Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 .Высокодисперсный диоксид кремния: синтез, структура и свойства 9
1.1.1. Структура и физико-химические свойства частиц высокодисперсного диоксида кремния 9
1.1.2. Методы синтеза аморфного диоксида кремния. "Золь-гель"-синтез, влияние условий синтеза на свойства частиц диоксида кремния 13
1.1.3. Модификация диоксида кремния. Органо-неорганические гибридные материалы 23
1.2. Белки, их структура, состояние в растворе. Человеческий сывороточный альбумин 27
1.3. Адсорбция белков на твердых поверхностях из растворов 31
1.3.1. Механизм адсорбции. Физическая и химическая адсорбция белковых молекул 31
L.3.2. Структурные изменения белка, вызванные адсорбцией. Влияние химических свойств поверхности, а также природы белка на их
адсорбцию на твердых поверхностях 36
1.3.3. Термодинамические характеристики адсорбции белков на твердых" поверхностях из "растворов 41
Глава 2. Экспериментальная часть 51
2.1. Характеристика используемых реактивов 51
2.2. Синтез порошков немодифицированного и модифицированного диоксида кремния 54
2.3. Методика проведения эксперимента по адсорбции/десорбции человеческого сывороточного альбумина на синтезированных материалах 57
2.4. Экспериментальные методы исследования. Оборудование 58
Глава 3. Обсуждение результатов
3.1. Свойства порошков диоксида кремния 80
3.1.1. Идентификация порошков 80
3.1.2. Физические характеристики поверхности порошков немодифицированного и модифицированного диоксида кремния ... 84
3.1.3. Исследование структурированности и термической устойчивости синтезированных материалов диоксида кремния 87
3.1.4. Размер частиц синтезированных порошков диоксида кремния по данным атомно-силовой микроскопии 90
3.2. Исследование адсорбции человеческого сывороточного альбумина на синтезированных порошках диоксида кремния и свойства образовавшихся композитов 92
3.2.1. Идентификация композитов (ИК-спектроскопия) 92
3.2.2. Адсорбция человеческого сывороточного альбумина на порошках диоксида кремния. Влияние природы поверхностных функциональных групп синтезированных материалов диоксида кремния на количественное связывание белка 94
3.2.3. Размеры частиц композитов синтезированных материалов с белком 104
3.2.4. Исследование структурных изменений белка, вызванных адсорбцией на синтезированных материалах, методом дифференциальной сканирующей калориметрии 106
3.2.5. Тепловые эффекты адсорбции человеческого сывороточного альбумина на поверхностях синтезированных порошков
Основные итоги и выводы 115
Список литературы
- Структура и физико-химические свойства частиц высокодисперсного диоксида кремния
- Синтез порошков немодифицированного и модифицированного диоксида кремния
- Физические характеристики поверхности порошков немодифицированного и модифицированного диоксида кремния
- Адсорбция человеческого сывороточного альбумина на порошках диоксида кремния. Влияние природы поверхностных функциональных групп синтезированных материалов диоксида кремния на количественное связывание белка
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из важнейших направлений развития современной биотехнологии является разработка транспортных систем для доставки лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Это связано с тем, что лекарственные транспортные системы способствуют целенаправленной доставке препарата, могут облегчить проникновения препарата внутрь клетки, доставить его дозировано, обеспечить его пролонгированное действие. Важнейшей группой лекарственных препаратов являются иммуномодуляторы – природные или синтетические вещества, часто имеющие белковую природу. Для создания транспортной системы для белкового препарата необходимо подобрать подходящую матрицу для его иммобилизации. В качестве такой матрицы нередко предлагаются частицы аморфного диоксида кремния (Smirnova I., Mamic J., Arlt W. Langmuir, 2003; Pasqula L., Cundari S., Ceresa C., G. C. Curr. Med. Chem. 2009; Ahola M., Kortesuo P., Kangasniemi I., Kiesvaara J., Yli-Urpo A. Int. J. Pharm. 2000), который в настоящее время широко используется клинически. Наиболее простым методом иммобилизации лекарственного препарата является его адсорбция на поверхности диоксида кремния. Количественные и качественные характеристики адсорбции белка будут в значительной степени определяться химической природой поверхности. Поэтому закрепление на поверхности диоксида кремния слоя химически привитых функциональных групп различной природы открывает богатые возможности контролирования процесса адсорбции препарата на поверхности носителя, что позволяет осуществить выбор носителя с оптимальными свойствами. В настоящее время, несмотря на многочисленные экспериментальные работы в этой области, систематические исследования, посвященные данной проблеме, отсутствуют. В литературе содержатся отдельные сведения о том, как влияет модификация поверхности диоксида кремния на физические свойства частиц. Имеется разрозненная информация о количественных и качественных характеристиках адсорбции белковых молекул на поверхности гидрофильных и гидрофобных частиц, часто принципиально отличающихся природой своей матрицы. Поэтому для решения указанной биомедицинской проблемы всестороннее исследование влияния физико-химических особенностей поверхности частиц диоксида кремния на адсорбцию лекарственного препарата белковой природы является актуальной проблемой. В данной работе указанные исследования проведены на модельном соединении иммуномодулятора – человеческом сывороточном альбумине.
