Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 .Общие принципы сорбции белков 14
1.2 Взаимодействие белков с сорбционными материалами 17
1.3. Материалы, используемые для ионобменной хроматографии белков
1.3.1. Требования к сорбентам для хроматографии белков 22
1.3.2. Синтез полимерных сорбционных материалов 24
1.3.3. Типы высокопроницаемых сетчатых полиэлектролитов 29
1.3.4. Гетеросетчатые сорбенты 32
1.3.5. Целлосорбенты 35
1.3.6. Монолитные носители 36
1.3.7. Концентрация ионогенных групп в сорбенте 40
1.4. Синергизм и конкуренция при взаимодействии белков с полимерными сорбентами
Глава 2. Материалы и методы 47
2.2. Гетеросетчатые набухающие полиэлектролиты 47
2.2.1. Синтез сополимеров МАА, ГПМА и ЭДМА 48
2.3. Монолитные диски 49
2.3.1. Синтез макропористого сополимера ГМА-ЭГДМА 50
2.3.2. Модификация монолитных дисковых сорбентов хлоруксуснои кислотой
2.4. Методы исследования сорбентов 52
2.4.1. Определение степени набухания сорбента 52
2.4.2. Определение обменной емкости сорбента 53
2.4.3. Определение констант ионизации 53
2.4.4. Оценка пористости использованных в работе сорбентов методом ртутной порометрии
2.4.5. Метод динамической десорбции паров 55
2.5. Методы изучения сорбции белков 56
2.5.1. Определение оптимальных условий сорбции модельных белков
2.5.2. Эксперименты в статических условиях (сорбция из ограниченного объема раствора)
2.5.3.Эксперименты в динамических условиях 57
2.5.3.1.Сорбция белковых растворов на гетеросетчатых набухающих полиэлектролитах
2.5.3.2.Сорбция белковых растворов на карбоксилированных монолитных дисках
2.5.4.Определение концентрации белков 59
2.5.5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 60
2.5.6. Окраска белков в полиакриламидном геле 62
2.6. Гель-хроматография 63
2.7. Модификация поверхности полистирольных латексов цитохромом
2.8.Сшивание цитохрома с глутаровым альдегидом 66
2.9. Выделение белков большего размера из плазмы крови 67
2.10. Расчет биленгмюровских изотерм для пары цитохром с - БСА... 67
Глава 3. Избирательность сорбции белков на набухающих сорбентах 69
3.1. Влияние содержания ионогенных групп на структуру и свойства катионитов
3.2. Оценка взаимосвязи сорбционных свойств и структуры карбоксильных гетеростечатых катионитов с различным содержанием ионогенных групп 71
3.3. Исследование процессов сорбции модельных белков на серии набухающих гетеросетчатых катионитов с различным содержанием карбоксильных групп 76
3.3.1. Опре деление оптимума рН для сорбции модельных белков 76
3.3.2. Сорбция модельных белков из индивидуальных растворов 77
3.3.3. Последовательная сорбция модельных белков 80
3.3.4. Совместная сорбция модельных белков 85
3.3.5. Расчет биленгмюровских изотерм при «полуконкурентном» характере взаимовлияния белков в сорбционном процессе
Глава 4. Избирательность сорбции белков на модифицированных монолитных носителях 94
4.1. Модификация поверхности ГМА-ЭГДМА сополимера 94
4.2. Исследование структуры катионитов на основе ГМА-ЭГДМА сополимера методами динамической десорбции воды и ртутной порометрии 97
4.3. Адсорбция модельных белков 101
4.3.1. Определение условий адсорбции 101
4.3.2. Адсорбция модельных белков из индивидуальных растворов.. 103
4.3.3. Последовательная адсорбция модельных белков на карбоксилированных монолитных ГМА-ЭГДМА носителях
4.3.4. Совместная адсорбция модельных белков на карбоксилированных монолитных ГМА-ЭГДМА носителях
4.4. Избирательность сорбции как функция размеров сорбата 116
4.4.1. Модификация поверхности полистирольных латексов 116
