Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Устройства молекулярной памяти и контроля в растворах и на поверхностях 9
1.1.1. Введение 9
1.1.1.1. Требования к молекулярным информационным устройствам 9
1.1.1.2. Проблемы создания молекулярных информационных устройств 11
1.1.2. Молекулярные устройства в растворах и на поверхности 12
1.1.2.1 Реализация информационных функций при связывании 14
1.1.2.2. Молекулярные структуры с функциями механического переключения 15
1.1.2.3. Иммобилизованные молекулярные оптоэлектронные структуры 17
1.1.2.4 Механические переключения в молекулярных системах, закрепленных на поверхности 19
1.1.3. Выводы и перспективы ' 20
1.2. Опосредованный перенос электронов между редокс-энзимами и подложками электродов 22
1.2.1. Введение 22
1.2.2. Перенос электронов диффузионными посредниками 24
1.2.2.1. Активация энзимов диффузионными посредниками в растворах 24
1.2.2.2. Монослойные и многослойные энзиматические электроды, активируемые диффузионными посредниками 26
1.2.2.3. Иммобилизованные в полимерные или неорганические матрицы энзимы, активируемые диффузионными посредниками 26
1.2.3. Реализация электрического контакта между растворенными энзимами и электродами, функционализированными посредниками 27
1.2.4. Электрическое контактирование с электродами растворенных энзимов, модифицированных посредниками 28
1.2.4.1. Функционализация редокс-энзимов посредниками переноса электронов в растворах 29
1.2.4.2. Монослойные и многослойные архитектуры на электродах, содержащие энзимы, функционализированные посредниками переноса электронов 30
1.2.5. Композитные полимерные и неорганические матрицы на электродах, содержащие энзимы и посредники 32
1.2.5.1. Функционализированные посредниками полимерно-энзиматические матрицы 32
1.2.5.2. Функционализированные посредниками золь-гелевые матрицы с иммобилизованными энзимами 33
1.2.5.3. Функционализированные посредниками композитные графитовые пасты, содержащие иммобилизованные энзимы 34
1.2.6. Оптимизация электрического контакта энзимов с электродом с помощью
функционализированного посредником кофактора 35
1.2.6.1. Реконструирование апо-флавоэнзимов FAD-кофакторами с ковалентно пришитыми переносчиками электронов 36
1.2.6.2. Поверхностное реконструирование апо-флавоэнзимов на электродах, последовательно модифицированных переносчиком и FAD 37
1.2.7. Реализация электрического контакта NAD(P)+-3aBHCHMbix энзимов 38
1.2.7.1. Электрохимическая регенерация кофакторов NAD(P)+ 39
1.2.7.2. Электрохимическая регенерация кофакторов NAD(P)H 40
1.2.7.3. Ассоциация НАБ(Р)+-зависимых энзимов с ЫАО(Р)+-кофакторами 42,
1.2.8. Применение энзимов, электрический контакт которых с электродом реализуется с помощью посредников переноса электронов 43
1.2.9. Выводы и перспективы 44
1.3. Молекулярный импринтинг в аналитической химии 46
1.3.1. Введение 46
1.3.2. Основные принципы молекулярного импринтинга 46
1.3.3. Аналиты 47
1.3.4. Импринтированные матрицы 47
1.3.5. Физические формы МИП и новые методы их приготовления 48
1.3.6. Применение молекулярно импринтированных полимеров в аналитической химии
1.3.6.1. Разделение и анализ 49
1.3.6.2. Сенсоры 50
1.3.7. Выводы и перспективы 52
1.4 Исследование супрамолекулярньгх систем методом спектроскопии
поверхностного плазменного резонанса 53
1.4.1. Введение 53
1.4.2. Теоретическое обоснование ППР 53
1.4.3. Применение ППР для решения фундаментальных и практических задач 55
1.4.4. Выводы и перспективы 56
2. Объекты и методы исследования 58
2.1. Объекты исследования 5 8
2.1.1. Реактивы 58
2.1.2. Ультратонкие пленки полианилина 58
2.1.3. Модификация золотой поверхности мультистабильными пленками берлинской лазури. 59
2.1.4. Композитные пленки на основе полианилина и полиакриловой кислоты 59
2.1.5. Реконструирование глюкозооксидазы на композитной пленке полианилин/полиакриловая кислота, функционализированной кофактором FAD 59
2.1.6. Формирование энзиматического электрода, содержащего NAD-зависимый энзим лактат-дегидрогеназу 60
2.1.7. Реконструирование глюкозо-дегидрогеназы на композитной пленке полианилин/полиакриловая кислота, функционализированной кофактором PQQ 60
2.1.8. Синтез импринтированных кофакторами полимерных мембран на основе фенилборной кислоты и акриламидных мономеров 61
2.2. Методы исследования 62
3. Результаты и обсуждение 64
3.1. Полимерные пленочные сенсорные системы на основе поверхностного плазмонного резонанса 64
3.1.1. Оптический контроль электрохимических преобразований редокс-активных пленок полианилина 64
3.1.2. Исследование оптического отклика на электрохимическое переключение в мультистабильных пленках берлинской лазури для разработки систем электронной памяти 70
3.1.3. Мультистабильные пленочные ППР-сенсоры для определения кофактора NADH 75
3.1.3.1. Электрохимическое окисление NADH, индуцируемое берлинской лазурью 75