Цель работы заключается в исследовании влияния химической природы поверхности материалов на основе диоксида кремния на их физико-химические свойства и адсорбцию человеческого сывороточного альбумина с целью разработки носителя для лекарственного препарата белковой природы.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
синтезировать образцы диоксида кремния с различными функциональными группами на поверхности, исследовать поверхностные свойства полученных материалов и определить размеры их частиц;
изучить влияние поверхностных функциональных групп диоксида кремния на количество адсорбированного белка, на структурные изменения белка, вызванные адсорбцией, на тепловые эффекты взаимодействия белка с поверхностями синтезированных материалов;
выявить наиболее перспективный носитель для создания транспортной системы лекарственного препарата белковой природы.
Научная новизна. В представленной работе впервые синтезирован ряд материалов на основе аморфного диоксида кремния с различными функциональными группами на поверхности (амино-, гидроксильные, метильные группы), имеющие определенные поверхностные характеристики (удельную поверхность, размер, форму и объем пор), а также размер частиц. Установлены закономерности влияние химического модифицирования на параметры пористой структуры полученных материалов. Впервые проведено всестороннее систематическое изучение процесса адсорбции человеческого сывороточного альбумина на материалах диоксида кремния с различными по природе поверхностными функциональными группами, которое дает информацию о том, в каком количестве, в каком виде и с какой энергией белок адсорбируется на указанных материалах. Рассчитана и проанализирована максимальная адсорбционная емкость полученных материалов по отношению к человеческому сывороточному альбумину. В результате проведенных исследований впервые показано, что белок в составе композита с диоксидом кремния, модифицированного первичными аминогруппами, может частично сохранять свои функциональные свойства при достаточно высокой величине адсорбции белка. Впервые определены тепловые эффекты адсорбции белка на синтезированных материалах. Полученные результаты позволили выделить АПТЭС-модифицированный и ПЭИ-модифицированный диоксид кремния как перспективные носители лекарственного препарата белковой природы.
Практичная значимость. Синтезированные материалы на основе диоксида кремния с указанными характеристиками поверхности и термостабильности и предложенные в работе подходы к выбору оптимальных адсорбентов могут найти применение в промышленности, биотехнологии, медицины, фармацевтики при разработке функциональных материалов с заданными свойствами. Они могут быть также использованы при разработке катализаторов, поглотителей, стационарных фаз для хроматографических колонок и пр. Данные по количественным и качественным характеристикам адсорбции белка могут найти применение при создании новых материалов медицинского назначения, например, биосенсоров, иммуноадсорбентов, биосовместимых материалов для имплататов, носителей для лекарственных препаратов белкового происхождения. На основе полученных результатов в настоящее время ведется разработка лекарственной транспортной наносистемы для лечения эндометриоза.
Достоверность полученных результатов работы обеспечена использованием прецизионного современного оборудования при проведении эксперимента, согласованностью выводов, полученных с помощью различных методов исследования, между собой и с положениями физической химии.
