Содержание к диссертации
Введение
2.1. Компенсаторная гипертрофия легких и особенности ее развития у млекопитающих
2.2. Система пуринових циклических нуклеотидов и характеристика некоторых их биологических функций у эукариот 22
2.3. Биологическая роль и особенности пентозофоофатного пути метаболизма глюкозы у млекопитающих 30
2.4.Фармакологическая характеристика пентоксифиллина и рибоксина 36
3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОБСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ 45
3.1. Материал и методы 45
3.1 . Определение содержания пуринових циклических нуклеотидов радиоиммунологическим методом 52
3.1.2. Определение активности глюкозо-6-фосфат де-гидрогеназы и 6-фоофоглюконат дегидрогеназы 53
3.1.3. Определение содержания нуклеиновых кислот . 54
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 55
4.1. Характеристика нарушений содержания пуриновых циклических нуклеотидов, нуклеиновых кислот и активности дегидрогеназ пентозофоофатного путив правом легком крыс, оставшемся после лево сторонней лульмонэктомии 55
4.2. Влияние рибоксина на биохимические показатели легкого, подвергающегося компенсаторно-гипертрофической перестройке 72
4.3. Влияние пентоксифиллина на биохимические процессы в легком крыс, подвергающемся компенсаторно-гипертрофической перестройке 90
4.4. Влияние рибоксина и пентоксифиллина при их сочетанием црименении на биохимические процессы в легком, подвергащемся компенсаторно-гипертрофической перестройке 108
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 127
6. ВЫВОДЫ 155
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЖОМЕВДАЩИ 156
8. УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 157
- Компенсаторная гипертрофия легких и особенности ее развития у млекопитающих
- Определение содержания пуринових циклических нуклеотидов радиоиммунологическим методом
- Характеристика нарушений содержания пуриновых циклических нуклеотидов, нуклеиновых кислот и активности дегидрогеназ пентозофоофатного путив правом легком крыс, оставшемся после лево сторонней лульмонэктомии
Введение к работе
Актуальность. Несмотря на значительные достижения современной пульмонологии, применение новых методов лечения и широкое использование эффективных фармакологических средств, заболевания органов дыхания по-прежнему занимают важное место в патологии человека. За последние годы наметилась выраженная тенденция к снижению острых форм заболеваний органов дыхания. Одновременно с этим за истекшие 10 лет существенно возросло количество хронических вялотекущих неспецифических форм (Н.В.Путов и соавт., 1982).
Большинство используемых методов лечения легочной патологии, в том числе и фармакологических, направлены прежде всего на ликвидацию этиологии заболевания, устранение его острых проявлений, а также предупреждение осложнений. Как свидетельствует клиническая практика, на этих этапах достигнуты определенные успехи. Однако реабилитация больных разработана недостаточно, так как принимаемые меры для обеспечения полноценного и стабильного восстановления морфологической целостности и функций поврежденного органа малоэффективны. Доказательством является увеличение числа хронических форм патологии.
Проблема стабильного восстановления структуры и функции легких после обширных патологических процессов, и особенно после удаления больших объемов легочной ткани, по-прежнему далека от разрешения, несмотря на многочисленные исследования в этой области. На наш взгляд, основными причинами этого являются недооценка необходимости и возможности экзогенного стимулирующего воздействия на репаративные процессы в легких и в связи с этим слабое использование фармакологических препаратов, стимулирую- щих восстановительные реакции, недостаточность сведений о молекулярных механизмах регенерации. Решение этой проблемы может быть достигнуто только при условии использования генетически детерминированного свойства организмов к органо- и тканеспеци-фическому восстановлению поврежденных органов и тканей. Только на своевременном использовании естественной способности к регеч нерации (в составе комплексной терапии) может быть осуществлено действительное сотрудничество с организмом, предполагающее использование фармакологических средств, стимулирующих эту способность с целью стабильного восстановления структуры и функции органа.