3.1.3.2. Разработка композиции на основе полианилина и полиакриловой кислоты для электрокаталитического окисления биологических объектов в нейтральных средах 77
3.2. Биосенсорные системы на основе ППР 88
3.2.1. Исследование биоэлектрокаталитического окисления глюкозы глюкозооксидазой, иммобилизованной в композитной полимерной мембране на основе полианилина 88
3.2.2. Исследование биоэлектрокаталитического окисления лактата 96
3.2.3. Исследование биоэлектрокаталитического окисления глюкозы глюкозо-дегидрогеназой, ассоциированной с полианилиновой пленкой через пирролохинолин хинон 103
3.3. Молекулярный импринтинг как новый способ формирования селективных матриц для определения субстратов методом поверхностного плазмонного резонанса 109
3.3.1. Получение импринтированных кофакторами полимерных мембран на основе фенилборной кислоты и акриламидных мономеров 111
3.3.2. Определение кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH сенсорными системами на основе молекулярно импринтированных полимеров и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса 115
3.3.3. Мониторинг биокаталитического окисления лактата кофактором NAD+ с использованием NADH-импринтированного полимера и спектроскопии ППР 131
Выводы 134
Список литературы
- Проблемы создания молекулярных информационных устройств
- Функционализированные посредниками полимерно-энзиматические матрицы
- Модификация золотой поверхности мультистабильными пленками берлинской лазури.
- Оптический контроль электрохимических преобразований редокс-активных пленок полианилина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Создание компактных организованных молекулярно-механических, информационных и сенсорных систем в настоящее время является одной из главных задач супрамолекулярной химии. Интерес к таким системам обусловлен потребностью в разработке молекулярных компьютеров и механизмов (приводы, моторы), химических сенсоров для анализа состава различных сред, а также моделей биологических объектов, в которых осуществляются процессы распознавания и мембранного транспорта. В таких устройствах электронная запись, хранение, передача и стирание информации должны быть реализованы на уровне одной молекулы или супрамолекулярного ансамбля. Однако платой за стремление к миниатюризации устройств являются затраты на преодоление фундаментальных и практических проблем, обусловленных необходимостью ввода и вьшода сигналов на уровне молекулярных объектов. Иными словами, механические и логические функции создаваемых структур должны быть не только контролируемы, но также обладать способностью к передаче выходного результата к другому компоненту. Важной составляющей этой проблемы является необходимость управления и, что не менее важно, мониторинга сборки сложных молекулярных агрегатов, способных выполнять заданные физические функции. Разработка методик, позволяющих осуществлять такое управление и интеграцию, может обеспечить реализацию ожиданий мирового сообщества в получении дешевых, мощных и ультра-миниатюрных приборов для вычислительной техники, оптоэлектроники, медицины и др.
Супрамолекулярные взаимодействия между различными молекулами в растворах и на поверхности могут быть использованы для образования сложных многокомпонентных систем. При современном уровне органической химии, способном предложить пути для сложных синтезов, и современной технологии, обеспечивающей средства для структурирования на субмикронном уровне, становится возможным проводить исследования в этом направлении. Однако для исследования и использования таких систем требуется создание новых методов анализа, отличающихся низким пределом обнаружения, высокой селективностью и экспрессностью, возможностью использования их "вне лаборатории" (on-site и on-line системы).
Одним из таких новых методов для изучения поведения супрамолекулярных систем является спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса (ППР), обладающая несомненными преимуществами перед громоздкими и сложными спектрометрами, проведение одного эксперимента на которых занимает довольно продолжительное время. Возможность спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса in situ оценивать оптические константы, геометрию тонких пленок и некоторые другие физические
характеристики иммобилизованных на поверхности веществ предполагает использование этого метода в качестве средства контроля за механическими и информационными функциями молекулярных машин. Также пристальное внимание привлекает поверхностный плазмонный резонанс в комбинации с электрохимическими измерениями. При такой комбинации открываются широкие возможности для изучения биоэлектрокаталитических свойств энзиматических электродов и создания новых оптических биосенсоров на их основе. Кроме того, одним из перспективных, но еще не достаточно освоенных направлений, является использование спектроскопии ППР для создания оптических сенсоров на основе молекулярно импринтированных полимеров.