Вклад автора состоит в подготовке и проведении эксперимента, обработке экспериментальных данных и анализе полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на III, IV Региональных конференциях молодых ученых «Теоретическая экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново 2008, 2009гг.), первом Международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2008 г.), V Международной научной конференции «Кинетика и механизмы кристаллизации для нанотехнологий, техники и медицины» (Иваново 2008г.), VI Международной научной конференциии «Кинетика и механизмы кристаллизации. Самоорганизация при фазообразовании» (Иваново 2010г.), I, II Международных научных конференции «Современные методы в теоретической и экспериментальной электрохимии» (Плёс 2008г., 2010г.), I Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва 2009г.), Второй конференции с элементами научной школы для молодежи «Органические и гибридные наноматериалы» (Иваново 2009г.), 13 Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино 2009г.), III Всероссийской конференции «Высокие медицинские технологии – 2009» (Москва 2009г.), Всероссийской конференции «Физико-химические аспекты технологии наноматериалов, их свойства и применение» (Москва 2009г.), Всероссийской конференции «Функциональные наноматериалы и высокочистые вещества» с элементами научной школы для молодежи (Москва 2009г.), конференции молодых ученых секции ученого совета ИФХЭ РАН «Физикохимия нано- и супрамолекулярных систем – 2009» (Москва 2009г.), III Международной конференции «Функциональные наноматериалы и высокочистые вещества» с элементами научной школы для молодежи (Суздаль 2010г.).
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 6 статьях, опубликованных в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных ВАК Российской Федерации для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, а также в тезисах 19 докладов на конференциях различного уровня.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах, содержит 13 таблиц, 31 рисунок, 6 схем и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, основных результатов и выводов, библиографического списка, содержащего 214 ссылок на цитируемые литературные источники.
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 09-03-97513 р_центр_а.
Структура и физико-химические свойства частиц высокодисперсного диоксида кремния
Кроме одностадийного синтеза в литературе описан также двухстадийный золь-гель синтез [33, 49-51]: кислотно-катализированный гидролиз на первой стадии и катализируемая основанием реакция конденсации на второй стадии синтеза. В этом методе процесс гелеобразования занимает долгое время, так как спирт, образовавшийся во время гидролиза, имеет тенденцию смещать равновесие в сторону исходных веществ. Этот метод был усовершенствован авторами работы [51]. Чтобы обойти вышеупомянутые недостатки, они удаляли получаемый в процессе реакции спирт после первой стадии с помощью отгонки с заменой спирта на апротонный растворитель (например, ацетонитрил). Вторая стадия проводилась при добавлении основания (например, гидроксида аммония) в большом избытке неспиртового растворителя. Прозрачные, монолитные аэрогели диоксида кремния, полученные этим методом, имели низкую плотность 0.003 г/см (пористость 99.8 %). Недостатком этого подхода является трудное удаление спирта с помощью дистилляции после завершения первой стадии. Smirnova и др. [33] использовали двухстадийный метод синтеза для получения аэрогелей диоксида кремния с плотностью 0.03 гсм 3.
Как показывают литературные данные [35, 52], температура, при которой проводится синтез, оказывает существенное влияние на структуру продукта и размер его частиц. Рост температуры приводит к образованию более разветвленных и, следовательно, менее плотно упакованных структур [35]. При пониженной температуре процессы гидролиза и конденсации протекают медленно, что способствует росту полидисперсности получаемого материала. С увеличением температуры распределение частиц по размерам сужается [52].
Для гомогенизации смеси исходных компонентов при золь-гель синтезе необходим сорастворитель. Для этой цели используются самые различные растворители, например, спирты, тетрагидрофуран, ацетон и др. [23]. В работе [41] проведено сравнение трех растворителей, используемых в золь-гель синтезе: тетрагидрофурана, метанола и этанола. Показано, что в отличие от указанных спиртов применение тетрагидрофурана приводит к высокому гелеобразованию при сушке. Метанол и этанол рекомендуются в качестве сорастворителей, так как гель не образуется в процессе сушки, а также потому, что эти растворители обеспечивают высокую скорость гидролиза, что способствует образованию частиц малого размера [41]. Однако в работе [23] высказано противоположное мнение: спирты могут участвовать в реакции этерификации и таким образом уменьшать скорость гидролиза. Обзор литературных источников показывает, что одноатомные спирты являются наиболее часто используемыми растворителями в; золь-гель синтезе частиц диоксида кремния [32, 34, 37, 39,41, 46, 47].
