Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Биологическая активность экстрактивных веществ из древесной зелени хвойных пород 12
1.2. Характеристика фармакологической активности и адаптогенных свойств препаратов на основе янтарной кислоты для обоснования препарата сравнения 19
1.3. Системный подход к анализу и интерпретации результатов исследования фармакологической эффективности медикаментозных средств в эксперименте и клинике 23
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Характеристика исследуемых веществ 29
2.2. Характеристика экспериментальных животных и моделирование неблагоприятных воздействий, снижающих адаптивный ресурс организма .29
2.3. Исследование прооксидантно-антиоксидантного статуса организма экспериментальных животных 31
2.4. Изучение СДГ-активности лимфоцитов периферической крови 34
2.5. Изучение окисления энергетических субстратов в тканях висцеральных органов 35
2.6. Статистическая обработка данных 38
2.7. Реализация системного подхода при изучении множественных проявлений фармакологической активности новых соединений 39
ГЛАВА 3. Изучение фармакологических свойств полипренолов и тритерпеновых кисло т 43
3.1. Определение доз исследуемых веществ, оказывающих адаптогенный эффект
3.2. Влияние исследуемых веществ на температуру тела и устойчивость к предельной физической нагрузке при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов 49
3.3. Влияние исследуемых веществ на прооксидантно-антиоксидантный статус при воздействии комбинаций неблагоприятных и патогенного факторов (холода, предельной физической нагрузки и токсиканта) 54
3.4. Влияние исследуемых веществ на активность сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови при действии комбинаций неблагоприятных и патогенного факторов 73
3.5. Влияние исследуемых веществ на окисление энергетических субстратов в тканях внутренних органов крыс при действии неблагоприятных и патогенного факторов 80
ГЛАВА 4. Изучение механизмов реализации адаптогенного действия полипренолов и тритерпенових кислот 94
4.1. Сравнительный анализ адаптогенных свойств исследуемых веществ по совокупности показателей устойчивости к комбинациям неблагоприятных и патогенного факторов in vivo 95
4.2. Изучение множественных проявлений антиоксидантных свойств исследуемых веществ по совокупности показателей прооксидантно-антиоксидантного статуса 101
4.3. Изучение способности исследуемых веществ регулировать энергетические процессы по совокупности показателей СДГ-активности лимфоцитов периферической крови и митохондрий тканей внутренних органов 108
ГЛАВА 5. Изучение множественных проявлений адаптогенного действия полипренолов и тритерпеновых кислот 126
Заключение 136
Выводы 139
Практические рекомендации но
Список литературы
- Системный подход к анализу и интерпретации результатов исследования фармакологической эффективности медикаментозных средств в эксперименте и клинике
- Исследование прооксидантно-антиоксидантного статуса организма экспериментальных животных
- Влияние исследуемых веществ на температуру тела и устойчивость к предельной физической нагрузке при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов
- Изучение множественных проявлений антиоксидантных свойств исследуемых веществ по совокупности показателей прооксидантно-антиоксидантного статуса
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на разнообразие современных принципов создания лекарственных средств, поиск перспективных соединений среди веществ растительного происхождения, продолжает оставаться одним из основополагающих при разработке высокоэффективных и безопасных лечебно-профилактических препаратов [Душенков В.М., 2008; Кукес В.Г., 2006; Машковский М.Д., 1998; Харкевич Д.А., 2005].
Пихта сибирская (Abies sibirica) относится к уникальному источнику соединений, влияющих на процессы, протекающие в живых организмах. Экстрактивные компоненты из хвои пихты обладают биологической активностью, которая давно известна в народной медицине [Гончарова Т.А., 2001; Муравьева Д.А., 1978; Чиков П.С., 1989] и научно доказана в отношении многих видов микроорганизмов, растений, животных [Васильев С.Н. и др., 1991; Кинтя П.К. и др., 1990; Ларионов Г.И., 2004; Рощин В.И. и др., 1991; Рощин В.И., 1995; Томчук Р.И., Томчук Г.Н., 1966; Чернышева Н.К. и др., 1970; Ягодин В.И., 1981; Hostettmann K. et al., 1999; Levinson H.L., 1972; Pengelly A., Bone K., 2004].