4.4.2. Влияние сшивание цитохрома на избирательность сорбции 118
4.5. Сорбция белков из плазмы крови 122
Заключение 125
Выводы 126
Список литературы 127
- Взаимодействие белков с сорбционными материалами
- Концентрация ионогенных групп в сорбенте
- Синтез макропористого сополимера ГМА-ЭГДМА
- Оценка взаимосвязи сорбционных свойств и структуры карбоксильных гетеростечатых катионитов с различным содержанием ионогенных групп
Введение к работе
Различные хроматографические методы выделения и очистки биологически активных веществ (БАВ), в частности белков, имеют свои достоинства и недостатки. Наиболее экономичными и легко масштабируемыми процессами являются фронтальные процессы ионообменной хроматографии. Но по избирательности они уступают процессам аффинной хроматографии. Выделение белка с использованием одноактного ионообменного процесса может быть проведено, если целевой компонент резко отличается по своим свойствам от остальных компонентов. В противном случае приходится либо использовать каскад колонок с различными сорбентами, либо после насыщения фазы сорбента смесью различных белков с помощью промывки сорбента различными буферными растворами стараться отделить целевой белок от сопутствующих. Процесс осложняется тем, что множественные ион-ионные взаимодействия белка с ионогенными группами сорбента, дополняемые гидрофобным взаимодействием, приводят к межбелковому связыванию в фазе сорбента, что отрицательно сказывается на разделении белков. Известно, что уменьшение концентрации ионогенных групп сорбента повышает эффективность разделения. Однако, эти исследования проводили на модельных растворах, содержащих белки с близкой молекулярной массой и, соответственно, примерно одинаковыми размерами. Очевидно, что размеры белковой макромолекулы, непосредственно влияя на ее диффузию в фазе сорбента, должны оказывать и влияние на избирательность ее ' сорбции из многокомпонентной смеси. Чем больше размеры белка, тем больше на его поверхности групп способных к связыванию с полиэлектролитной сеткой или заряженной поверхностью. Следовательно, можно ожидать, что при определенных условиях после пропуска через колонну с сорбентом раствора
смеси белков сорбент окажется насыщенным самым большим по размеру белком. Таким образом, весь процесс выделения белка возможно провести всего в две стадии: сорбция до насыщения и последующая десорбция.
В связи с вышеизложенным, выбранное направление исследований, а именно, исследование взаимодействия модельных белковых смесей с полимерными сорбентами с различной концентрацией ионогенных групп с целью определения влияния молекулярных размеров белков на избирательность их сорбции в многокомпонентном процессе, является актуальной задачей физической химии, как с теоретической, так и с прикладной точки зрения. Создание сорбентов с уменьшенным содержанием ионогенных групп позволит оптимизировать процессы тонкого разделения белков в хроматографическом процессе.
Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 03-03-32710 и 06-03-32363) и по планам Института высокомолекулярных соединений РАН. Кроме того, работа является победителем «Конкурса персональных грантов 2007 года для студентов и аспирантов вузов и академических институтов Санкт-Петербурга»» и программы "Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса" (УМНИК).
Цель работы: Исследование влияния молекулярных размеров белков на избирательность их сорбции гетеросетчатыми катионитами и монолитными носителями с варьируемым числом ионогенных групп для повышения эффективности разделения белков в ионообменной хроматографии.