В предыдущих разделах было показано, что аморфный диоксид . кремния обладает рядом практически значимых свойств,, например, отличными механическими; и оптическими свойствами, термической устойчивостью, развитой поверхностью; и т.п. Модифицирование матрицы диоксида кремния органическими компонентами может придать материалу новые свойства и дополнительную; функциональность (гидрофильность и гидрофобность, кислотность, основность, пластичность и:, следовательно, изменить его реакционную способность. Образующиеся органо-неорганические гибридные материалы обладают преимуществами органической и неорганической фазы и могут приобретать уникальные свойства, не характерные для индивидуальных фаз.
Модифицируя . частицы диоксида кремния различными функциональными. группами, можно управлять процессами адсорбции различных веществ на этой поверхности. Так, например, частицы диоксида кремния с тиольными группами на поверхности проявляют высокую адсорбционную способность по отношению к ионам тяжелых металлов (Hg, Ag, Cd) [53]. Введение определенных функциональных групп в матрицу диоксида кремния приводит к селективной адсорбции белков [54], а также может управлять количеством адсорбированного белка [55-58] и его конформационным состоянием [59, 60].
В зависимости от структурных особенностей органо-неорганические гибридные материалы можно разделить на два класса [61, 62]. К I классу относятся гибридные материалы, в которых органическая фаза внедрена внутрь неорганической матрицы. Синтез этого класса соединений обычно проводится путем формирования неорганической матрицы в присутствии органической фазы (например, полимера). В этом случае органическая и неорганическая фазы связаны только слабыми взаимодействиями (ван-дер-ваальсовыми, электростатическими, водородными связями). Органический компонент выступает в качестве темплата, который формирует структуру получаемого материала [63-65].
К II классу относятся гибридные материалы, в которых органическая и неорганическая фазы связаны ковалентно. Синтез таких гибридных материалов может быть осуществлен двумя способами: 1) соконденсацией, когда происходит совместный гидролиз и конденсация основного прекурсора (например, тетралкоксисилана) и модифицирующего агента (органосилана) [54, 60, 66-72]; 2) методом двухступенчатого синтеза (post-modification), когда органосилан взаимодействует с силанольными группами уже сформированной матрицы диоксида кремния [73-75]. Процесс соконденсации протекает согласно следующей схеме: гидролиз тетраалкоксисилана: OR
В результате функциональные группы ковалентно присоединены к поверхности частицы диоксида кремния. Схема процесса модификации диоксида кремния двухступенчатым методом представлена ниже [70]. Модифицирующим агентом служит хлорпропилтрихлорсилан.
Находящиеся на поверхности диоксида кремния силанольные группы способны образовывать водородные связи с функционализирующими силановыми агентами. Далее, по мере удаления воды происходит образование ковалентных связей с молекулами. Причем, между каждой силановой молекулой и поверхностью образуется одна связь.
Синтез порошков немодифицированного и модифицированного диоксида кремния
Этиловый спирт, С2Н5ОН (содержание этанола 96%) - жидкость с характерным запахом. Молекулярная масса 46,06 г-моль"1. Плотность 0,8008 г-см" . Температура плавления Тпл= - 114,15 С. Температура испарения Тисп= 13,0 С. Температура кипения Ткип= 78,39 С [162, 163]. Производитель - "Спиртзавод Петровский", Россия.
Водный раствор аммиака, NH4OH (содержание NH3 25%) - бесцветная жидкость, имеющая отчетливый запах «нашатырного спирта». Плотность 25% раствора NH3 составляет 0,91 г-см"3 [162, 163].
Бромид калия, КВг - бесцветное кристаллическое вещество. Плотность 2,75 г-см"3. Растворим в воде (растворимость 65.6т в 100 г Н20 при 20 С и 105 г при 100 С) мало растворим в эфире. Температура плавления ТПл.= 748 С [162, 163]. В работе использовался КВг фирмы Acros 99+%. Так как КВг высоко гигроскопичен, перед использованием он высушивался в течение 2-х часов при температуре 200 С, хранился в эксикаторе.