Фундаментальные работы М.А.Воронцовой (1953), А.Н.Студитс-кого (1954, 1962, 1973, 1982), Б.П.Токина (1955, 1959, 1977), Д.С.Саркисова (1962, 1970, 1973, 1980, 1983), Л.Д.Лиознера (1963, 1972, 1975, 1982), Г.Д.Коротковой (1979, 1982),Б% Hay (1969) и многих других позволили установить, что репаративные процессы в органах и тканях высших животных, в том числе и человека, характеризуются широким диапазоном масштабов и форм проявления: от регенерации отдельных молекул до восстановления органов.
Открытие Д.С.Саркисовым (1967) внутриклеточных форм регенерации позволило значительно расширить диапазон процессов, относящихся к репаративным. Среди форм регенерации внутренних органов, в том числе и легких, ведущее место занимает регенерацион-ная (компенсаторная) гипертрофия, достигаемая за счет гипертрофии и гиперплазии.клеток органа (Л.К.Романова, 1971, 1984; В.Н.Отмахов, 1977; І.Д.Лиознер, 1982; J.M^Fischer, J,0*Simmnet, 1973; и др.). Компенсаторная гипертрофия обеспечивает повышение функциональных возможностей 'оставшегося легкого да 70 - 75$ от
7 функции двух легких. Целый ряд показателей, характеризующих состояние системы дыхания, в том числе такие, как степень оксиге-низации тканей и органов, а также интенсивность окислительно-восстановительных реакций, цриближаются к соответствующим физиологическим константам (А.А.Акселърод, 1974; А.О.Пузиков, 1983). Однако как показали М.В.Кукош, И.Р.Вазина (1973), М.Х.Шамирзаев, Р.К.Курбанов (1976), Г.Л.Билич, Б.Н.Отмахов (1979) и др., компенсация структуры и функции оставшегося легкого, особенна после удаления больших объемов, отличается неустойчивостью, так как рано или поздно развиваются явления декомпенсации. Это проявляется в виде эмфиземы, пневмосклероза и прогрессирующей легочно-сердечной недостаточности. Имеется множество непосредственных причин декомпенсации претерпевшего компенсаторно-гипертрофическую перестройку легкого. Важное место среди них, наряду с объе-мом резекции, возрастом, предшествующим состоянием, по мнению Г.Л.Билича, И.П.Зелди (1980), занимает диспропорциональность в развитии паренхимы и стромы легкого. В связи с тем, что регенераторный потенциал стромы выше, чем паренхимы, в легком, подвергающемся компенсаторно-гипертрофической перестройке, наблюдаются прогрессирующие изменения аэро-гематического барьера, накопление в органе фибриллярных коллагеновых структур, что, по-видимому, и является непосредственной причиной декомпенсации. Исход компенсаторной гипертрофии в отдаленные сроки после операции обуславливает необходимость активации и коррекции процесса.
Арсенал средств, оказывающих выраженное влияние на компенсаторное усиление функции оставшегося легкого невелик. Среди фармакологических препаратов, оказывающих регулирующее действие на процесс компенсаторной гипертрофии, важное место занимают некоторые пуриновые и пиримидиновые; производные, созданные и изу- . 8 ченные Н.В.Лазаревым, его учениками и последователями. В Проблемной научно-исследовательской лаборатории Марийского государственного университета по изучению фармакологической регуляции восстановительных процессов в органах и тканях в течение последнего десятилетия было показано, что при применении препаратов этой группы скорость целого ряда биохимических реакций, лежащих в основе компенсаторной гипертрофии, выше, чем у контрольных животных, и что в целом процесс носит стабильный характер. При применении рибоксина диспропорциональность между восстановлением паренхимы и стромы и соединительнотканное перерождение легкого, подвергающегося компенсаторно-гипертрофической перестройке, также выражены в значительно меньшей мере, чем у нелеченых животных. Наблюдается более ранняя, чем у контрольных крыс, активация целого ряда ферментов, ускоряется синтез нуклеиновых кислот и белков, то есть происходит более раннее создание молекулярной базы для стабильной компенсаторной гипертрофии органа. Более того, под влиянием этих препаратов возрастает вклад пролиферации клеток в регенерацию органа и деление клеток охватывает не только строму, но и паренхиму легкого; происходит образование новых морфо-функциональных единиц легкого - альвеол ("Стимуляция регенерации легких", М.: Медицина, 1982). Наряду с этим наблюдается улучшение микроциркуяяции в органе (Л.И.Винницкий, 1980, 1982а; Л.И.Винницкий и соавт., 1981).