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены
следующие задачи:
получение макропористых монолитных катионитов (сополимеров глицидилметакрилата и этиленгликольметакрилата) с различной степенью карбоксилирования;
исследование влияния концентрации карбоксильных групп в набухающих полиэлектролитных сетках при постоянном содержании сшивающего агента, а так же степени карбоксилирования монолитного носителя на структуру сорбентов;
изучение процессов последовательной и совместной сорбции смесей модельных белков, различающихся своими размерами, на катионитах с различным содержанием карбоксильных групп; создание модели укрупненного белка путем сшивания макромолекул глутаровым альдегидом, а также их прививки на частицы полистирольного латекса с целью проверки предположения об определяющей роли размеров белка в избирательности сорбции на катионитах с малым содержанием карбоксильных групп;
расчет биленгмюровских изотерм на основании данных, полученных для однокомпонентных систем, содержащих сорбент и раствор одного белка;
Взаимодействие белков с сорбционными материалами
Проблемам взаимодействия белка с сорбентами ежегодно посвящается множество работ. Большинство из них затрагивают вопросы сорбции тех или иных белков на материалах различных типов и различной природы. Так в [8] рассматривают процесс адсорбции бычьего сывороточного альбумина (БСА) на частицах ТЮг, в [9] - адсорбцию человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и лизоцима на сферических стеклянных частицах, покрытых полимером на основе малеиновой кислоты, в [10] -взаимодействие БСА с поли(диметилдиаллиламмоний хлоридом), в [11], в [12] - модификацию пористых микросфер на основе сополимера глицидилметакрилата и дивинилбензола полиэтиленгликолем и адсорбцию на полученном материале БСА и трипсина. Авторами [13, 14, 15 16] была проведена серия работ по подробному исследованию взаимодействия впервые синтезированных ионообменных полиакриламидных сорбентов с высокой плотностью функциональных групп с белками. Кроме того, в [17] затрагивается вопрос влияния размеров белка на сорбционную емкость. В работе был использован сильный анионит BRX-Q на основе акриламидных и винильных мономеров, полимеризованных с образованием сферических частиц и серия модельных белков с молекулярными массами от 15000 до 450000: лактальбумин, миоглобин, овальбумин, БСА, кональбумин, иммуноглобулин G (IgG) и ферритин. Сорбционный процесс рассматривается в условиях различной ионной силы раствора, при чем оказалось, что если в случае высокой ионной силы (50тМ трис-НС1, содержащий 500mM NaCl) только белки малого размера (лактальбумин и миоглобин) проникают в объем сорбента, т.е. имеет место эксклюзионный эффект, то в случае низкой концентрации соли (50тМ трис-НС1) сорбционная емкость по всем белкам достаточно высока, поскольку преобладают электростатические взаимодействия между белком и поверхностью сорбента, В последнем случае речь о какой-либо избирательности сорбции белка в зависимости от молекулярного размера не идет.
Работы, подобные [6-17] появляются постоянно и не всегда носят системный характер. Однако среди них выделяются труды, посвященные более или менее подробному сравнительному анализу различных сорбционных материалов между собой. Как правило, в таком случае авторы выбирают ряд уже достаточно широко используемых сорбентов промышленного производства и анализируют их взаимодействие с определенными модельными белками по тем или иным показателям. Так, например, авторы [18, 19] проводили сравнение катионобменных смол, используя образцы ионитов S-HyperD-F, S-Sepharose FF, Fractogel SO3-650 (S) и Macro-Prep High S Support. Для них изучалась такие параметры как кинетика связывания по отношению к иммуноглобулину G и поведение при элюировании при использовании солевых растворов различных концентраций. Было продемонстрировано, что Fractogel SO3-650 (S) имеет наиболее высокую емкость по отношению к иммуноглобулину G, но разделительная способность у него была ниже, чем у трех других смол. S-HyperD-F и S-Sepharose FF обладают меньшей емкостью, но они показали лучшую разделительную способность по отношению к белкам. Емкость же Macro-Prep High S Support была значительно ниже, чем у остальных исследуемых катионитов. S-HyperD-F и S-Sepharose FF объединяют в себе высокую динамическую емкость по иммуноглобулину G и хорошую разделительную способность. В опытах со стандартными белками, такими как раствор БСА в концентрации 100 мг/ мл для S-HyperD-F, эти катиониты проявляют низкую способность к связыванию, причем существенно улучшить этот показатель не удалось даже после удаления из системы низкомолекулярных веществ. Т.е. показано, что на слабую способность к связыванию белков оказывают влияние условия проведения опыта (низкие значения рН), тогда как наличие низкомолекулярных соединений в данных условиях на процесс адсорбции белков существенного влияния не оказывал.