Гидрофосфат натрия, Na2HP04-12Н20 - бесцветный или белый кристаллический порошок. Растворим в воде (примерно 7 г в 100 г воды). Молекулярная масса М=358.14 г-моль"1. Температур плавления ТПЛ=95С[162, 163].
Дигидрофосфат натрия, NaH2P04"2H20 - молекулярная масса М= 156.01 г-моль"1. Температур плавления Тпл= 60 С [162, 163]. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный (Химмед, чда) и натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (Химмед, хч) использовались
для приготовления фосфатного буфера (рН = 7.4) на основе свежеперегнанного бидистиллята.
Все реагенты использовались без дополнительной очистки. Для приготовления растворов была использована бидистиллированная вода.
Золь-гель синтез немодифицированного диоксида кремния (SiO n-Тетраэтоксисилан (ТЭОС) использовался в качестве прекурсора (10 мл), смешивался с этиловым спиртом - ректификатом (80 мл). Добавляли воду, чтобы запустить процесс гидролиза. Водный раствор 25% аммиака (2,5 г) использовался в качестве катализатора. Смесь перемешивалась при комнатной температуре 24 часа [32]. Полученная суспензия белого цвета трижды промывалась дистиллированной водой и центрифугировалась. Осадок высушивался в, потоке теплого воздуха при 100 С в течение нескольких дней. Полученный, продукт представлял собой порошок белого цвета. Схема синтеза немодифицированного диоксида кремния приведена ниже.
Схема 2. Схема синтеза немодифицированного диоксида кремния. Золь-гель синтез АПТЭС-модифицированного диоксида кремния.
К раствору прекурсора (тетраэтоксисилан) (10 мл.) в этаноле (96 %) (53 мл.) добавлялась модифицирующая добавка 3-аминопропил-триэтоксисилан (3.3 мл.) [68]. Синтез АПТЭС-модифицированного диоксида кремния проводился без добавления воды. Смесь перемешивалась в течение суток при комнатной температуре. Полученная суспензия трижды промывалась, центрифугировалась и высушивалась. Продукт представлял собой порошок белого цвета.
Схема 3. Схема синтеза диоксида кремния, модифицированного с помощью 3-аминопропилтриэтоксисилана (АПТЭС). Золь-гель синтез ПЭИ-модифщированного диоксида кремния. К раствору прекурсора (тетраэтоксисилан) (10 мл) в этаноле (96 %) (80 мл.) добавлялся водный раствор полиэтиленимина (ПЭИ) [13]. Смесь перемешивалась в течение суток при комнатной температуре. Полученная суспензия промывалась и высушивалась, как описано выше. Продукт представлял собой порошок белого цвета.
Схема 4. Схема синтеза диоксида кремния, модифицированного с помощью полиэтиленимина (ПЭИ). Золь-гель синтез метилмодифицированного диоксида кремния. К раствору прекурсора (тетраэтоксисилан) (10 мл) в этаноле (96 %) (25 мл) добавлялась модифицирующая добавка метилтриэтоксисилан (9.5 мл) и вода (3 мл) В качестве катализатора добавлялся водный раствор 25% аммиака (0,5 мл) [41]. Смесь перемешивалась в течение суток при комнатной температуре. Полученная суспензия трижды промывалась, центрифугировалась и высушивалась. Продукт представлял собой порошок белого цвета.
Схема 5. Схема синтеза метилмодифицированного диоксида кремния. 2.3. Методика проведения эксперимента по адсорбции/десорбции человеческого сывороточного альбумина на синтезированных материалах
Адсорбция человеческого сывороточного альбумина на порошках немодифицированного диоксида кремния и его модифицированных продуктов (АПТЭС-, ПЭИ-модифицированный и метилмодифицированный диоксид кремния) проводилась из фосфатного буферного раствора с рН = 7,2- 7,4. Для растворения человеческого сывороточного альбумина использовался 50 мМ фосфатный буферный раствор, приготовленный на основе бидистиллированной воды.
