияния ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) митоген-активированных мононуклеарных клеток in vitro 68
2.4. Влияния ФКС на секрецию цитокинов митоген-активирован-ными мононуклеарами как показатель функциональной активности и популяционной дифференцировки лимфоцитов
Глава 3. Изучение механизмов иммуносупрессив ного действия флавоноидов корней солодки в модели иммунопатологического процесса in vivo 82
3.1. Реакция контактной чувствительности - модель иммунопатологического процесса Т-клеточной направленности 82
3.2. Влияние ФКС на развитие отека уха у мышей в модели контактной чувствительности, индуцированной ДНФБ 85
3.3. Изучение механизмов ингибирования ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности препаратом ФКС 88
Глава 4. Изучение эффективности флавоноидов корней солодки в моделях иммунопатологических процессов т- и в-клеточной направленно сти in vivo 111
4.1. Изучение эффективности ФКС в экспериментальной терапии реакции трансплантат против хозяина у мышей 111
4.2. Изучение эффективности ФКС в модели респираторной аллергии, индуцированной овальбумином у мышей 117
Глава 5. Изучение влияния флавоноидов корней солодки на некоторые функциональные пока затели клеток-эффекторов врожденного иммунитета в моделях in vitro и in vivo 133
5.1. Влияние ФКС на способность нейтрофилов и моноцитов/макрофагов к активации и хемотаксису 140
5.2. Влияние ФКС на поглотительную способность нейтрофилов и моноцитов/макрофагов 150
5.3. Влияние ФКС на продукцию активных форм кислорода фагоцитами и их бактерицидную функцию 152
5.4. Влияние ФКС на течение экспериментального острого бактериального воспаления органов брюшной полости 156
Глава 6. Изучение противоопухолевых эффектов флавоноидов корней солодки 166
6.1. Влияние ФКС на пролиферацию опухолевых клеток различной видовой и гистологической принадлежности in vitro 175
6.2. Исследование механизмов антипролиферативного противоопухолевого эффекта ФКС 178
6.3. Изучение противоопухолевого эффекта ФКС в модели in vivo 184
Глава 7. Хроматографическое разделение и сравнительная оценка фармакодинамических эффектов фракций препарата флавоноидов корней солодки 191
7.1. Хроматографический анализ и фракционирование ФКС 191
7.2. Сравнительная оценка фармакологических эффектов фракций суммы флавоноидов корней солодки 194
Глава 8. Заключение 202
Выводы 214
Список литературы
- Клетки бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей
- Современные представления об адаптивном иммунном ответе и влиянии на него полифенольных соединений
- Влияние ФКС на развитие отека уха у мышей в модели контактной чувствительности, индуцированной ДНФБ
- Исследование механизмов антипролиферативного противоопухолевого эффекта ФКС
Введение к работе
Актуальность проблемы
За последние десятилетия в медицине произошел переход исследований на молекулярный уровень, и появились более детальные сведения о патогенезе многих заболеваний, существенно изменившие представления о фармакотерапевтических подходах к их лечению [Козлов И.Г., 2006]. Важнейшим достижением этого этапа исследований стало выявление молекул, которые играют ведущую роль в возникновении или прогрессировании патологического процесса. Это сформировало концепцию мишень-направленной терапии и обосновало актуальность разработки инновационных «таргетных» препаратов, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза.
В связи с завершением интенсивных исследований в биотехнологии и иммунологии, а также молекулярной биологии и генетике рака, во второй половине XX века были разработаны и внедрены принципиально новые иммуносупрессанты и противоопухолевые препараты. Примерами таковых лекарственных средств являются моноклональных антитела и низкомолекулярные ингибиторы сигнальных молекул (циклоспорин, макролидные антибиотики, «тинибы») [Кренски А. с соавт., 2006]. Механизмы действия таких лекарственных средств основаны не на неспецифическом уничтожении активно пролиферирующих клеток, а целенаправленной элиминации/угнетении опухолевых или иммунокомпетентных клеток идентичной природы.
Перспективы развития данных областей фармакотерапии тесно связаны с открытием более специфичных мишеней. Так, несомненно, актуальным является изыскание высоко избирательных иммуносупрессантов, не оказывающих влияния на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препаратов. Мишенью для этой подгруппы может являться запущенный в активированных лимфоцитах конкретный регуляторный или эффекторный механизм [Козлов И.Г., 2006]. Идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. На место подобных иммуносупрессантов на сегодняшний день претендуют так называемые «регуляторы/переключатели» иммунного ответа.