Динамическая емкость для исследуемых материалов лишь очень слабо снижается в диапазоне скоростей потока от 100 до 600 см/ч. Оценивая итоги данного исследования, S-HyperD-F и S-Sepharose FF и Fractogel S03 650 (S) можно рекомендовать в качестве потенциально успешных кандидатов для использования в крупномасштабных процессах очистки белков, в частности белков бычьей сыворотки. Аналогичным образом в [20, 21, 22] проводили сравнительное изучение эффективности, прочности связывания и динамической емкости ряда анионобменных сорбентов. В этой работе использовались такие хроматографические ионообменные сорбенты как Macro-Prep25Q, TSK-Gel Q-5PW-HR, Poros QE/M, Q Sepharose FF, Q HyperD 20, Q Zirconia, Source 30Q, Fractogel EMD TMAE 650s и Express-Ion Q. Изучение проводилось в отношении различных белков: иммуноглобулина G, апротинина, ли по л азы и миоглобина. Было установлено, что влияние величины рН может быть как существенным, так и незначительным (по отношению к белкам с низким значением pi). Результаты изучения эффективности процесса показывают тенденцию к более слабой зависимости высоты тарелки при увеличении скорости потока через исследуемые сорбенты при среднем и высоком давлении, в сравнении с мягкими материалам [21, 22]. Таким образом, видно, что зависимость связывания с анионообменными сорбентами от ионной силы раствора специфична для каждого конкретного белка. Исходя из полученных результатов, сорбцию и элюирование с использованием высококонцентрированных солевых растворов, можно осуществлять на Poros QE/M или Macro-Prep25Q, а сорбцию и элюирование с использованием солевых растворов малых концентраций - на TSK-Gel Q-5PW-HR. Динамическая емкость сильно зависит от используемого белка, а для большинства сорбентов зависит также от скорости протекания раствора через сорбент. Иными словами, полученные данные могут быть успешно использованы при выборе ионообменных сорбентов для осуществления технологических процессов, но они ничего не говорят о специфических различиях в селективности и способности обеспечить требуемое разделение целевого белка и примеси. Ионообменные материалы, рассмотренные выше нельзя характеризовать как хорошие или плохие, а можно назвать более-менее пригодными для конкретных целей, и только после испытаний в каждом отдельном случае можно определить, какой именно сорбент является наиболее подходящим.
Выбор хроматографических материалов и их последовательное использование неизменно наталкивается на ряд трудностей, когда речь заходит о выделении индивидуального белка из неочищенных экстрактов и других сложных смесей. Поэтому данные, приведенные в работах подобных [21, 22], можно использовать как основу при выборе сорбентов и при реализации вновь разрабатываемых методик [23, 24]. Так, например, в [23] предлагается достаточно простой в осуществлении процесс, включающий в себя две основные стадии: (1) рациональный выбор нескольких материалов из относительно обширного перечня и (2) определение последовательности колонок для обеспечения максимальной чистоты целевого белка. На первой стадии выбирается один сорбент, способный удерживать белок, подлежащий очистке, независимо от того, сорбируются ли на нем также и белки-примеси. Затем определяются еще 5-7 вспомогательных сорбентов, способных удалять примеси, но не взаимодействующих в тех же условиях с целевым белком. На второй стадии предлагается использование колонки, последовательно заполненной несколькими сорбентами, перекрывающимися друг с другом по принципу каскада так, чтобы сорбент, способный сорбировать целевой белок, находился в конце этой цепочки.