Приготовление 50 мМ фосфатного буфера, рН = 7,2+7,4. Для приготовления буфера 8,95 г Na2HP04,12H20 растворяли в 500 мл бидистиллированной воды. Далее 0,78 NaEtPO EbO растворяли в 100 мл бидистиллированной воды. Отмеряли 409 мл раствора (Na2HP04 12H20) и добавляли раствор (NaH2P04-2H20) до общего объема 500 мл. Проверяли рН и при необходимости подтитровывали буфер.
Адсорбция/десорбция белка на порошках диоксида кремния. К раствору белка в фосфатном буфере добавлялась навеска адсорбента. Концентрация белка в буфере изменялась в интервале 0.2 - 4 мг/мл. Чтобы получить зависимость количества адсорбированного белка от его концентрации в растворе, в буферный раствор белка определенной концентрации каждый раз добавлялась одинаковая навеска адсорбента. Смесь осторожно перемешивалась. Надосадочный раствор отделялся от частиц образовавшегося композита путем центрифугирования на ультрацентрифуге Eppendorf MiniSpin Plus (Germany) в течение 15 минут при 10000 об/мин. Количество белка, оставшегося в надосадочном растворе, определялось методом УФ-спектроскопии (см. раздел 3.4. УФ-спектроскопия) после адсорбции в течение 10, 20 минут и 24 часов. Эксперимент показал, что количество адсорбированного человеческого
Физические характеристики поверхности порошков немодифицированного и модифицированного диоксида кремния
Прибор Photocor позволяет определять коэффициент диффузии дисперсных частиц, размер которых лежит в диапазоне от 10" до 10" м, путем анализа динамических флуктуации интенсивности рассеянного света. В качестве образцов рассматриваются дисперсные системы твердое-жидкость (золи) и жидкость-жидкость (эмульсии). Коррелятор Photocor-SP может измерить любые корреляционные функции (экспоненциальные, периодические и пр.). Однако установленное программное обеспечение для обработки данных рассчитано только на экспоненциальные функции, которые имеют место при измерении размеров частиц. Полученная корреляционная функция обрабатывается по двум методам: методу кумулянтов и методу регуляризации. Одним из основных узлов прибора является He-Ne лазер с рабочей длиной волны 360-680 нм. Расчет среднего гидродинамического радиуса частиц, а также распределение частиц по размеру проводился на основании предположения о том, что частицы являются сферическими, используя программы Photocor и DynaLS. Для исследования данным методом был приготовлен образец суспензии объемом 5 мл с оптимальной концентрацией дисперсной фазы. Погрешность метода составляет не более 2 %.
Атомно-силовая микроскопия. Атомно-силовой микроскоп - сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения, основанный на взаимодействии зонда кантиливера (иглы) с поверхностью исследуемого образца. Атомно-силовая микроскопия позволяет анализировать на атомном уровне структуру самых разнообразных твердых материалов - стекла, керамики, пластиков, металлов, полупроводников, а также биологических объектов - кристаллов аминокислот, белков, клеточных мембран. Разрешающая способность метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали. Смещая зонд по горизонтали можно получить серию рельефов и с помощью компьютера построить трехмерное изображение.
Образцы полученных различных диоксидов кремния, а также образцы с адсорбированным белком были исследованы с помощью атомно-силового микроскопа Solver 47 PRO (NT-MDT). Для этого каплю разбавленной суспензии помещали на предметное стекло или поликор до полного высушивания. Затем проводили сканирование образца. система обратной связи система, отслеживающая отклонение зонда образец Пьезокерамическое сканирующее устройство
Метод термического анализа является одним из наиболее высокочувствительных и современных методов фазового анализа. Сущность метода состоит в исследовании физико-химических и химических процессов, происходящих в веществе в условиях программированного изменения температуры. Метод позволяет определять температуры фазовых переходов и строить фазовые диаграммы по сопровождающим эти превращения тепловым эффектам. Термогравиметрические измерения были выполнены на дериватографе 1000 D [177]. Навеска образцов составляла 80 - 90 мг. Скорость нагрева была 5 С/мин. Нагрев осуществлялся от комнатной температуры 25 С до 1000 С.