В последние годы много исследований посвящено разработке электронных устройств на основе ультратонких пленок, обладающих новыми электрическими и оптическими свойствами. В этом отношении большое внимание уделяется проводящим полимерам, а также их сополимерам и композитным системам на их основе. Среди проводящих полимеров полианилин занимает важное место благодаря высокой химической стабильности как на воздухе, так и в воде, легкости перехода между редокс-состояниями, возможности использования при создании химических и биологических сенсоров, электрохромных экранов, фотоэлементов, батарей и др. При допировании полианилина протонными кислотами появляется возможность создания композитных матриц на основе этого полимера, в которые можно встраивать такие жизненно важные энзимы, как глюкозооксидазу или лактат-дегидрогеназу. Непроводящие, но меняющие свои физико-химические свойства полимеры, также представляют большой интерес, так как позволяют создавать управляемые мониторинговые системы, химические и биохимические оптические сенсоры, транспортные мембраны.
Целью работы является создание интегрированных супрамолекулярных систем на основе полимеров, кофакторов и энзимов, восприимчивых к электрохимическому, биохимическому и биоэлектрохимическому переключению редокс-состояний и осуществление оптического преобразования этих состояний с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса.
Научная новизна заключается в создании сложных интегрированных органических
электродов и пленок с электро- и биохимически переключаемыми редокс-функциями и
реализации оптического контроля этих функций с помощью спектроскопии поверхностного
плазмонного резонанса.
1. Впервые для ультратонких пленок полианилина исследованы обратимые эффекты
сорбции-десорбции воды при электрохимическом циклировании этого редокс-активного
полимера.
Впервые редокс-активная пленка берлинской лазури, нанесенная на модифицированный меркаптопропионовой кислотой золотой электрод, использована для получения переключаемой оптоэлектронной системы, в которой электрохимическая информация, характерная для трех редокс состояний, преобразована в оптическую с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
Создана композитная ультратонкая пленка на основе полианилина и полиакриловой кислоты, позволяющая получать супрамолекулярные переключаемые структуры, пригодные для работы в нейтральных средах.
Впервые исследовано оптическое преобразование электрокаталитического окисления никотинамидадениндинуклеотида полимерными пленками берлинской лазури и полианилина.
Разработаны композитные энзиматические электроды, в которых полианилин выступает в качестве посредника переноса электронов между такими энзимами как глюкозооксидаза, лактат-дегидрогеназа и глюкозо-дегидрогеназа и подложками электродов.
Впервые показана принципиальная возможность создания электрического контакта между пирролохинолинхинон(Р(3(5)-зависимой глюкозо-дегидрогеназой (GDH) и золотым электродом путем реконструирования ano-GDH на полианилиновой пленке, функционализированной PQQ-кофактором.
Показано, что в комбинации с электрохимическими методами спектроскопия ППР может быть использована как основа для датчиков на глюкозу, дигидро-никотинамид-аденин-динуклеотид (NADH) или лактат.
Разработан метод создания импринтированной полимерной матрицы, оптимизированной для исследования с помощью спектроскопии ППР, и впервые проведено неэлектрохимическое селективное определение редокс-кофакторов NAD+, NADP+, NADH и NADPH, основанное на принципе молекулярного импринтинга.
Практическая значимость работы. Разработаны чувствительные элементы оптических сенсоров на основе ультратонких полимерньи пленок. Продемонстрирована возможность количественного анализа in situ таких важных органических соединений, как глюкоза, лактат, кофакторы NAD+, NADP+, NADH и NADPH, участвующих в процессах жизнедеятельности. Высокая чувствительность метода поверхностного плазмонного резонанса и функциональная стабильность исследованных систем открывают перспективы для создания с помощью спектроскопии ППР молекулярных информационных и сенсорных устройств.
На защиту выносятся
результаты исследования оптического преобразования электрохимически индуцированных процессов набухания и усадки тонких пленок полианилина и композитных пленок полианилин/полиакриловая кислота;
экспериментальные данные по изучению редокс-состояний берлинской лазури методом поверхностного плазмонного резонанса;
способы модифицирования поверхности золотых электродов для создания чувствительных элементов сенсоров на такие вещества как глюкоза, лактат, кофакторы NAD+, NADP+, NADH и NADPH, и результаты исследований электрокаталитической, биокаталитической и биоэлектрокаталитической активности полученных тонкопленочньгх супрамолекулярных систем методом поверхностного плазмонного резонанса;
данные о селективности определения химически и структурно близких соединений методом ППР с импринтированньгми мембранами;
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures" (Казань, Россия, 2002), I Международной молодежной конференции-школе по синтезу и строению супрамолекулярных соединений (Казань, Россия, 2002), Международной конференции "II International Workshop on Molecularly Imprinted Polymers" (La Grande Motte, Франция, 2002), XVI Европейской конференции "Chemistry at Interfaces" (Владимир, Россия, 2003), Всероссийском семинаре "Структура и динамика молекулярных систем" (Йошкар-Ола, 2003). По результатам работы опубликованы 9 статей и тезисы 3 докладов на научных конференциях.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по молекулярным устройствам, обеспечению электрического контакта между редокс-энзимами и электродами, основным принципам молекулярного импринтинга и основам спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Вторая глава работы посвящена описанию объектов и методов исследования. В третьей главе диссертации представлены и обсуждены результаты исследований. Работа изложена на 142 страницах, включая 52 рисунка, 8 схем и 258 литературных ссылок.