Концентрация ионогенных групп в сорбенте
Следует отдельно остановиться на вопросе концентрации лигандов в фазе сорбента. Как было отмечено в разделе, касающемся требований к сорбентам для хроматографии белков, плотность лигандов является одной из важнейших характеристик сорбирующего материала. По литературным данным [26], как правило, используются сорбенты с содержанием функциональных групп до 100ммоль/мл, причем большинство коммерческих материалов направлены на выделение максимально возможного количества белка. Однако в последнее время появились работы, рассматривающие влияние концентрации ионогенных групп в сорбенте на эффективность разделения смесей белков. В [6, 58, 59]затрагивается вопрос ионообменной хроматографии белков крупных размеров. В [58, 60, 61] предлагается создание сорбентов со сниженным числом ионогенных групп, причем этот вопрос обсуждается с точки зрения увеличения эффективности десорбции макромолекул белка при уменьшении обменной емкости сорбентов. Дело в том, что большая площадь поверхности крупных белков может взаимодействовать с большой поверхностью сорбента. А большая площадь взаимодействия может способствовать очень прочной многоточечной адсорбции, что, в свою очередь, может привести к трудностям при десорбции белков. Т.е. может быть сформировано множество ионных связей, и последующая десорбция белка окажется затруднительной (требующей очень высокой ионной силы, экстремальных значений рН и т.д.). В ходе сравнительного изучения эффективности десорбции белков с анионитов разной степени активации [58], было показано, что если при использовании высокоактивированного сорбента MANAE-агароза удавалось добиться десорбции только 40% белка (при использовании 1М NaCl или величине рН 5 в качестве десорбирующего агента). Однако при снижении степени активации матрицы удалось добиться десорбции белка при более низких концентрациях соли. Используя матрицу с Юимоль/г активных групп уже оказалось возможным выделить 80% белка, а, используя матрицу с 5нмоль/г - 90% белка было десорбировано только с применением 100 mM NaCl. При адсорбции же белка на низко активированном носителе (1дмоль/г) удалось добиться полной десорбции при очень низкой ионной силе (50 mM NaCl). Таким образом, очевидно, что использование слабо активированных сорбентов позволяет избежать проблем, связанных с десорбцией крупных белков.
Однако логично предположить, что к существенным достоинствам таких сорбентов со сниженным содержанием ионогенных групп должно относиться ослабление взаимодействия молекул белка в фазе сорбента, что увеличивает эффективность разделения смеси и выделения целевого компонента.
Эффекты синергизма могут возникать при сорбции белков в виде полиэлектролитного комплекса или вследствие их агрегации в фазе сорбента. Сильное («необратимое») связывание белков с сорбентами приводит к тому, что модели, основанные на представлении о конкуренции компонентов за свободные места, оказываются неприменимыми к процессам многокомпонентной сорбции белков [63].
В подавляющем большинстве работ исследование процессов многокомпонентной сорбции белков ведут, используя представления о конкуренции. Даже в тех случаях, когда исследователи имеют дело с материалами, обладающими ограниченной способностью к связыванию белков, такой подход не всегда бывает оправдан. Исследование взаимодействия смешанных белковых растворов с высокоемкостными ионообменными сорбентами для препаративной хроматографии показывает, что процессы взаимодействия могут сопровождаться значительными синергетическими эффектами.
Результаты экспериментов по последовательной и совместной сорбции белков показывают, что вне зависимости от морфологии сорбентов, типа ионогенных групп, гидрофобности матрицы сорбента в условиях близких к условиям максимального связывания белков в ходе последовательной и совместной их сорбции наблюдаются синергетические эффекты: при последовательной сорбции идет дополнительная сорбция первого белка после добавления второго, при совместной - общее количество поглощенного белка превышает емкость сорбента по индивидуальным белкам. [63- 67].
Причиной синергизма в процессах многокомпонентной сорбции, как указывалось выше, может быть комплексообразование белков в растворе или взаимодействие белков в фазе сорбента.