Метод ДСК основан на измерении теплового потока W (или AQ) между исследуемым образцом и эталоном в строго контролируемых температурных условиях. Под этими условиями обычно подразумевается повышение температуры по заданной программе (реже - понижение температуры). ДСК - измерения были выполнены, используя дифференциально-сканирующий калориметр 204 F1 фирмы Netzsch.(Германия). Алюминиевый тигель для образца заполнялся исследуемым порошком в количестве 5-7 мг. Пустой алюминиевый тигель служил в качестве эталона. Образцы перед сканированием предварительно выдерживали в калориметре в течение двух часов при комнатной температуре. Эксперимент проводили в температурном диапазоне 20 С -160 С в атмосфере аргона. Скорость нагревания составляла 10 С/мин. ДСК-кривые были скорректированы базовой линией, полученной для двух пустых тиглей в тех же условиях. ДСК-измерения каждого образца были повторены трижды. Погрешность в измерении составляла Т = ± 0.1% С, АН = ± 0.5 Джт"1. УФ-спектроскопия Одно из наиболее широко используемых применений УФ-спектроскопии - количественное определение концентрации веществ в газах и растворах. УФ-спектроскопия основана на облучении вещества монохроматическим УФ-излучением, длина волны которого изменяется со временем. Спектры уникальны для каждого вещества, на этом основывается идентификация отдельных веществ в смеси, а также их количественное измерение. Поскольку молекулы белка — человеческого сывороточного альбумина содержат в своем составе остатки ароматических аминокислот, то белок имеет характеристическую полосу поглощения в УФ-области при длине волны X = 278 нм, характерную для триптофана. Количество адсорбированного белка из раствора определялось по методу Лоури [99] как разница между его содержанием в растворе до и после адсорбции. К раствору белка в буфере (10 мл) добавлялась навеска адсорбента (0.1 г). Концентрация белка изменялась в интервале 0.2- -4.0 мг-мл" .
Полученная суспензия после адсорбции подвергалась центрифугированию на ультрацентрифуге фирмы Eppendorff (Германия) в течение 15 минут при скорости 10000 об/мин. Количество белка в надосадочном растворе определялось спектрофотометрически по интенсивности полосы поглощения белка при длине волны X = 278 нм. (єт = 36000 М"1 см"1) [124]. УФ-спектры растворов белка записывались с помощью однолучевого спектрометра Agilent используя 10 мм кварцевые кюветы. В качестве примера на рис. 2.4.1 приведены УФ-спектры человеческого сывороточного альбумина после адсорбции при начальной концентрации белка: Со(ЧСА) = 3.68-10 5 моль-л"1 (2.5 мг-мл"1).
УФ-спектры растворов человеческого сывороточного альбумина после адсорбции на порошках диоксида кремния при различных исходных концентрациях белка: 1- раствор белка в буфере; 2- после адсорбции на немодифицированном диоксиде кремния; 3- после адсорбции на ПЭИ-модифицированном диоксиде кремния; 4- после адсорбции на метилмодифицированном диоксиде кремния; 5- после адсорбции на АПТЭС-модифицированном диоксиде кремния. Концентрация белка, оставшегося в растворе после адсорбции, определялась из калибровочной прямой, построенной на основании величин поглощения растворов белка в буфере известной концентрации (рис. 2.4.2).
Адсорбция человеческого сывороточного альбумина на порошках диоксида кремния. Влияние природы поверхностных функциональных групп синтезированных материалов диоксида кремния на количественное связывание белка
Количество адсорбированного белка на границе раздела фаз твердое вещество-раствор зависит от многих факторов: от свойств поверхности адсорбента, от структуры и свойств белка, от свойств раствора, из которого происходит адсорбция. В данном случае влияние двух последних факторов исключается, так как изучается адсорбция одного белка из растворов с одними и теми же свойствами. Поэтому количественная адсорбция человеческого сывороточного альбумина будет определяться химическими свойствами поверхности синтезированных материалов.