Безусловно, «таргетные» лекарственные средства кардинально изменили стратегию фармакотерапии, продемонстрировав высочайшую эффективность в отношении отдельных заболеваний (например, некоторых онкогематологических). Однако довольно часто эффект такого препарата оказывается ниже ожидаемого, а резистентность к нему развивается так же, как и при стандартной терапии. Таким образом, в большинстве случаев современные средства служат лишь дополнением к стандартным схемам лечения, в которых классические «нетаргетные» противоопухолевые и иммуносупрессивные препараты все еще занимают лидирующее положение.
С точки зрения разработки новых лекарственных препаратов, большой интерес представляет класс полифенольных соединений растительного происхождения, поскольку многие флавоноиды демонстрируют разнообразные биологические эффекты на организменном уровне [Donfack J.H. et al., 2010; . et al., 2009; Lu J. et al., 2011; . et al., 2011]. Изучение их механизмов действия на клеточном и молекулярном уровнях показывает, что некоторые флавоноиды способны селективно влиять на активность протеинкиназ [Atluru D. et al., 1991; Akiyama T. et al., 1987; Trevillyan J.M. et al., 1990], а, как следствие, и на активацию сигнальных путей в клетках млекопитающих [. et al., 2004; Funakoshi-Tago M. et al., 2008; Hirao K. et al., 2010]. На наш взгляд, на этом механизме действия может базироваться не только противоопухолевый, но и селективный иммуносупрессивный эффекты флавоноидов. Это требует экспериментального обоснования возможности применения полифенольных соединений в клинической иммунологии и онкологии. В связи с чем представляется актуальным исследования иммунотропной и противоопухолевой эффективности веществ флавоноидной структуры, а также прицельное изучение селективности их влияния на различные звенья (адаптивное и врожденное) иммунной системы.
Цель и задачи
Цель: экспериментальное обоснование перспективы создания новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств на основе соединений флавоноидной структуры, выделенных из экстракта корней солодки.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Отработать технологию выделения и стандартизации биологически активной фракции флавоноидов корней солодки (ФКС).
-
Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) и функциональную активность (продукция цитокинов) клеток адаптивного иммунитета в моделях активации T- и B-лимфоцитов in vitro.
-
Исследовать фармакологическую эффективность ФКС в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности (контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ); реакции трансплантат против хозяина; овальбумин-индуцированной бронхиальной астме).
-
Изучить молекулярные и клеточные механизмы иммунотропных эффектов ФКС, используя модель ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности у мышей.
-
Оценить влияние ФКС на некоторые функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: экспрессию поверхностных маркеров активации, продукцию активных форм кислорода, а также поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов.
-
Провести оценку влияния ФКС на некоторые показатели врожденного иммунитета in vivo в экспериментальных моделях пептон-индуцированной миграции фагоцитов в брюшную полость и острой стафилококковой инфекции у мышей.
-
Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) клеток различных опухолевых линий и оценить прямую цитотоксичность флавоноидов солодки по отношению к опухолевым клеткам in vitro.
-
Провести оценку эффективности ФКС в моно- и комбинированной с циклофосфамидом экспериментальной терапии в модели перевиваемого лимфолейкоза P388 у мышей.
-
Наметить пути выделения фармакологически активных соединений суммарной фракции ФКС.
Основные положения, выносимые на защиту
-
ФКС подавляют пролиферацию активированных T- и B-лимфоцитов in vitro. Возможными механизмами отмены активации лимфоцитов являются как прямое антипролиферативное действие, так и изменение баланса T-хелперных цитокинов, но не индукция апоптоза.
-
ФКС проявляют иммуносупрессивные эффекты в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности у мышей: ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы.
-
Механизмами иммуносупрессорного действия ФКС in vivo являются: ингибирование пролиферации лимфоцитов; изменение цитокинового баланса, свидетельствующее о «переключении» дифференцировки субпопуляций T-лимфоцитов-хелперов при индукции иммунного ответа; а также непрямая отрицательная регуляция функций зрелых T-лимфоцитов-эффекторов.
-
ФКС практически полностью отменяя активацию клеток адаптивного иммунного ответа, незначимо изменяют функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета: экспрессию активационных маркеров, миграционную, поглотительную и микробицидную функцию фагоцитов.
-
ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в культуре опухолевых клеток различного гистогенеза, а также повышают эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии.
Научная новизна исследования
В работе был отработан и модифицирован метод выделения фармакологически активных полифенольных соединений из экстракта корней солодки. Для повышения репрезентативности исследований многокомпонентного препарата каждую новую серию выделенных флавоноидов в дополнение к общеизвестному фотохимическому методу (цветная реакция с галловой кислотой) предложено стандартизовать в биологической системе (по выраженности угнетения пролиферации опухолевой линии).
Используя стандартизированный препарат флавоноиднов корней солодки, впервые было проведено исследование его фармакодинамических эффектов в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной и противоопухолевой активностью.
Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т- и B-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза. Одним из механизмов антипролиферативного эффекта является модулирующее влияние ФКС на продукцию цитокинов: подавление секреции ИЛ-2 и ИФН, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.
Впервые было показано, что ФКС при парентеральном введении проявляют фармакологическую эффективность в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности у мышей: подавляют характерные проявления ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы.
Впервые было продемонстрировано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации приводит как подавлению пролиферативного ответа, так и к снижению абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФН и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать Th1/Th2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th17-лимфоцитов.
Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсибилизации, обработка флавоноидами солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации T-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам. Впервые установлено, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8+ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки CD4+-популяции (не проявляют свойств эффекторов контактной чувствительности) и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8+-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.
Впервые показано, что внутривенное введение флавоноидов солодки мышам с овальбумин-индуцированной бронхиальной астмой на стадиях сенсибилизации снижает уровень сывороточных антиген-специфических IgE и IgG1, а также изменяет спектр синтезируемых спленоцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, и увеличение продукции ИФН и ИЛ-17). Это может свидетельствовать о способности ФКС переключать Th2 иммунный ответ в процессе сенсибилизации к овальбумину на формирование антагонистичных популяций Th1/Th17-лимфоцитов.
Кроме того, продемонстрировано, что введение препарата ФКС на стадии провокации бронхиальной астмы интрафарингеальным введением овальбумина мышам, приводит к значимому уменьшению воспалительной инфильтрации бронхов и уменьшению эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости.
Комплексная оценка влияния ФКС на функции фагоцитов показала, что при использовании их в концентрации (20 мкг/мл), практически отменяющей пролиферацию активированных T- и B-лимфоцитов, не происходит подавления активации, а также миграционной, поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Наряду с этим внутрибрюшинное введение ФКС повышает резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции. Это позволяет говорить о возможности селективного иммуносупрессивного эффекта ФКС: ингибировании адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета.
С использованием различных опухолевых клеточных культур продемонстрировано, что ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения, а также повышают эффективность алкилирующего цитостатика циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии перевиваемого лимфолейкоза P388 у мышей.
На основании сравнительного химического и фармакологического анализа в ходе разделения суммарного препарата ФКС определена наиболее активная фракция флавоноидов солодки.
Практическая значимость работы
В процессе работы был отработан и модифицирован метод, позволяющий без значительных трудовых затрат, получать биологически активные полифенольные соединения из экстракта корней солодки, а также подобран комплекс моделей и методов, позволяющих оценивать иммунотропную и противоопухолевую активность и эффективность новых фармакологических агентов.
Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа и патогенезе иммунопатологических процессов, а также дополняют сведения о механизмах фармакологического действия биологически активных веществ флавоноидной структуры.
Доказанное в ходе выполнения работы отсутствие прямой цитотоксичности, возможность регуляции иммунного ответа, а также различное влияние препарата ФКС на функции иммунокомпетентных клеток, участвующих в механизмах врожденного и адаптивного звеньев иммунитета открывает возможность селективной фармакологической иммуносупрессии.
Выявленные в исследованиях принципиально новые механизмы иммунотропного и противоопухолевого действия ФКС, низкомолекулярная структура флавоноидов (что определяет возможность их химического синтеза и направленной модификации), а также данные, полученные в ходе анализа отдельных фракций, являются достаточным основанием для рассмотрения флавоноидов корней солодки как перспективной основы для разработки новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ, отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития РФ.
Публикации и апробация работы
Материалы диссертации были представлены на III Съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Казань, 2009); 2nd European Congress of Immunology «Immunity for Life, Immunology for Health» (Берлин, Германия, 2009); III World Asthma and COPD Forum and the World Forum of Pediatrics (Дубаи, ОАЭ, 2010); IV World Asthma and COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011); 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Стамбул, Турция, 2011); 11th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies (Вашингтон, США, 2011); III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011).
Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работы, в том числе статей в изданиях рекомендованных ВАК РФ – 22.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста в виде монографии и состоит из введения, главы, посвященной материалам и методам исследований, а также 6 глав, каждая из которых включает обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение. В конце диссертации представлены заключение, выводы и библиографический указатель, включающий 314 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и содержит 16 таблиц.
Клетки бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей
Основным методом для получения биологически-активных веществ, разделения смесей и очистки индивидуальных соединений из природных источников в настоящее время остается экстракция. Для того чтобы упростить и ускорить выделение флавоноидов, в качестве исходного сырья был использован сухой коммерческий экстракт корней солодки (ООО «Хармс», С.-Петербург).