Однако несмотря на то, что получены убедительные доказа- тельства принципиальной возможности экзогенной стимуляции и регуляции процесса компенсаторно-гипертрофической перестройки, многий аспекты механизма действия препаратов по-прежнему остаются неизвестными. До начала наших исследований не был изучен характер влияния пуринових производных на одну из ведущих внут-
9 риклеточных регуляторних систем организма - систему циклических нуклеотидов, а также действие препаратов этого ряда на ШП. катаболизма гексоз, где образуются такие биологически важные соединения, как Д-рибоза и восстановленный КАДФ, используемые в синтезе нуклеиновых кислот и других соединений.
Учитывая биологическую роль цАМ? и цГШ как соединений, осуществляющих каскадное усиление ответа клеток на действие эк-зо- и эндогенных факторов (В.В.Лакин, 1982; т^ Bartfai * 1982), а также регулирующих скорость целого ряда интегральных внутриклеточных процессов, в том числе и синтез нуклеиновых кислот, актуальным является комплексное изучение в динамике содержания и соотношения цАМ& и цГШ, активности ключевых ферментов ПФП (Г-6-Ф ДТ И.6-Ф Гл ДТ) и содержание самих нуклеиновых кислот в легком крыс, подвергающемся компенсаторно-гипертрофической перестройке, в обычных условиях и при применении пуриновых производных - рибоксина и пентоксифиллина.
В основу данного исследования была положена рабочая гипотеза о том, что предполагаемое изменение концентрации пуриновых циклических нуклеотидов под воздействием фармакологических препаратов должно повлечь за собой изменение скорости синтеза и содержания целого ряда биосоединений. Значительный интерес в связи с этим представляет оценка содержания нуклеиновых кислот, увеличение концентрации которых рассматривается как молекулярная основа гипертрофии и пролиферации клеток, а также факторов, лимитирующих скорость синтеза информационных макромолекул, важное место среди которых занимает концентрация Д-рибозы.
Учитывая данные литературы о сроках компенсаторно-гипертрофической перестройки легких и последовательности биохимических и молекулярных преобразований в органе, мы сочли целесообразным
10 применение рибоксина и пентоксифиллина непосредственно с момента операции и по 30 сут включительно.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение возможности применения рибоксина и пентоксифиллина в качестве фармакологических препаратов, стимулирующих создание молекулярной основы для компенсаторно-гипертрофической перестройки правого легкого, оставшегося после левосторонней пульмонэкто-мии, и изучение механизмов их действия.
Исходя из этого были поставлены следующие задачи:
Изучить глубину и характер изменений нормального содержания цАШ.'.и цГ№, нуклеиновых кислот (ДНК и суммарная РНК) и активности ферментов ЛШ распада гексоз (Г-6-Ф ДТ и 6-Ф Гл ДТ) в правом легком крыс, оставшемся после левосторонней пульмонэк-томии, на различных этапах послеоперационной перестройки органа.
Изучить влияние рибоксина и пентоксифиллина при их отдельном и сочетанном применении на содержание пуриновых циклических нуклеотидов, нуклеиновых кислот и активность дегидрогеназ ШЇЇ на стадии острого нарушения структуры и функции оставшегося легкого и на основных этапах его компенсаторно-гипертрофической перестройки.
Научная новизна. Результаты проведенного исследования позволили установить, что необходимым условием реализации регенераторных возможностей оставшегося после левосторонней пульмонэкто-мии правого легкого (компенсаторно-гипертрофическая перестройка органа) является сбалансированное увеличение в клетках-^содержания цАШ и цГШ как компонентов одной из важнейших внутриклеточных регуляторных систем и активация окислительного этапа ЇШ утилизации гексоз. При этих условиях происходит увеличение содержания ДНК и РНК в неповрежденных клетках органа, что являет- ся молекулярной базой для компенсаторно-гипертрофической перестройки органа.