Проблемы создания молекулярных информационных устройств
Несмотря на то, что в последние годы исследователями продемонстрировано большое число молекулярных информационных устройств, лишь немногие из них имели коммерческие перспективы. Это связано с множеством проблем, подстерегающих разработчиков на пути создания подобных молекулярных систем. На рисунке 1-2 продемонстрировано несколько принципов, положенных в основу функционирования таких систем, которые, однако, до сих пор остаются нереализованными вследствие возникших технических препятствий. На рисунке 1-2А показан (2)катенан, состоящий из двух сцепленных макроциклов, взаимная ориентация которых является функцией микросреды [9]. Изменение полярности растворителя вызывает механическое переключение катенана между двумя различными состояниями. К сожалению, простого способа считывания информации в этой системе до сих пор не предложено, и единственной возможностью определить состояние системы является метод ЯМР. На рисунке 1-2В показан другой (2)катенан [10]. В этой системе ориентация макроциклов по отношению друг к другу определяется степенью окисления иона меди, внедренного в систему, и ее состояние легко считывается путем определения цвета раствора. Различные координационные состояния двух конформаций дают различные спектры поглощения. Недостатком этого катенана при использовании его в качестве устройства хранения информации является время, требующееся для изомеризации - для проведения полного изменения состояния необходимо несколько дней. Одно время фульгиды широко разрабатывались в качестве устройств молекулярного переключения [И]. На рисунке 1-2С показана обратимая фотоциклизация фульгида [12]. При облучении светом с соответствующей длиной волны состояние молекулы может переключаться между открытой и закрытой формами, которые легко определяются методом абсорбционной спектроскопии. К сожалению, длина волны, при которой происходят изменения в спектре поглощения, совпадает с длиной волны, инициирующей изомеризацию, и, следовательно, состояние не может быть определено без уничтожения информации. Данный пример демонстрирует важность совместимости сигналов считывания и сигналов записи.
Кроме вышеприведенных недостатков, существуют другие проблемы, которые следует учитывать при исследовании молекулярных переключателей. Например, химическая нестабильность цис-изомера стильбена делает его цис-транс переключения непригодными для практического использования [12], а у множества других переключаемых молекул недостатком является их неполная изомеризация, или обратная изомеризация в термодинамически более устойчивое состояние, например, под действием температуры. Рисунок 1-2. Принципы функционирования молекулярных информационных устройств: (А) переключаемый растворителем (2)катенан, (В) редокс-переключаемый (2)катенан, (С) фульгид, подверженный фотопереключаемой циклизации.
В работах, посвященных созданию и изучению молекулярных устройств в растворах, отмечен ряд преимуществ этих систем перед устройствами в связанном состоянии [1]. Растворенное состояние позволяет использовать традиционные технологии для синтеза веществ в относительно больших количествах, которые потом можно анализировать тем или иным аналитическим методом. Пространственная свобода молекул в растворе также означает, что они обладают механической подвижностью, а отдельные функциональные группы не нуждаются в особом расположении по отношению к субстрату. В связи с этим в растворах были созданы достаточно сложные механические и супрамолекулярные системы. Также механическая подвижность, присущая растворенному состоянию, затрудняет интеграцию молекулярных структур в ансамбли, а адресацию отдельных групп делает практически невозможной.
С другой стороны, иммобилизация функциональных групп в монослоях или тонких пленках делает возможным создание устройств на поверхности и реализацию преимуществ таких иммобилизованных систем. В последнее время активно развиваются методики для их создания. В целом технологии приготовления можно разделить на три общие категории: ковалентная модификация [13], самоорганизация [14] и пленки Ленгмюра-Блоджетт [15]. Во многих случаях для получения требуемой поверхностной архитектуры используют комбинации этих технологий. Поверхности, ассоциированные с иммобилизованными устройствами могут быть интегрированы с аналитическими приборами, такими как пьезокристаллические резонаторы (т.е. пьезокварцевое микровзвешивание), электроды или подложки для спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса. Они могут применяться для проведения оптических и фотоэлектрохимических исследований и иметь широкий диапазон функций. Можно воспользоваться молекулами, синтезированными по классическим технологиям, и потом применять широкий диапазон современных методик для их иммобилизации. Однако, несмотря на эти преимущества, создание поверхностно интегрированных устройств сопряжено с трудностями. Небольшие количества материалов, используемых при поверхностных модификациях, требуют специальных идентификационных технологий, и эти трудности усугубляются негомогенностью многих поверхностных архитектур. Если химическая модификация проводится на поверхности, то либо выход реакции должен быть очень высоким, либо все продукты реакции и побочные продукты должны быть доброкачественными, так как очистить образец практически не представляется возможным. Особенно проблематичным является создание поверхностно связанных молекулярных архитектур из-за асимметричности поверхности раздела фаз, в то время как для большей эффективности устройства требуется, чтобы отдельные молекулы были расположены определенным образом относительно поверхности. В растворах оптическая активация молекулярных функций и электрохимическое преобразование фотоактивированньгх процессов требует относительно высоких концентраций молекулярных устройств и ограничивается диффузией. Эти проблемы могут быть решены при конструировании молекулярных устройств на поверхностях. Оптическую активацию редокс-функций на поверхностях можно рассматривать как основу для метода амперометрического преобразования оптических сигналов. Аналогично, электрохимическое переключение химических функций на поверхности можно использовать для оптического преобразования электронных сигналов.