Схема выделения полифенольных соединений, показанная на рис. 1.1, представляет модифицированный нами метод спиртовой экстракции с последующей очисткой флавоноидов корней солодки (ФКС) с применением адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Polyamide 6; Fluka, Германия) [8, 11, 16]. Принципиальные этапы экстракции и очистки препарата ФКС состояли в следующем:
1. Навеску экстракта корней солодки заливали высокоочищенным 96% этанолом в соотношении 1:10 (масса: объем) и проводили мацерацию экстракта в темноте при комнатной температуре в течение суток.
2. Полученную суспензию дополнительно настаивали на кипящей водяной бане (1 ч), охлаждали до комнатной температуры и процеживали с помощью воронки Бюхнера через двойной бумажный фильтр.
3. Фильтрат упаривали под вакуумом на водяной бане до остатка густой вязкой консистенции, который растворяли добавлением 10% горячего раствора хлорида натрия, продолжая нагревание колбы на водяной бане и растирая осадок стеклянной палочкой. Экстракт корней солодки
4. В целях максимальной очистки от сопутствующих веществ нерастворимые компоненты извлечения отделяли центрифугированием, а су-пернатант после охлаждения количественно помещали на хроматогра-фическую колонку (1,2x25 см), заполненную полиамидным сорбентом.
5. После прохождения через колонку всей жидкости сорбент промывали деионизированной водой в два приема. Полноту очистки извлечения контролировали визуально, а также считывая спектр поглощения элюата в видимом и УФ-диапазоне длин волн. Для элюирования флавоноидов использовали высокоочищенный 96% этанол. Количество наносимого и элюирующего раствора, необходимого для полной десорбции флавоноидов, устанавливали экспериментально. 6. Этанол из элюата отгоняли, полученное извлечение высушивали и перерастворяли в минимальном объеме высокоочищенного 96% этилового спирта.
После растворения ФКС в этаноле получали раствор желтого цвета, который подвергали центрифугированию (lOOOg, 10 мин.) и затем пропускали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм для стерилизации. Готовые матричные растворы разливали в стерильные пластиковые ампулы типа «эппендорф» и хранили при -20С.
К спектральному анализу относят методы определения состава объекта, основанные на изучении спектров его взаимодействия с разными видами излучения. По числу и положению пиков в спектрах поглощения можно судить о природе вещества (качественный анализ), а по интенсивности полос поглощения - о количестве вещества.
Полифенольный состав выделенного препарата ФКС доказывали проведением анализа спектров поглощения образца в ультрафиолетовом (УФ), видимом и инфракрасном (ИК) диапазонах длин волн. Спектры поглощения выделенного препарата ФКС и глицирризиновой кислоты (Sigma, США) в области УФ и видимого диапазона длин волн снимали на спектрофотометре Lightwave П (Biochrom, Великобритания) в кювете с толщиной слоя 1 см. Глицирризиновая кислота относится к тритерпеновым гликозидам, содержание которого в корнях солодки может достигать 20-24% [20]. Это соединение корней солодки обладает рядом доказанных фармакологических активностей, включая иммуномодулирующее действие [100]. ФКС
Как демонстрирует рис. 1.2, глицирризиновая кислота поглощает в УФ-области с пиковым значением 259 нм, тогда как выделенный препарат ФКС не характеризуется такими параметрами поглощения, что является доказательством отсутствия глицирризиновой кислоты в выделенном нами для исследований препарате флавоноидов. Что же касается препарата ФКС, то он также поглощает преимущественно в УФ-области спектра и описывается характерными для фенольных соединений полосами поглощения с максимумами 274 и 316 нм [2, 5, 17].
Дополнительно также записывали ИК-спектры исследуемого препарата ФКС и веществ сравнения в пленке и таблетках с калия бромидом, используя ИК-Фурье спектрометр TENSOR 27 (Bruker, Германия).
В силу высокой информативности ИК-спектроскопия считается важнейшим методом анализа, с помощью которого можно установить строение различных органических веществ с относительно короткими молекулами. Поглощение излучения в ИК-области связывают с колебательными и вращательными переходами в молекулах и дают информацию о наличии конкретных его химических групп: характеристические функциональные группы имеют полосы поглощения, занимающие одинаковое положение в спектрах и имеющие одну и ту же форму [19].