Однако, как было продемонстрировано при проведении экспериментов по последовательной сорбции, между количеством сорбированного во вторую очередь белка и дополнительно сорбированного первого белка отсутствует какая-либо пропорциональность, что противоречит предположению о том, что белки сорбируются в виде комплексов [68]. Можно принять как гипотезу, что наличие синергетических эффектов, продемонстрированное в процессах многокомпонентной сорбции белков на ионообменных сорбентах, связано с образованием разнородных белковых слоев. Сначала белок занимает все доступные сорбционные центры, при этом связывается с сорбентом настолько прочно, что не вытеснения его другим белком не происходит. Дальнейшая сорбция идет за счет взаимодействий белок-белок. Однако, сама по себе возможность многослойной укладки не может объяснить причин того, что в равновесных условиях белок, сорбируемый более избирательно, не вытесняет своего «конкурента» с наиболее выгодных энергетических центров и при последовательной сорбции емкость катионита по этому белку не достигает максимального значения. По-видимому, при сорбции белка на поверхности ионита происходит кооперативное связывание макромолекулы с несколькими ионогенными группами, которое сопровождается еще дополнительными неэлектростатическими взаимодействиями. Вероятно, при взаимодействии белка с сорбентом происходит связывание макромолекулы с несколькими фиксированными ионогенными группами, которое в ряде случаев сопровождается еще дополнительным неэлектростатическим взаимодействием. При этом необходимость одновременного разрыва всех связей для вытеснения одного белка другим делает это событие маловероятным. [68]
Синтез макропористого сополимера ГМА-ЭГДМА
В работе были использованы монолитные СІМ диски на основе сополимера ГМА-ЭГДМА. Однако для проведения анализа пористости образцов методом ртутной порометрии до и после введения ионогенных групп, потребовалось синтезировать дополнительное количество полимера.
В сосуд вносили инициатор, мономеры, а затем - циклогексанол. Смесь набирали в шприц, закрывали иглу колпачком и помещали в термостат (иглой вверх) на 6 часов. По окончании процесса полимеризации, полимер извлекали из шприца, промывали спиртом и водой до полного исчезновения запаха циклогексанола и высушивали до постоянной массы.
Процедуру обработки при необходимости повторяли. Поскольку сорбент после модификации находится в солевой форме, его переводили в Н-форму с помощью 50 мл 1 М НС1, после чего сорбент отмывали водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы. Таблица 2
Для определения удельного объема набухшего сорбента (Vx) по 1 г воздушно-сухих образцов помещали во взвешенный бюкс и сушили в вакуумно-сушильном шкафу при t = 50С. Затем бюксы с образцами в эксикаторе охлаждали до комнатной температуры и взвешивали, определяя массу сорбента, взятого для набухания. Далее образцы переносили в калиброванные цилиндры с притертой пробкой и заливали рабочим буфером (0,1 М ацетатный буфер рН=3,8), перемешивали содержимое и через сутки измеряли объем набухшего сорбента. Удельный объем набухшего сорбента определяли как отношение объема набухшего сорбента к его весу в сухом состоянии.
Обменную емкость по малому иону для синтезированных сорбентов определяли методом обратного кислотно-основного титрования. Для этого навеску воздушно-сухого сорбента (500 мг для гетеросетчатых сорбентов или 1 диск для монолитных материалов) в Н-форме помещали во флакон, заливали точно известным объемом (20 мл) ОД М NaOH и оставляли на ночь.
Определение констант ионизации проводили методом потенциометрического титрования. Для этого навеску сорбента заливали 20 мл 0.1М раствором NaCl, оставляли при перемешивании на сутки и измеряли исходную величину рН раствора. Затем проводили титрование 0.1М раствором NaOH (с шагом по 0.1мл щелочи, дожидаясь наступления равновесия после каждого добавления щелочи). 2.4.4. Оценка пористости использованных в работе сорбентов методом ртутной порометрии