В литературе последних лет среди экстрактивных веществ хвои пихты большое внимание уделяется сумме полипренолов, для которых известны такие виды фармакологической активности, как противовирусная, иммуномодулирующая, противоязвенная, противоопухолевая, гипотензивная, гепатопротекторная, кардиопротекторная, антирадикальная и другие [Григорьева Н.Я., Моисеенков А.М., 1989; Деева А.В. и др., 1998; 2004; Карпицкий В.И., Карпицкая Л.Г., 2009; Кучин А.В. и др., 2000; Лаптева Е.Н. и др., 2007; Маймескулова Л.А. и др., 2003; Рощин В.И., 1999; Рощин В.И., Султанов В.С., 2005; Рощин В.И., 2008; Санин А.В. и др., 1991; Серебряков Э.П., Нигматов А.Г., 1990; Хидырова Н.К., Шахидоятов Х.М., 2002; Danilov L.L. et al., 1997; Janas T. et al., 2000; Mishima Y. et al., 1995; Pronin A.V. et al., 2000; Sanin A.V. et al., 1998]. В большинстве работ изучался только один из специфических видов фармакологической активности полипренолов. Хотя из установленных позитивных эффектов полипренолов при различных типах патологических процессов следует высокая вероятность одновременного проявления уже известных и еще не описанных видов их фармакологической активности. Это может стать основанием для разработки принципиально новых мультифункциональных лекарственных средств.
Наряду с полипренолами, перспективным компонентом хвои пихты является сумма тритерпеновых кислот ланостанового ряда, содержащаяся в достаточно большом количестве (около 3% от веса сухого сырья) и не встречающаяся у других хвойных растений (сосна, ель, лиственница), принадлежащих к тому же ботаническому семейству (Pinaceae) [Кинтя П.К. и др., 1990; Ралдугин В.А., 2005; Хуршкайнен Т.В., 2006; Hasegawa S. et al., 1985; Hasegawa S. et al., 1987]. Тритерпеновые кислоты имеют структуру, подобную стероидным гормонам, а стереохимия их молекул сходна с таковой у физиологически активных ланостаноидов – метаболитов морских организмов [Кинтя П.К. и др., 1990; Племенков В.В., 2001]. Можно предположить, что данные соединения также будут обладать различными видами фармакологической активности. Но сведения об их биологической активности весьма ограничены, а влияние на организм животных в норме и при патологии еще не изучалось. В связи с этим, изучение полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты с целью создания на их основе эффективных и безопасных препаратов, весьма актуально.
Природные вещества обладают широким спектром фармакологической активности [Гончарова Т.А., 2001; Hostettmann K. et al., 1999; Pengelly A., Bone K., 2004]. Поэтому для изучения действия на организм препаратов природного происхождения необходим системный подход, обеспечивающий анализ совокупности изменений разнокачественных физиологических показателей. В последние годы для решения подобных задач успешно зарекомендовавшая себя в экономике, социологии, политологии и психологии системная методология научных исследований в виде алгоритмов многомерного математико-статистического анализа и моделирования [Гудвин Д., 2004; Дубров А.М.и др., 2000; Жуковская В.М., Мучник И.Б., 1976; Крутов В.Н. и др., 1989; Миркин Б.Г., 1985] стала активно внедряться в медицину и, в частности, в фармакологию [Григорьев С.Г., 2003; Мазина Н.К., 2007; Хафизьянова Р.Х., 2007].
Цель работы состояла в изучении множественных проявлений фармакологической активности суммы полипренолов и суммы тритерпеновых кислот из хвои пихты в эксперименте.