На рис. 1.3. представлен ИК-спектр флавоноидов солодки, который имеет большое число полос поглощения. Сравнение ИК-спектра изучаемого образца со спектрами ряда коммерчески предлагаемых флавоноидов (генистеин (Sigma, США); кверцетин, байкалеин, нарингин, рутин, 7-рутинозид (Россия)) и тритерпеноидом глицирризиновой кислотой показало, что в препарате ФКС имеются полосы поглощения, подтверждающие наличие функциональных групп, характерных именно для флавоноидов (на рис. 1.4 представлены ИК-спектры некоторых веществ сравнения). К таковым относятся характерные для ароматической части флавоноидов полосы поглощения в следующих областях: 3385-2850 см" (фенольные оксигруппы), 1680-1615 см"1 (карбонильная группа у-пирона), 1620-1470 см"1 (скелетные колебания ароматических колец) [22]. Дополнительно можно предполагать наличие в препарате ФКС флавоноидов-гликозидов, о чем свидетельствует наличие полосы поглощения в области 1100-1010 см"1, характеризующей колебания пи-ранозного кольца [22].
Для более детального анализа, а таюке для получения отдельных фракций смеси флавоноидов изучаемого препарата использовался метод обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), широко используемый для разделения соединений, растворимых как в воде, так и в органических растворителях. ВЭЖХ-анализ проводили с использованием хроматографической системы Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) со спектрофотометрическим детектором на диодной мат
Современные представления об адаптивном иммунном ответе и влиянии на него полифенольных соединений
Некоторые исследователи рассуждают о потенциальной возможности использования комбинации флавоноида генистеина с циклоспорином А для воздействия на механизмы пролиферации Т-лимфоцитов, резистентных к этому иммунодепрессанту, производя сравнение иммуносупрессив-ных эффектов генистеина и циклоспорина А в отношении Т-лимфоцитов, стимулированных ФМА и анти-СБ28 моноклональными антителами in vitro [41]. Генистеин подавлял пролиферацию Т-лимоцитов, синтез ИЛ-2, и экспрессию рецепторов ИЛ-2 без проявления цитотоксичности, тогда как циклоспорин А не обладал ингибиторными свойствами в данной модельной системе. Chauhan с соавт., наоборот, показывают возможность уменьшения выраженности иммуносупрессии, индуцированной циклоспорином А у мышей при пероральном приеме другого флавоноид-гликозида, выделенного из Cuminum cyminum [60].
Флавоноид-агликон солодки ликвиритигенин (но не соответствующий ему гликозид ликвиритин) повышал резистентность экспериментальных животных к инфицированию Candida albicans. Увеличение выживаемости мышей наблюдалось при внутрибрюшинном введении препарата и сопровождалось стимуляцией ТЫ-иммунного ответа, в то время как in vitro прямого фунгицидного эффекта не наблюдалось. Эффект ликвиритегинина адоптивно переносился CD4+ лимфоцитами и устранялся при внутривенном введении моноклональных антител к антигену CD4 [165]. В модели колла-ген-индуцированного ревматоидного артрита у крыс другой флавоноид -генистеин, наоборот, снижал выраженность ТЫ-ответа, что коррелировало с угнетением продукции ключевого для ТЫ-клеток цитокина ИФНу и увеличением продукции ключевого для Тп2-клеток ИЛ-4 [284].
Тп2-клетки в основном выступают в качестве клеток-помощников для В-лимфоцитов при гуморальном иммунном ответе; активность Тп2 требуется для полноценной стимуляции В-клеток антигеном. Для эффективной активации В-лимфоцитов также необходимо перекрестное связывание антигеном В-клеточного рецептора (мембранного иммуноглобулина) и/или агрегация этих рецепторов, индуцированная лиган-дами МНС-П, что инициирует сигнал, который сопровождается фосфо-рилированием тирозина [55, 92, 99, 158, 298]. В исследованиях Cambier с соавт. показана способность генистеина ингибировать этот активацион-ный сигнал. Также генистеин ингибировал образование инозитолтри-фосфата в В-лимфоцитах и последующее повышение внутриклеточного Са2+[54]. Эти данные свидетельствуют о том, что некоторые флавоноиды могут влиять и на гуморальный иммунный ответ, а, следовательно, и продукцию иммуноглобулинов плазматическими клетками. Так, например, ресвератрол in vitro проявлял модулирующие свойства: в концентрации 10 цМ ингибировал пролиферацию В-лимфоцитов (не изменяя продукцию IgM и IgG), что сопровождалось экспрессией антиапопто-генного белка Вс1-2, тогда как в меньших концентрациях наблюдалась тенденция к стимуляции пролиферации. Кемпферол обладал слабой ан-типролиферативной активностью, а кверцетин значимо не влиял на пролиферацию и апоптоз В-лимфоцитов [314].