Функционализированные посредниками полимерно-энзиматические матрицы
Золь-гелевые матрицы являются идеальными кандидатами для создания энзимосодержащих матриц. Они химически инертны, устойчивы к набуханию, работают при низких температурах и имеют регулируемую пористость [82]. До настоящего времени наиболее интенсивно изучались производные кремниевых алкоксидов, так как они недороги и кинетически малореакционноспособны. Имея такие исходные материалы, можно легко приготовить кремниевые золь-гели, допированные различными реагентами (например, энзимами, посредниками переноса электронов, кофакторами, активаторами и т.д.), .а характеристики конечной матрицы можно регулировать, корректируя технологические условия (рН, пропорции исходных веществ и т.д.). Примером такой системы является золь-гелевая матрица с ковалентно связанным ферроценовым посредником и иммобилизованным ферментом - глюкозооксидазой (рис. 1-14А) [94]. GOx сохраняет более 80% активности в золь-геле, а амперометрический отклик хорошо согласуется с теоретическими предсказаниями. Конструирование многослойных матриц, состоящих из золь-геля и энзима, открывает пути к созданию амперометрических биосенсоров на глюкозу [95] и L-лактат [96] с линейными характеристиками в широком диапазоне концентраций.
Электрические характеристики таких пленок можно улучшить посредством введения в смесь таких электропроводящих материалов как углеродный порошок или металлические частицы (рис. 1-14В). Электроды, изготовленные с такими добавками, сочетают достоинства как кремниевой матрицы (например, пористость и твердость), так и добавок (электрическая проводимость) [82]. Недавно углеродные частицы были успешно заменены золотыми нано-частицами, внедренными вместе с энзимом в пористую кремниевую матрицу [97].
В последнее десятилетие разработаны высокоэффективные амперометрические биосенсоры, основанные на углеродных пастообразных электродах [83]. Этот подход состоит в простом смешивании энзима, переносчика электронов и проводящего порошка для создания биосенсорной пасты. Модификация электрода слоем толстой углеродной пасты делает возможным регенерацию деактивированной поверхности простым полированием или срезанием, что приводит к образованию новой и полностью биоактивной поверхности. Основной проблемой при создании биосенсоров на углеродной пасте является установление эффективного электрического контакта. Посредники переноса электронов вводились в пасты, состоящие из графита и GOx, либо соединенными с частицами или энзимами, либо просто как свободные молекулы. Примерами таких посредников являются производные ферроцена (мономеры или полимеры) [98], бензохинон и функционализированные им полимеры [99], производные виологена [100], фталоцианин кобальта [101], гексацианоферрат меди [102] и другие соединения [83]. Электроды на графитовой пасте, содержащие другие редокс-энзимы с подходящими посредниками переноса электронов, использовались в качестве амперометрических биосенсоров на соответствующие субстраты [83].
Электроды на углеродных пастах использовались также в качестве подложек для систем, состоящих их нескольких энзимов. Например, ацетилхолинэстераза и холиноксидаза были совместно иммобилизованы в углеродной пасте либо вместе с мономером тетратиофульвалена [103], либо с эластичными полимерами, содержащими ферроцен [104], в качестве посредников переноса электронов. Гидролиз ацетилхолина биокатализируется ацетилхолинэстеразой, затем получающийся холин окисляется электрически контактирующей холиноксидазой, что дает аналитический амперометрический сигнал, соответствующий концентрации ацетилхолина.
Однако следует отметить, что технология углеродных паст не предлагает универсальный путь для создания любой необходимой системы. Некоторые энзимы, например фруктозодегидрогеназу [99] и альдозодегидрогеназу [105], до сих пор не удалось иммобилизовать в матрицу без потери активности. Существует возможность ввести эти энзимы на поверхность предварительно сформированного электрода на углеродной пасте и тем самым сохранить их биокаталитическую активность, однако эта методика фактически сводит на нет преимущества технологии углеродных паст [83]. До сих пор создание и оптимизация многокомпонентных матриц, состоящих их графитовых порошков, органических масел, энзимов, редокс-посредников, кофакторов и других материалов является предметом интенсивных исследований.
1.2.6 Оптимизация электрического контакта энзимов с электродом с помощью функционализированного посредником кофактора
Ранее уже отмечалось, что произвольная функционализация протеиновой основы группами-переносчиками электронов дает смесь продуктов, и состав ее можно определить электрохимически только приблизительно. Для того чтобы достичь наилучшего электронного контактирования, посредник нужно поместить в оптимальную позицию между редокс-центром и периферией энзима. В случае интегрированных на поверхности энзимов также необходимо оптимизировать ориентацию пары энзим-посредник по отношению к электроду. Эти требования были реализованы путем использования посредников, ковалентно присоединенных к кофактору энзима, или ковалентно пришитых как к кофактору, так и к поверхности электрода. Такое специфическое ковалентное присоединение позволяет расположить посредник в точно требуемом месте, что приводит к гораздо более однородному поведению молекул энзима в образце.