Установлено, что в правом легком, подвергающемся компенсаторно-гипертрофической перестройке, несмотря на отсутствие непосредственной травматизации органа, наблюдается резкое снижение содержания циклических нуклеотидов и нарушение их органоспецифи-ческого соотношения, а также выраженное ингибирование активности ключевых ферментов ПФП. Обнаружена взаимосвязь между степенью снижения концентрации циклических нуклеотидов и снижением активности ферментов ПФП, с одной стороны, и снижением содержания нуклеиновых кислот, с другой.
Установлено, что активации синтетических процессов в неповрежденных клетках легкого как молекулярной основы для его последующей компенсаторно-гипертрофической перестройки предшествуют органоспецифически сбалансированное увеличение концентрации цАМФ, цГМФ и активация ферментов ПФП с усиленным образованием Д-рибозы, необходимой для синтеза нуклеиновых кислот.
В работе впервые установлено, что фармакологическое воздействие рибоксина и пентоксифиллина на содержание нуклеиновых кислот опосредуется через их влияние на регуляторную систему пуринових циклических нуклеотидов и ШП утилизации гексоз.
Показано, что при раннем применении рибоксина или пентоксифиллина степень нарушения указанных биохимических процессов выражены в меньшей мере, чем у нелеченых животных. При этом происходит более ранняя их нормализация и увеличение содержания, особенно нуклеиновых кислот, что необходимо для более ранней интенсификации компенсаторно-гипертрофической перестройки.
Установлено также, что длительное сочетэнное применение рибоксина и пентоксифиллина является нецелесообразным, так как со-
12 здание молекулярной базы регенерации (концентрация нуклеиновых кислот в органе) цроисходит менее эффективно, чем при их отдельном использовании, особенно рибоксина.
Практическая ценность. Использованный в работе методический подход позволил впервые выявить зависимость скорости синтеза и содержания нуклеиновых кислот от содержания и соотношения пуринових циклических нуклеотидов, а также от напряженности ШШ катаболизма гексоз. Установление этого факта позволяет, во-первых, считать, что эффективная экзогенная стимуляция и регуляция орга-но- и тканеспецифических репаративных процессов может быть достигнута только при использовании таких фармакологических препаратов, которые оказывают сбалансированное влияние на содержание пуринових циклических нуклеотидов и активируют окислительный этап ПФП. Во-вторых, данные позволяют приступить к целенаправленному поиску и созданию фармакологических препаратов, действующих на универсальные регуляторные системы, а через них на биохимические процессы, являющиеся молекулярной основой для компенсаторно-гипертрофической перестройки оставшегося легкого.
Рибоксин и лентоксифиллин обладают этими свойствами, однако характер их влияния на регуляторную систему пуриновых циклических нуклеотидов, а следовательно, и последствия этого принципиально различны.
Рибоксин отличается высокой эффективностью в течение всего послеоперационного периода, особенно на стадии компенсаторной перестройки органа. При его применении наблюдается раннее и сбалансированное увеличение содержания цАШ и цГШ, ранняя активация дегидрогеназ ШП и более раннее, чем у контрольных крыс, стабильное увеличение содержания нуклеиновых кислот.
Пентоксифиллин оказывает эффективное сбалансированное влия- ІЗ ние на систему пуринових ..циклических нуклеотидов и зависящее от этого содержание нуклеиновых кислот только на стадии острого нарушения структуры и функции органа и на начальных этапах компенсаторно-гипертрофической перестройки легкого. После 3-х сут эксперимента создавшиеся биохимические предпосылки для увеличения содержания нуклеиновых кислот не реализуются. Исходя из этого представляется обоснованной следующая схема введения препаратов: с момента операции по 2-е - 3-й сут - пентоксифиллин (отдельно или в сочетании с рибоксином), с 3-х по ЗО-е сут -только рибоксин.