Есть сведения о том, что флавоноиды (апигенин, нарингенин) могут эффективно ингибировать Th2-зависимый иммунный ответ в биологической системе in vivo [129, 171]. В модели аллергической астмы у мышей нарингенин (пероральное использование) подавлял продукцию ключевых цитокинов ТЬ2-ответа CD4+ спленоцитами, не влияя при этом на их пролиферацию [129], также положительный фармакологический ответ апиге-нина сопровождался снижением уровня сывороточного IgE, воспалительной инфильтрации бронхиол и переключением иммунного ответа в направлении дифференцировки ТЫ-лимфоцитов [171]. Местное применение байкалеина (в виде геля) был эффективен в лечении атопического дерматита, индуцированного у мышей аллергеном клеща Dermatophagoides pteronyssinus [308]. Флавоноиды проявляли эффективность в подавлении острой реакции трансплантат против хозяина [216] и моделях аутоиммунных заболеваний, воспроизведенных у лабораторных животных [200, 124, 223]. Например, апигенин был эффективным в терапии экспериментальной модели волчанки мышей, воздействуя на функции различных иммунокомпетентных клеток, участвующих в патогенезе этого заболевания. Этот флавоноид инги-бировал функции антигенпрезентирующих клеток необходимых для активации аутореактивных Т- и В-клеток, подавлял продукцию ИФНу и ИЛ-17, а также продукцию аутоантител к ядерному антигену [140]. По-видимому, в некоторых случаях иммуносупрессивные эффекты флавоноидов могут быть связаны с отрицательной регуляцией иммунного ответа. Так, про-антоцианидины семян винограда (300 мг/кг, многократное преоральное применение) ослабляли проявления коллаген-индуцированного артрита у мышей, что сопровождалось CD4+CD25+Foxp3+ T-reg-лимфоцитов как в тканях суставов, так и в селезенке [223].
В то же время ряд работ свидетельствуют об иммуностимулирующем действии в условиях организма как самих флавоноидов, так и их метаболитов. Так продукт метаболизма флавоноида дайдзеина эквол при пе-роральном использовании у овариэктомированных мышей-самок линии Balb/c, сенсибилизированных овальбумином, повышал уровень сывороточного IgE и продукцию ИЛ-13 овальбумин-стимулированными сплено-цитами [244]. Флавоноидная фракция экстракта A Ichornea cordifolia проявляла адъювантные свойства. Наблюдалась стимуляция пролиферации Т- и В-лимфоцитов и секреции антиген-специфических антител в ответ на иммунизацию овальбумином [213]. В некоторых работах отечественных исследователей утверждается, что под влиянием рутина и его агликона квер-цетина происходит усиление гуморального и клеточного иммунитета, активация реакций гиперчувствительности замедленного типа и «трансплантат против хозяина» [15].
Влияние ФКС на развитие отека уха у мышей в модели контактной чувствительности, индуцированной ДНФБ
Реакция трансплантат против хозяина (РТПХ) представляет собой вариант иммунного ответа, который развивается при трансплантации зрелых иммунокомпетентных клеток (содержащих Т-лимфоциты) в организм толерантного хозяина в условиях, когда между клетками донора и реципиента существуют антигенные различия. В клинических условиях эта реакция является наиболее серьезным фактором, ограничивающим аллогенную пересадку костного мозга, которая используется сегодня в терапии многих заболеваний с выраженным цитопеническим синдромом.
Иммунопатогенез РТПХ связывают с активацией Т-лимфоцитов донора антигенами главного комплекса гистосовместимости (МНС) реципиента, а также с несовпадением пары донор-реципиент по множественным минорным антигенам гистосовместимости. В зависимости от многих факторов, но в первую очередь от степени тканевой несовместимости, РТПХ может протекать в двух клинических формах - острой и хронической. Острая РТПХ обусловлена различиями донора и реципиента по антигенам МНС как I, так и II классов. Возникновение острой РТПХ II-IV стадии - ведущий неблагоприятный прогностический признак, обусловливающий летальность в результате выраженной иммунной цитотоксиче-ской реакции трансплантированных клеток по отношению к тканям хозяина [14, 236]. Кроме того, этот побочный эффект противостоит нормальному восстановлению кроветворения и требует иммуносупрессивной терапии, что значительно повышает риск присоединения инфекции, а значит и количества летальных исходов. До настоящего времени нет доста точно эффективных протоколов лечения РТПХ, особенно резистентной к стероидным препаратам.
С учетом того, что в предыдущих экспериментах было выявлено, что ФКС супрессирует СБ8+-зависимый иммунный ответ в модели контактной чувствительности к 2,4-динитрофторбензолу, было решено также исследовать эффективность ФКС в экспериментальной модели острой РТПХ, где главным пусковым механизмом иммунопатогенеза является активация цито-токсических Т-лимфоцитов, направленных против аллоантигенов [66, 274].
Общепринятым подходами для воспроизведения РТПХ у экспериментальных животных являются введение лимфоцитов родительской линии гибридам F1 или перенос лимфоцитов аллогенному реципиенту с подавленным иммунитетом. В первом случае реципиент не отторгает пересаженные ему клетки, так как они не содержат чужеродных антигенов, но клетки трансплантата распознают и отвечают на антигены в комплексе с МНС, унаследованные от второго родителя.