Реконструирование апо-флавоэнзимов FAD-кофакторами с ковалентно пришитыми переносчиками электронов Недавно были продемонстрированы новые методы для обеспечения электрического контакта между редокс-центрами энзимов и окружающей средой, основанные на реконструировании энзима [ 106]. В соответствии с этим подходом (рис. 1-15) из глюкозооксидазы или оксидазы D-аминокислот удаляли их редокс-центры, кофакторы FAD, для получения соответствующих апо-энзимов. К полусинтетическому амино-FAD ковалентно пришивали (б-ферроценметиламино)гексановую кислоту, и затем полученный бифункциональный редокс-активный ферроценовый FAD-кофактор встраивали в апо-глюкозооксидазу или апо-оксидазу D-аминокислот. Полученные полусинтетические энзимы проявляли биоэлектрокаталитические свойства при окислении глюкозы или D-аланина, соответственно. Таким образом, одиночная ферроценовая группа, являющаяся переносчиком электронов, придает этим "электроэнзимам" биоэлектрокаталитические характеристики, обеспечивая электрический контакт FAD-центра с поверхностью электрода.
Рисунок 1-15. Получение полусинтетического энзима методом реконструирования, заключающемся в удалении из энзима нативного FAD-кофактора и введении искусственной пары FAD-ферроцен в апо-энзим. 1.2.6.2 Поверхностное реконструирование апо-флавоэшимов на электродах, последовательно модифицированных переносчиком и FAD
Модификация золотой поверхности мультистабильными пленками берлинской лазури.
Анилин, серная кислота, сульфат натрия, гексацианоферрат калия, хлорид калия, нитрат калия, полиакриловая кислота (MW = 450000 гхмоль 1), глутаровый диальдегид, p-d-глюкоза, Ц+)-молочная кислота, хлорид натрия, хлорид кальция, 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота (HEPES), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), 4-морфолин-пропансульфоновая кислота (MOPS), акриламид, NTsI-метиленбисакриламид, М.НМ .М -тетраметилэтилендиамин, акриловая кислота, натриевые соли кофакторов (3-никотинамидадениндинуклеотида (NAD ), р-никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADP+) и их восстановленных форм NADH и NADPH соответственно, а также энзимы глюкозооксидаза (GOx, ЕС 1.1.3.4. из клеток Aspergillus niger), лактат-дегидрогеназа (LDH, ЕС 1.1.1.27 из кроличьих мышц, тип II) и глюкозо-дегидрогеназа (GDH, ЕС 1.1.99.17 из клеток Acinetobacter calcoaceticus) были приобретены в фирмах "Aldrich" или "Sigma" (США) и использовались без дальнейшей очистки.
Меркаптопропионовая кислота, диаминобутан, цистамин дигидрохлорид и пирролохинолин хинон (PQQ) были приобретены в фирме- "Fluka" (Германия) и использовались без дальнейшей очистки. 6-(2-аминоэтил)-флавинадениндинуклеотид (амино-FAD), Л 6-(2-аминоэтил)-р-никотинамидадениндинуклеотид (амино-NAD) и апо-глюкозооксидаза (ano-GOx) были синтезированы Андреасом Бюкманом (Германия) по методикам [212,213,214]. Апо-глюкозо-дегидрогеназа (апо-GDH) была приготовлена Фернандо Патольски (Израиль) в соответствии с опубликованной процедурой [215].
Особое внимание уделяли чистоте материалов, реактивов, растворов и посуды. Все растворы готовили на бидистиллированной, деионизированной воде, полученной на установке Seralpur Pro 90 CN.
Ультратонкие пленки полианилина получали электрохимически на покрытых золотом стеклянных подложках, используемых в дальнейшем для in situ ППР-электрохимических измерений. Полимеризация осуществлялась в потенциостатическом режиме при 0,8 В относительно серебряного квази-электрода сравнения в течение 5 с из водного 0.1 М раствора анилина. Раствор электролита содержал 0,1 М H2SO4 и 0,5 М Na2S04, рН 1,8. Для удаления остатков мономера полученный полимер промывали раствором электролита. Далее модифицированные полианилином электроды использовали для электрохимических-ППР измерений. Все измерения проводили в фоновом растворе электролита, состоящем из 0,1 М H2S04 и 0,5 М Na2S04, рН 1,8.