Пористость материалов на основе монолитных ГМА-ЭГДМА сополимеров оценивали методом ртутной порометрии (РП). Данный метод является наиболее информативным способом оценки пористости и распределения пор по размерам, он дает возможность прямого определения пористости исследуемого образца непосредственно в процессе эксперимента, как объема ртути, вдавливаемого в поры. Данный метод позволяет получать структурные кривые распределения объема и поверхности пор в широком диапазоне эквивалентных радиусов: от 1.5 до 40 000 нм, целиком охватывая две разновидности пор — мезо- и макропоры. Метод РП основан на явлении капиллярной депрессии, состоящей в том, что проникновение несмачивающей жидкости в поры твердого тела возможно только под воздействием внешнего избыточного давления. Угол смачивания поверхности большинства известных материалов ртутью составляет величину больше 90, поэтому ртуть служит рабочим веществом для метода РП. Связь между внешней силой и силой контактного сопротивления проникновению ртути в поры при условии равновесного состояния системы, описывается уравнением капиллярной депрессии: Fp = -П5 cos в Где F - площадь нормального сечения поры, П - периметр поры, 6 -угол смачивания и а - поверхностное натяжение. Линейные размеры пор с произвольной формой сечения могут быть охарактеризованы отношением площади нормального сечения поры к ее периметру:
Для выражения линейного размера пор с произвольной формой сечения пользуются понятием «гидравлический радиус» или «эквивалентный радиус» гэка. Метод динамической десорбции паров (ДДП) [74-77] основан на анализе кинетики сушки образца в квазиравновесных условиях. Данные условия обеспечиваются ограничением скорости испарения адсорбата из ячейки с образцом. Ячейка размещена на чашке термостатируемых весов и обдувается сухим газом, чтобы обеспечить надежное удаление паров адсорбата от ячейки. Компьютеризированная экспериментальная установка выполнена на базе электронных аналитических весов и не использует специализированного дорогостоящего оборудования и приспособлений. ДДП является самокалибрующимся равновесным методом по типу получаемой информации и динамическим по способу ее получения. Результатом измерения методом ДДП являются изотермы десорбции разных адсорбатов при атмосферном давлении и температуре немногим выше комнатной. Из них с помощью стандартных методик [78] можно рассчитать распределения объемов пор по размерам или другие распределения объема жидкости по потенциалам её связывания с материалом образца.
Оценка взаимосвязи сорбционных свойств и структуры карбоксильных гетеростечатых катионитов с различным содержанием ионогенных групп
Изученные образцы сорбентов имеют гетерогенную структуру и обладают пористостью в сухом состоянии. Структурные размеры были оценены из фотографий образца КМАГ-1-1-Э20. Его гетерогенная структура построена из полимерных микрочастиц с размерами 30-60 нм, образующих агломераты с размерами 1 - 2 мкм. Размер пор между агломератами не превышает 200 нм. На рис. 10 приведены изотермы десорбции воды для трех образцов. Обращает на себя внимание, что все они имеют основную ступень десорбции вблизи единицы. Это обстоятельство практически полностью исключает возможность получения подобных изотерм стандартными адсорбционными методами из-за больших ошибок определения относительных давлений паров адсорбата р/р0 вблизи единицы.
Важной особенностью измерений данных полимеров является эффект, который проявляется почти для всех сильно набухающих материалов, независимо от адсорбата, при измерении их десорбционных изотерм методом ДДП. Основной особенностью ДДП является то, что он, являясь динамическим, определяет р/ро по скорости отвода паров адсорбата, которая в свою очередь зависит от состава пара внутри ячейки. В нормальной ситуации состав пара в ячейке определяется испарением с поверхности жидкости или из пор. В случае набухающих полимеров до тех пор, пока в ячейке находится свободная жидкость, состав пара отвечает ей и относительное давление равно р/ро=1. После того, как свободная жидкость полностью испарится, начинает сохнуть полимер, и здесь начинаются особенности. Для катионита КМА-Э20 эти особенности заключаются в том, что вода не только испаряется, но и частично "выдавливается" из полимера (например, за счет упругих сил, возникающих при набухании, сопровождающемся растяжением полимерных цепей). В результате состав пара отвечает пересыщенному состоянию, а поскольку метод динамический, он имеет возможность уловить это пересыщение. Такого же рода релаксационные явления присущи и другим образцам.
Как следует из таблицы 5, общий удельный объем адсорбированной воды Vt и рассчитанный из него суммарный удельный объем сорбента Vs = Vt+Vd, где Vd удельный объем сухого адсорбента (-1,3 см3/г), довольно хорошо коррелирует с независимо измеренной величиной удельного объема набухшего адсорбента V .