В условиях нашего эксперимента РТПХ индуцировали в полуалло-генной системе. Для этого у мышей-доноров родительской линии С57В1/6 (Н-2 ) выделяли клетки селезенки и лимфоузлов, готовили суспензию лимфоидных клеток в соотношении 2:1, которую (10 кл/мышь, 0,5 мл) внутривенно вводили мышам-реципиентам гибридам первого поколения B6D2F1 (C57Bl/6xDBA/2; H-2b/d) [108]. Отрицательным контролем (КГ) служила группа интактных мышей B6D2F1, получивших внутривенно такой же объем среды для культур клеток. Экспериментальный препарат ФКС в дозе 10,0 мг/кг вводили внутрибрюшинно 3 раза в неделю, начиная с 0 дня индукции РТПХ в течение 3 недель. Группа положительного контроля (К+) получала внутрибрюшинно соответствующие объемы растворителя. В течение 60 дней мониторировали выживаемость и массу тела животных во всех группах.
Эффективность ФКС оценивали, рассчитывая статистическую разницу динамики гибели (кривые Kaplan-Meier) и изменения массы тела животных в группах за период наблюдения. Дополнительно для оценки эффективности ФКС исследовали патоморфологические изменения в органах у выживших животных на 60 день после индукции РТПХ.
Как правило, трансплантация лимфоидных клеток от мышей родительской линии С57В1/6 мышам-гибридам (С57В1/6 х DBA/2)F1 приводит к развитию острой РТПХ [236]. Индуктивная фаза острой РТПХ характеризуется экспансией CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов донора, направленных против различных тканей хозяина. Поэтому наиболее общими и частыми ее проявлениями в экспериментальных моделях являются снижение массы тела и летальность животных вследствие иммунодефицита и полиорганной недостаточности.
В условиях нашего эксперимента при качественной оценке на ранних сроках развития РТПХ не отмечалось явных различий в поведенческих реакциях животных в контрольных группах и группе, получавшей экспериментальную терапию ФКС. На более поздних сроках (с 12-14 дня после индукции РТПХ) в группе К+ и у подопытных мышей на фоне ФКС стали наблюдаться признаки истощения, что объективно проявлялось в снижении массы тела экспериментальных животных. Кроме того, в группе с индукцией РТПХ без лечения наблюдалась выраженная диарея, по сравнению с мышами, получавшими ФКС.
Исследование механизмов антипролиферативного противоопухолевого эффекта ФКС
Взаимодействие фагоцитов с эндотелием сосудистой стенки является важным компонентом, обеспечивающим трансмиграцию клеток в ткани, в том числе при рекрутировании этих клеток в очаг воспаления. Эти процес сы сопровождаются изменением экспрессии молекул адгезии [173], к основным классам которых относятся селектины и интегрины.
Селектины (Са -зависимые лектины животных клеток) являются трансмембранными гликопротеидами, которые посредством обратимого связывания специфических моно- или олигосахаридных структур клеточных мембран и/или экстраклеточного матрикса обеспечивают адгезивные свойства лейкоцитов и эндотелия. На лейкоцитах (лимфоциты, нейтрофи-лы, моноциты, эозинофилы) экспрессируются L-селектины (CD62L), обеспечивающие слабую адгезию, в результате которой, например, осуществляется краевое стояние (маргинация) и качение (роллинг) лейкоцитов по поверхности эндотелия. Лиганды для L-селектинов экспрессированы на высоком эндотелии посткапилярных венул, обеспечивая рециркуляцию лимфоцитов в периферические лимфоузлы [278]. В очаге воспаления экспрессия лигандов для CD62L повышается не только на эндотелии сосудов, а также и на самих лейкоцитах являясь важным механизмом рекрутирования клеток [82]. Слабая адгезия происходит без активации лейкоцитов, однако если клетки при контактах с поверхностью эндотелия получают сигналы активации, через L-селектины трансдуцируется внутриклеточный сигнал, усиливающий экспрессию лейкоцитарных интегринов, обеспечивающих прочную адгезию и остановку лейкоцитов. Так, связывание L-селектина в присутствии хемоаттрактантов (ИЛ-8) увеличивает хемотаксис нейтрофилов [103, 267].