ППР-электроды на 2 часа погружали в 0,1 М раствор меркаптопропионовой кислоты. Затем, после тщательной промывки в бидистиллированной воде, модифицированные электроды помещали в электрохимическую ячейку. Электроосаждение берлинской лазури из раствора, содержащего 0,Ш Кз[Ре(СМ)б] и 0,1М FeCh, рН 7,0, проводили циклическим сканированием потенциалов (10 циклов) между -0,2 В и 1,3 В относительно серебряного квази-электрода сравнения (скорость сканирования 100 мВхсек"1). После тщательной отмывки от исходных веществ в бидистиллированной воде модифицированные берлинской лазурью электроды использовали для электрохимических-ППР измерений. Все измерения проводили в 0,1 М растворе KN03, рН 7,0.
Композитные пленки, состоящие из полианилина и полиакриловой кислоты, используемые в дальнейшем для биоэлектрохимических исследований, получали электрополимеризацией анилина на ППР-электродах в присутствии полиакриловой кислоты. Полимеризацию проводили на золотых электродах в электрохимической ячейке, содержащей 0,1 М анилина, 1,5 мгхмл"1 полиакриловой кислоты (MW 450000 гхмоль"1), 0,1 М H2SO4 и 0,5 М Na2S04, рН 1,8. Слои композитного полимера получали циклическим сканированием потенциала между -0,1 и 1,1 В относительно серебряного квази-электрода сравнения, со скоростью 100 мВхс 1. Полученные пленки тщательно промывали фоновым раствором электролита, состоящим из 0,1 М H2SO4 и 0,5 М Na2SC 4, рН 1,8, а затем бидистиллированной водой и 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,0.
Ковалентное связывание амино-FAD с карбоксильными группами, предоставляемыми композитной пленкой, состоящей из полианилина и полиакриловой кислоты, проводили методом карбодиимидной сшивки. Для этого электрод с нанесенной пленкой (см. раздел 2.1.4.) на 2 часа помещали в свежеприготовленный раствор 0,01 М HEPES-буфера, рН 7,2, содержащий 5x10"4 М амино-FAD и 1х10"3 М EDC при комнатной температуре. После этого электрод промывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0, для удаления непрореагировавшего амино-FAD. Далее электрод с FAD-функционализированной полимерной пленкой на 5 часов помещали в 0,1 М раствор фосфатного буфера, рН 7,0, содержащий 1 мгхмл 1 ano-GOx, при комнатной температуре. Полученный электрод промывали фосфатным буфером для удаления несвязанной ano-GOx, после чего композитный энзиматический электрод был готов для биоэлектрохимических исследований. Все последующие измерения проводили в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0.
Ковалентное связывание амино-NAD с карбоксильными группами, предоставляемыми композитной пленкой, состоящей из полианилина и полиакриловой кислоты, проводили методом карбодиимидной сшивки. Для этого электрод с нанесенной пленкой (см. раздел 2.1.4.) на 2 часа помещали в свежеприготовленный раствор 0,01 М HEPES-буфера, рН 7,2, содержащий 5x10"4 М амино-NAD и 1x10"3 М EDC при комнатной температуре. После этого электрод промывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,0, для удаления непрореагировавшего амино-NAD. Затем электрод с NAD-функционализированной композитной пленкой полианилин/полиакриловая кислота на 10 минут помещали в 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 1 мгхмл"1 LDH, для образования аффинного комплекса между NAD и лактат-дегидрогеназой. Этот электрод несколько секунд (для предотвращения разрушения аффинного комплекса) промывали фосфатным буфером, после чего немедленно помещали в 10 об. % раствор глутарового диальдегида в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. По окончании поперечной сшивки лактат-дегидрогеназы поверхность электрода промывали фосфатным буфером для удаления несвязанной LDH, после чего полученный энзиматический электрод использовали для электрохимических-ППР исследований. Все измерения проводили в 0,1 М растворе фосфатного буфера, рН 7,0.
Оптический контроль электрохимических преобразований редокс-активных пленок полианилина
Полианилин также окисляет NADH до NAD+ и, в принципе, мог бы быть использован для создания ППР-сенсора на NADH, аналогично берлинской лазури. Однако известно, что полианилин, рассмотренный в разделе 3.1.1, проявляет свои редокс-активные свойства только в кислых средах (рН 3), что делает невозможным его прямое использование для работы с редокс-энзимами или их кофакторами, которые обычно имеют максимальную активность в нейтральных растворах. Однако, как следует из недавно опубликованных сообщений, композитные полимеры на основе полианилина, допированного поливинилсульфоновой кислотой [239] или полиакриловой кислотой [240], проявляют высокую редокс-активность в нейтральных растворах. Для проверки этих данных, открывающих перспективы использования полианилина в качестве электрокатализатора окисления NADH, мы провели электрополимеризацию анилина на золотой пластине в присутствии полиакриловой кислоты, как показано на схеме 3-1.