При рН = 7.4 суммарный заряд молекулы человеческого сывороточного альбумина отрицателен (рН р1). Поверхности частиц диоксида кремния, модифицированного аминогруппами (АПТЭС- и ПЭИ-модифицированный диоксид кремния), при данном значении рН несут положительный заряд. Поэтому разумно предположить, что движущей силой адсорбции белка на этих порошках являются электростатические силы притяжения. В литературе имеется большое количество исследований, свидетельствующих о том, что кулоновские силы притяжения управляют адсорбцией белков на поверхностях, когда поверхности адсорбента и белка заряжены противоположно [4, 13, 122-129]. Большее количество адсорбированного белка на поверхности ПЭИ-модифицированного диоксида кремния по сравнению с АПТЭС-модифицированным диоксидом кремния можно объяснить, как указывалось выше, большим количеством центров связывания белка на поверхности ПЭИ-модифицированного диоксида кремния.
Однако, согласно литературным данным, поверхность немодифицированного диоксида кремния при рН = 7.4 заряжена отрицательно [18, 124]. Отрицательный заряд появляется на поверхности этих частиц в результате депротонирования силанольных групп при рН 2 и образования ионизированных групп =SiO":
Изотерма адсорбции человеческого сывороточного альбумина на немодифицированном диоксиде кремния (рис. 3.2.2, изотерма 1) свидетельствует о том, что в данном случае адсорбция белка происходит в условиях электростатического отталкивания (поверхности белка и диоксида кремния заряжены отрицательно). Подобное явление наблюдалось, например, при адсорбции человеческого сывороточного альбумина на гидрофильном диоксиде кремния (Spherosil ХОВ) [131], иммуноглобулинов на поверхности диоксида кремния [130]. Такая адсорбция особенно характерна для структурно-подвижных белков или «мягких» белков, к которым относится человеческий сывороточный альбумин [83, 201]. Эти белки достаточно легко «подстраивают» свою структуру под оптимальное взаимодействие со связывающими центрами поверхности, теряя при этом свою нативную структуру и способствуя росту энтропии системы. Поэтому адсорбция в этом случае происходит вопреки силам электростатического отталкивания за счет благоприятного энтропийного вклада.
Следует отметить, что на немодифицированном диоксиде кремния белка адсорбируется в два раза больше, чем на АПТЭС-модифицированном диоксиде кремния (табл. 3.2.1). Как уже было показано, движущие силы адсорбции человеческого сывороточного альбумина на этих поверхностях разные.
Из всех синтезированных материалов наименьшей адсорбционной способностью по отношению к человеческому сывороточному альбумину обладает метилмодифицированный диоксид кремния (рис. 3.2.2, изотерма 3). Этот результат является неожиданным, если учесть то, что, согласно литературным данным, человеческий сывороточный альбумин рассматривается как гидрофобный белок [77, 98]. Однако многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что белки испытывают более сильные структурные изменения при адсорбции на гидрофобных поверхностях по сравнению с гидрофильными [4, 59, 130, 147]. Возможно, что при адсорбции на метилмодифицированной поверхности диоксида кремния молекулы белка претерпевают сильные структурные изменения, «размазываясь» по поверхности, уменьшая тем самым площадь, на которой могут адсорбироваться другие молекулы. Другая причина малого количества адсорбированного белка может заключаться в малом количестве центров для связывания белка на поверхности синтезированного материала. Расчеты показали, что поверхность метилмодифицированного диоксида кремния содержит наименьшее количество функциональных групп на единицу поверхности по сравнению с другими синтезированными материалами. Данные представлены в табл. 2.4.6.
Сравнение максимального количества адсорбированного белка на немодифицированном и АПТЭС-модифицированном диоксиде кремния показывает большее сродство человеческого сывороточного альбумина к немодифицированному диоксиду кремния. Данный факт не может быть объяснен количеством связывающих центров на поверхности указанных материалов (оно составляет 0.016 ммоль-м"2 для немодифицированного диоксида кремния и 0.025 ммоль-м"2 для АПТЭС-модифицированного диоксида кремния (табл. 2.4.6), а также структурными перестройками молекул белка, вызванных адсорбцией (в разделе 3.2.3. будет показано, что при адсорбции на АПТЭС-модифицированном диоксиде кремния человеческий сывороточный альбумин испытывает меньшие структурные перестройки по сравнению с немодифицированным диоксидом кремния). Причина меньшего количества адсорбированного белка на АПТЭС-модифицированном диоксиде кремния может быть связана с относительной гибкостью аминопропильных групп.