Как следует из рис. 11, промежуточный по составу образец КМАГ-1-1-Э20 оказался наиболее мелкопористым. Наиболее крупнопористым является КМА-Э20, но определить его размер «пор» невозможно, так как он выходит за пределы применимости метода ДДП. На рис. 11 приведена только конечная часть кривой для образца КМА-Э20.
Оперировать термином "пора" в случае набухших образцов можно лишь условно, имея в виду только наглядность кривых при сравнении образцов между собой. Правильнее говорить о размерах ячеек полимерной сетки.
Сорбция инсулина на образцах 1, 2 и 3 была исследована в 0,1 М уксусной кислоте. В этих условиях набухание полиэлектролитных сеток то же, что и в воде. Из данных таблицы 5 видно, что падение максимальной емкости по инсулину не пропорционально уменьшению емкости по иону Na+, следовательно, при большой концентрации МАА происходит связывание белковой макромолекулы с несколькими ионогенными группами.
Исследования кинетики сорбции инсулина при рН 2,5 на этих образцах сорбентов показали, что среднее время сорбционного процесса пропорционально содержанию ионогенных групп. Для объяснения полученных закономерностей необходимо учесть влияние химической реакции связывания белка в фазе сорбента. Все три использованных образца обладают в набухшем состоянии порами с радиусами до сотен нм, что значительно превосходит размеры димера инсулина (4x2x2 нм).
Катионит КМА-Э20 обладает наибольшим количеством ионогенных групп. Сорбция инсулина на нем «необратима» в условиях эксперимента, благодаря многоточечному связыванию белка с сорбентом, что и приводит к синергетическим эффектам при сорбции смеси белков [88]. Скорее всего, белок, проникнувший в поверхностный слой сорбента, связывается с несколькими ионогенными группами полимерной сетки и остается на этом месте в течение всего эксперимента. Такое прочное связывание приводит к тому, что проницаемость поверхностного слоя уменьшается. Т.е. фактически, при сорбции белка происходит модификация катионита, приводящая к заметному ухудшению его диффузионных характеристик (среднее время сорбции составляет 10000 с).
Сорбент КМАГ-1-1-Э20 обладает в два раза меньшей обменной емкостью, по сравнению с КМА-Э20, и хотя он является наиболее мелкопористым по данным ДДП, среднее время сорбции инсулина уменьшается почти в 5 раз и составляет 2200 с. Поскольку при этом средняя плотность ионогенных групп уменьшилась в два раза, то число связей на одну молекулу белка также уменьшается, и падает общее количество поглощенного сорбентом белка. Это приводит к уменьшению влияния собственно процесса сорбции на диффузионные характеристики сорбента. При переходе к катиониту КМАГ-1-5-Э20, полная обменная емкость сорбента уменьшается в 5 раз по сравнению с образцом КМА-Э20, среднее время сорбции уменьшается до 1200 с. Количество связей на одну молекулу белка падает, что облегчает диссоциацию пары белок - ионогенная группа. На этом сорбенте в случае сорбции из смеси белков имеет место конкурентный механизм сорбции, что и означает, что энергия связывания белок - сорбент сильно уменьшилась. Естественно, что влияние сорбции на структуру сорбента в этом случае еще меньше, кинетика сорбции улучшается.
Из вышесказанного можно сделать вывод о том, что проницаемость полученных полимерных сеток по отношению к белкам зависит не столько от размеров ячеек полимерной сетки, сколько от содержания ионогенных звеньев в сополимере.
Совокупность всех данных позволяет утверждать, что структура гетеросетчатых сорбентов практически не зависит от содержания мономера, несущего ионогенную группу, следовательно, в дальнейших экспериментах влияние изменений структуры будет полагаться не существенным.
Похожие диссертации на Влияние размеров белковых макромолекул на избирательность их сорбции катионитами различных типов
![Влияние размера макроцикла трет-бутилкаликс[n]аренов на селективность и эффективность связывания паров органических соединений](/i/i/4429/297974.png "Влияние размера макроцикла трет-бутилкаликс[n]аренов на селективность и эффективность связывания паров органических соединений Якимов Алексей Вадимович")