Реализация результатов работы. Проведенные исследования являются частью комплексной темы "Фармакологическая регуляция регенерации", выполняемой по заданию ГКНТ СССР (34.03.37, регистрационный Jfc 75038081 от 06.07.75).
Исследования позволили расширить диапазон применения рибоксина. Препарат широко используется в лечебных учреждениях г.Йошкар-Ола в комплексе восстановительной терапии больных с патологией системы дыхания.
Пентоксифиллин в качестве стимулятора восстановительных процессов применяется во Всесоюзном научном центре хирургии АШ СССР при хирургическом лечении больных с заболеваниями сердечно-сосудистой и дыхательной систем.
Экспериментальные данные и методический подход используются для диагностики и оценки состояния восстановительных процессов в работе Проблемной научно-исследовательской лаборатории Марийского государственного университета по изучению фармакологической регуляции восстановительных процессов в органах и тканях и лаборатории гормонов ВНЦХ АШ СССР, а также при проведении большого практикума для студентов биолого-химического фа-
14 культета Шрийского государственного университета. Положения, выносимые на защиту.
Изменение содержания пуриновых циклических нуклеотидов, активности дегидрогеназ ПФП распада гексоз - одна из причин колебаний концентрации нуклеиновых кислот в оставшемся после левосторонней пульмонэктомии правом легком крыс.
Из исследованных фармакологических препаратов (рибоксин и пентоксифиллин) рибоксин в наибольшей степени вызывает опережающее и сбалансированное увеличение концентрации цАЩ и цГ№ и активацию дегидрогеназ ІШІ, что приводит к увеличению содержания нуклеиновых кислот как молекулярной основы компенсаторно-гипертрофической перестройки легкого.
Пентоксифиллин как протектор и стимулятор синтеза нуклеиновых кислот в оставшемся легком отдельно или в сочетании с рибоксином эффективен только на ранних этапах послеоперационного периода. Введение препарата через 3 сут после,операции необосновано.
3. Оптимальным условием для создания молекулярной базы компенсаторной гипертрофии является применение рибоксина и лент- оксифиллина по следующей схеме: в течение первых 3-х сут - пентоксифиллин , а в дальнейшие сроки - рибоксин в указанных дозах.
15 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Компенсаторная гипертрофия легких и особенности ее развития у млекопитающих
Одной из ведущих форм регенерации внутренних органов у млекопитающих, в том числе и у человека, является компенсаторная гипертрофия. По мнению М.А.Воронцовой (1957), Л.Д.Лиознера (1982), компенсаторная гипертрофия является атипичной формой регенерации. Атипичность данной формы вторичного развития одного из коллатеральных органов заключается в том, что цитологической основой увеличения массы и объема является не только деление . клеток и увеличение их числа, но и увеличение размеров клеток, то есть их гипертрофия. В этом случае клеточная гипертрофия диаметрально противоположна патологической гипертрофии. Благодаря исследованиям Д.С.Саркисова (1962, 1970, 1980, 1983) и др. авторов, показано, что основой гипертрофии клеток при регенерации являются процессы увеличения числа внутриклеточных структур или явления полиплоидии. Второй важной особенностью компенсаторной гипертрофии является отсутствие вторичных формообразовательных процессов. Последнее, как отмечают Д.С.Саркисов (1983), R.GOss (1969) и др. авторы, являлось причиной того, что долгие годы компенсаторная гипертрофия исключалась из разряда репаративных реакций организма.
Изучение компенсаторной гипертрофии легкого у млекопитающих стало в последние годы объектом многочисленных исследований (Л.К.Романова, 1966, 1971, 1984; Г.Л.Билич, 1975-1983; И.П.Зел-ди, 1980, В.Н.Отмахов и соавт., 1981; Л.В.Назарова, 1982 и др.).
Авторами установлено, что компенсаторная гипертрофия оставшегося после пульмонэктомии легкого сопровождается сложной перестройкой всех метаболических процессов не только в паренхиме, но и в строме органа. Весь комплекс процессов, развивающихся в оставшемся легком, условно можно разделить на две группы.