Интегрины - это гетеродимеры гликопротеинов (комбинации а- и Р-цепей образуют более 20 различных представителей) клеточной поверхности, обеспечивающие адгезию клетка-клетка и клетка-матрикс [42]. К основным интегринам, опосредующим адгезию к эндотелию как нейтрофилов, так и моноцитов, относятся (32-интегрины: LFA-1 (CD 11 a/CD 18) и Мас-1 (CDllb/CD18). В качестве лигандов для (32-интегринов выступают мембранные молекулы, образующие группу ICAM (Intercellular Adhesion
Molecules), экспрессия большинства из которых индуцируется провоспали-тельными стимулами на эпителиальных и эндотелиальных клетках. Лиган-дом для комплекса CD1 lb/CD 18 выступает также ІСЗЬ фрагмент компонента комплемента [30, 126]. По-видимому, этот интегрин необходим для комплемент-зависимого фагоцитоза и «респираторного взрыва» фагоцитов. Также ведущая роль CD1 lb/CD 18 показана в опосредуемой ICAM-1 адгезии нейтрофилов при трансэпителиальном диапедезе и миграции через гемато-энцефалический барьер [291]. Миграция моноцитов через эндотелий сину-соидов печени в очаг бактериальной инфекции также зависит от экспрессии CD1 lb/CD 18 и ICAM-1 соответственно на моноцитах и эндотелии [252].
Уникальной особенностью L-селектинов является их способность слущиваться (шеддинг) с клеточной поверхности с образованием пула растворимых рецепторов CD62L. При активации клеток различными медиаторами воспаления происходит усиление шеддинга молекулы CD62L за счет расщепления локализованной на клеточной поверхности протеазой [278], при этом активируются р2-интегрины, адгезивность которых зависит, главным образом, от конформационного состояния [42]. Например, непосредственная экспозиция нейтрофилов с агонистами TLR (ЛПС, зимо-зан) повышает шеддинг L-селектинов, положительно регулирует CD1 lb/CD 18, индуцирует продукцию супероксид-радикала и фагоцитарную функцию, но ингибирует хемотаксис в ответ на ИЛ-8 [113]. По-видимому, физиологический смысл этого в том, что достижение «хемотак-сического стимула» является своего рода стоп-сигналом для миграции, и началом осуществления бактерицидных функций фагоцитами [235].
Поскольку адгезия нейтрофилов, опосредованная CDllb/CD18, связана с инициацией в них сигнального каскада, включающего активацию тиро-зинкиназы [261], то теоретически ингибиторы фосфорилирования могут оказывать влияние на эти процессы. В литературе встречаются сведения о влиянии флавоноидов на экспрессию фагоцитами антигенов CD62L и
CD1 lb как в экспериментах in vitro, так и в исследованиях in vivo [136, 176, 205, 260]. Кверцетин, а также его основные метаболиты (кверцети-3-глюкуронид и кверцетин-3 -сульфат) не влияли на вызванные ЛПС изменения экспрессии этих антигенов нейтрофилами при обработке in vitro [260]; также и генистеин не оказывал значимого влияния на индуцированные про-воспалительным пептидом эндотелином-1 изменения экспрессии CD62L и CD1 lb на нейтрофилах человека [136]. Однако по данным других исследователей кверцетин (40 мкмоль) в тех же условиях способен предотвращать ЛПС-индуцированную негативную регуляцию экспрессии CD62L и позитивную регуляцию экспрессии CDllb на нейтрофилах [176], а эпигаллока-техин-3-галлат способен подавлять экспрессию CD1 lb на моноцитах [205].
У пациентов с зажившими трофическими язвами венозной этиологии прием препарата диосмина (внутрь, 1,0 г 3 раза в сутки в течение 30 дней) увеличивал спонтанную экспрессию CDllb нейтрофильными гранулоцитами периферической крови [73]. Однако в другом пилотном исследовании, в котором пациенты с хронической венозной недостаточностью принимали внутрь микронизированную фракцию флавоноидов (внутрь, 0,5 г 2 раза в сутки в течение 60 дней), отмечалось снижение экспрессии CD62L моноцитами и макрофагами периферической крови, но не наблюдалось статистически значимых различий в экспрессии фагоцитами CD1 lb [253].
Поскольку активационный статус фагоцитов коррелирует со снижением экспрессии CD62L и увеличением экспрессии CD1 lb/CD 18, в настоящем исследовании экспрессия этих молекул на нейтрофилах и моноцитах/макрофагах была использована для косвенной оценки in vitro влияния ФКС на способность этих клеток к активации. В условиях нашего эксперимента использовали цельную донорскую кровь и ЛПС (0,1 мкг/мл) в качестве агента, активирующего фагоциты. До активации пробы инкубировали с ФКС (20,0 мкг/мл) в течение 30 мин. Уровень экспрессии CD62L и CD1 lb исследовали методом проточной цитометрии с использованием мо ноклональных антител, оценивая показатель интенсивности флуоресценции клеток (раздел 1.9.1) сразу после забора крови и после инкубации с ЛПС (15-45 мин., 37С).