Слой композитного полимера был получен циклическим сканированием потенциала между-0,1 и 1,1 В относительно серебряного квази-электрода сравнения со скоростью 100 мВхс"1. На рис. 3-6 представлена циклическая вольтамперограмма полученного полимерного слоя, записанная при рН = 7,0. Очевидно, что процесс, происходящий на модифицированном редокс-полимером золотом электроде, квази-обратим с расстоянием между катодным и анодным пиками, равным 85 мВ. Кулонометрический анализ окислительного (или восстановительного) пика полианилина, Е = 0,29 В, показывает, что плотность упаковки полианилина на поверхности электрода составляет 9,3х10"8 гхсм"2. На рис. 3-7 представлены спектр ППР, полученный для композитной пленки полианилин/полиакриловая кислота в водном растворе, рН 7,0 (кривая а), и теоретическая кривая (кривая Ь), смоделированная в соответствии с уравнением Френеля. В первом приближении п принимали равным 1,40. Теоретическая модель позволила оценить коэффициент преломления композитного полимера, состоящего из полианилина и полиакриловой кислоты, п = 1,393 + 0,04/, и толщину полимерного покрытия 5 « 90 нм. Мы допускали, что эта композитная пленка имеет однородную структуру и существенно не отличается по коэффициенту преломления от чистого полианилина.
На рис. 3-8 представлены спектры ППР восстановленного полианилина, (Ап)„, при потенциале, Е = -0,3 В, и окисленного полианилина (Ап2+)„, при потенциале Е = 0,6 В (кривые а и Ь, соответственно). Изменения спектров ППР при переходе (Ап)п в (Ап2+)„ обусловлены изменением коэффициента преломления полимера при окислении. Последовательность потенциалов, прикладываемых к электроду, модифицированному пленкой полианилин/полиакриловая кислота, при ступенчатом изменении потенциала между -0,3 В (состояние (Ап)п) и 0,6 В (состояние (An )п) и обратно (потенциалы прикладывали к электроду в течение 1,5 сек), показана на хроноамперограммах рис. 3-8 (вставка). Соответствующий этим переходам спектр поверхностного плазмонного резонанса изменяется циклически между спектрами окисленного и восстановленного состояния полимера, как показано на рис. 3-8, кривая с.
На рис. 3-9А показана зависимость изменения интенсивности отраженного света спектров ППР от времени при фиксированном угле падения (9 = 67,5) как результат последовательного изменения потенциала, приложенного к модифицированному электроду, между -0,3 В и 0,6 В в течение 20 с. В данном случае временной промежуток между электрическими импульсами был увеличен более чем на порядок (см. также хроноамперограмму, рис. 3-9В). Окисление (Ап)„ в (Ап2+)„ приводит к быстрому изменению интенсивности отражения, за которым следует медленное увеличение интенсивности отраженного света. Аналогично, восстановление (Ап2+)„ в (Ап)„ приводит к быстрому уменьшению интенсивности отраженного света, за которым следует ее медленное уменьшение. Быстрый рост интенсивности отраженного света при окислении (Ап)„ в (An )п соответствует изменению показателя преломления полимерной пленки в результате ее окисления. Медленный рост, наблюдаемый при окислении полимера, вызван набуханием окисленной пленки, которое происходит за счет поглощения противоионов и гидратации полимера. Аналогично, снижение интенсивности отраженного света, наблюдаемое при восстановлении (Ап2+)„, обусловлено изменением показателя преломления полимера а также усадкой в результате высвобождения противоионов и дегидратации пленки.
Математическое моделирование спектра ППР, полученного сразу после окисления полианилина, в предположении, что толщина окисленного полимера идентична толщине (Ап)„ (90 нм, т.к. набуханием полимера за этот промежуток времени можно пренебречь), дает коэффициент преломления п = 1,389+0,47/. Теоретическое моделирование спектра ППР окисленного полимера после набухания, проведенное с использованием уже полученных значений коэффициента преломления для (An )п, дает толщину полимера 120 нм. Таким образом, толщина полимера увеличивается на 30 нм вследствие набухания, вызванного окислением полимера. В свою очередь, теоретическое моделирование спектра ППР пленки (Ап)п, полученного сразу после восстановления (Ап2+)„ в (Ап)п, дает толщину полимера, 5 = 120 нм, что соответствует толщине набухшей пленки. Моделирование спектра ППР, полученного после усадки восстановленного полимера, дает исходную толщину 5 = 90 нм. Полученные результаты показывают полную обратимость процессов набухания-усадки полимера, вызванных циклическими изменениями потенциала между -0,3 В и 0,6 В. Анализ кинетики изменения интенсивности отраженного света приводит к константе скорости набухания пленки, кп = З.бхЮ"4 с 1, и константе скорости усадки, ку = 2ДХІ0"4 с 1, для окисленного и восстановленного полимера, соответственно. Эти константы скорости, полученные для композиционной пленки полианилин/полиакриловая кислота при рН = 7,0, близки полученным для пленки полианилина при рН = 1,8 (см. раздел 3.1.1). Интенсивность отраженного света обратимо изменяется между высокими и низкими значениями при электрохимическом сканировании полимерной пленки между состояниями (Ап2+)п и (Ап)п, соответственно. Таким образом, данную систему можно рассматривать как своего рода "электрохимический переключатель", в котором оптический сигнал ППР дает информацию о состоянии полимерной пленки типа "ДаТ Нет".