Первую составляют процессы, направленные на сохранение жизни животного в экстремальных условиях вследствие сокращения поверхности газообмена на 30 - 40$ (левосторонняя пульмонэктсмия) или на 63 - 65$ (правосторонняя пульмонэктсмия), острого нарушения гемодинамики, функции сердечно-сосудистой системы, внешнего дыхания и всех аспектов метаболизма. Обеспечивается это путем включения целого ряда адаптивных реакций, таких как мобилизация резервов сердечно-сосудистой системы, системы крови, а также резервов системы дыхания - раскрытие физиологических ателектазов . (Н.В.Саноцкая, I960; Л.Д.Лиознер, 1963; И.К.Есипова, А.А.Биркун, 1966; Л.К.Романова, 1971; А.А.Аксельрод, 1974; В.Н.Отмахов, 1977; Г.Л.Билич, 1978).
Определение содержания пуринових циклических нуклеотидов радиоиммунологическим методом
При определении концентрации циклических нуклеотидов исследуемый орган быстро извлекали из грудной полости и замораживали в жидком азоте. Забор материала осуществляли в течение 15 - 20 секунд с момента декапитации. Навеску легкого (200-500 мг) гомогенизировали в жидком азоте до порошкообразного состояния. Из навесок последовательно экстрагировали циклические .нуклеотиды 96 этанолом и смесью этанол-вода (2:1), экстракты центрифугировали, после чего объединенные супернатанты упаривали досуха в вакууме. Полученный осадок тщательно растворяли в трис-ЭДГА буфере (рН 7,5) и проводили количественное определение цА№ и цГШ с использованием коммерческих наборов реактивов фирмы "Anteгsham " (Англия).
Принцип метода состоит в изменении удельной радиоактивнос-ти экзогенного Н-нуклеотида.при конкурентном связывании тканевых циклических нуклеотидов со специфическими экзогенныгш белками. Снижение удельной радиоактивности экзогенного %-нуклеотида обратно пропорционально концентрации циклического нуклеотида в образце.
В основе метода лежит инкубация образцов с известным количеством "%-нуклеотида и связывающего белка с последующим отделением несвязанных с белками циклических нуклеотидов. Отделение осуществляли путем адсорбции свободного цАШ на активированном угле и цГ№ сернокислым аммонием. Измерение радиоактивности нуклеотид-белкового комплекса (в случае количественного определения цАШ?) и свободного нуклеотида (при определении цГШ) проводили на счетчике "mtertechnique " (Франция). Содержание циклических нуклеотидов в образце рассчитывали по калибровочному графику, построенному с применением внутреннего стандарта.
Характеристика нарушений содержания пуриновых циклических нуклеотидов, нуклеиновых кислот и активности дегидрогеназ пентозофоофатного путив правом легком крыс, оставшемся после лево сторонней лульмонэктомии
Сокращение дыхательной поверхности на 35 - 37$ (удаление левого легкого), нарушения газообмена, гемодинамики, функции сердечно-сосудистой системы, болевой рефлекс из зоны повреждения и др. являются непосредственной причиной глубоких и длительных изменений биохимических показателей в оставшемся коллатеральном органе, подвергающемся компенсаторно-гипертрофической перестройке (Н.А.Сурьянинова, И.П.Зелди, 1979; И.П.Зелди и со-авт., 1981; Л.А.Соловьева, 1982; и др.).
Результаты, полученные при изучении содержания циклических нуклеотидов в правом легком, оставшемся после левосторонней пульмонэктомии, представлены в таблице 4.1.I.
Как видно из представленных данных, через 30 минут после операции уровень цАМВ и цШ? снижается. Содержание цА№ в этот срок ниже нормального в 3,6, а содержание цШ? - в 1,9 раза (Р 0,001). Через 3 часа после операции наблюдается увеличение концентрации обоих циклических нуклеотидов. Так, количество цАШ увеличивается по сравнению с предыдущим сроком исследования почти вдвое, тогда как цГМБ только на 20$.