Задачи исследования:
-
Определить диапазон адаптогенных доз полипренолов и тритерпеновых кислот по способности повышать устойчивость организма к комбинации неблагоприятных факторов (холода и предельной физической нагрузки).
-
Изучить антиоксидантное действие полипренолов и тритерпеновых кислот в условиях комбинации неблагоприятных и патогенного факторов.
-
Исследовать влияние полипренолов и тритерпеновых кислот на активность процессов энергопродукции в митохондриях лимфоцитов и тканей внутренних органов в норме и при комбинации неблагоприятных и патогенного факторов.
-
Изучить механизмы реализации адаптогенного действия полипренолов и тритерпеновых кислот в сравнении с эталонным препаратом.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые:
- в экспериментах на животных изучены проявления фармакологической активности суммы тритерпеновых кислот из хвои пихты;
- обнаружен широкий спектр адаптогенного действия тритерпеновых кислот в виде актопротекторного и хладопротекторного эффектов на фоне острого токсического поражения печени;
- выявлено антиоксидантное действие тритерпеновых кислот и их способность регулировать энергетический обмен в условиях действия неблагоприятных факторов;
- изучено адаптогенное действие полипренолов из хвои пихты в отношении комбинации неблагоприятных факторов (физической и химической природы) и установлены их хладопротекторные и актопротекторные свойства при остром токсическом поражении печени;
- исследовано влияние полипренолов на прооксидантно-антиоксидантный статус организма и установлено наличие антиоксидантных свойств;
- изучено влияние полипренолов на системы энергопродукции печени, сердца, почек и лимфоцитов и показано его вовлечение в реализацию уже известного иммуномодулирующего, кардиопротекторного и гепатопротекторного эффектов этих веществ.
Научно-практическая значимость.
Использование комбинации неблагоприятных воздействий (физической и химической природы) позволяет выявлять соединения с широким спектром адаптогенного действия при скрининге фармакологически перспективных веществ.
Применение факторной схемы эксперимента, методов группировки исходных данных и многофакторного анализа методом главных компонент к совокупности разнородных показателей предоставляет возможность выявлять эффективные адаптогенные дозы, а также изучать разнообразные виды фармакологической активности новых соединений.
На основании полученных результатов обоснована перспективность использования полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты в качестве фармакологических субстанций для разработки новых лекарственных средств, сочетающих адаптогенный эффект с антиоксидантными свойствами и способностью регулировать энергетический обмен в условиях действия неблагоприятных и патогенного факторов на организм.
Положения, выносимые на защиту.
1. Полипренолы и тритерпеновые кислоты из хвои пихты обладают широким спектром адаптогенного действия (актопротекторным и хладопротекторным, в том числе, и на фоне острой патологии печени);
2. Адаптогенный эффект полипренолов и тритепеновых кислот реализуется с вовлечением процессов энергопродукции в лимфоцитах и тканях внутренних органов (сердца, печени, почки), а также прооксидантно-антиоксидантной системы.
3. Новый подход к изучению фармакологической активности полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты с использованием факторной схемы эксперимента, методов группировки исходных данных и многофакторного анализа позволил обосновать их перспективность как адаптогенов, антиоксидантов и средств фармакологической регуляции энергетического обмена.
Реализация результатов исследования. Результаты работы используются при выполнении научных исследований в рамках приоритетного направления «Живые системы» Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Государственные контракты № 02.512.11.2025, № 02.512.12.0011, № 02.512.11.2229).
Алгоритмы планирования эксперимента и математико-статистического моделирования, разработанные в диссертационном исследовании, используются на кафедре физики и информатики ГОУ ВПО Кировская ГМА в научно-исследовательской работе и при чтении курса медицинской статистики.
Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений» (Казань, 2007); II Международной конференции "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives" (Алма-Ата, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2007); 63 Научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); XIII Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2008), I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); расширенном заседании кафедр фармакологии; медицинской биологии и генетики; физики и информатики; биохимии; патологической анатомии с секционным курсом; микробиологии с курсом иммунологии и патологической физиологии ГОУ ВПО Кировская государственная медицинская академия Росздрава (Киров, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, основных выводов работы и списка литературы. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 45 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 306 наименований, в том числе 92 - на иностранных языках.
Системный подход к анализу и интерпретации результатов исследования фармакологической эффективности медикаментозных средств в эксперименте и клинике
Выбор растительного сырья в качестве основного источника ПП обусловлен высоким их содержанием - до 2% от сухого веса [150, 292, 293, 294]. В клетках микроорганизмов и тканях млекопитающих ПП содержатся в значительно меньших количествах (от 0,00004 до 0,3 %) [230, 296]. При этом выход ПП из хвойных растений на порядок выше, чем из лиственных пород, к тому же поли-пренолы хвойных отличаются большим количеством изопреновых звеньев в молекуле (от 10 до 20) по сравнению с лиственными (от 6 до 12) [24, 152, 292, 293].
В настоящее время у ПП из хвои пихты (и их производных) установлено наличие противоязвенной, гепатопротекторной, гипотензивной, антитромбоз-ной, противоопухолевой, противовирусной и иммуномодулирующей активностей [45, 49, 50, 97, 112, 149, 157, 159, 160, 166, 200, 275, 282, 285] .
Перечисленные свойства ПП используются при разработке профилактических и ветеринарных препаратов. Например, на модели токсического поражения печени, индуцированного у крыс дихлорэтаном, показано гепатопротек-торное действие ПП из ДЗ хвойных, которое реализуется посредством стимуляции репаративно-регенерационных процессов и уменьшения степени жировой дистрофии в печени с восстановлением белоксинтезирующей функции ге-патоцитов [99, 112, 151].
В эксперименте на крысах продемонстрировано, что ацетаты ПП пихты обладают гемостимулирующим и кардиопротекторным действием в дозах 100 и 50 мг/кг соответственно [112, 157]. Также описано положительное влияние ПП на процессы репарации клеток и сперматогенеза у старых и молодых крыс-самцов с нарушенной репродуктивной функцией [147]. Антиульцерогенное и ранозаживляющее действие ациклических изопреноидов связано с нормализацией биосинтеза муцинов и гликопротеидов соединительной ткани. Одним из факторов, определяющих антигипертензивное и антитромботи-ческое действие 1111, может быть нормализация уровня гепарина, обеспечивающая постоянный гипокоагулирующий эффект, а активация фагоцитоза и противоопухолевое действие, возможно, обусловлено синтезом таких глико-протеинов как интерлейкины и иммуноглобулины [166, 226, 229, 231, 258, 262 263]. В дополнение к перечисленным свойствам 1111 обладают способностью стимулировать рост растений [142].
В НИИ фармакологии ТНЦ РАМН и НИИ онкологии ТНЦ РАМН при исследовании на трех моделях опухолевого роста (асцитной опухоли Эрлиха, карциномы легких Льюис, меланомы В-16) установлено, что ПП (в дозе 100 мг/кг) и ацетаты ПП (в дозах 5, 50, 100 мг/кг) из хвои пихты обладают противоопухолевым и антиметастатическим действием [157].
Исследованиями in vitro установлено, что ацетаты ПП хвойных растений являются акцепторами алкильных радикалов [70]. Судя по строению молекулы, ПП также могут обладать способностью инактивировать процессы свободно радикального окисления, инициируемых радикалами другой природы - активными кислородными метаболитами [2, 62], и, как следствие, мембранопротек-торными свойствами, что предполагает их фармакологическую перспективу как антиоксидантов. Низкая токсичность ПП из ДЗ пихты (LD5o = 4000 мг/кг) и высокая чистота 95-97% при хроматографическом способе выделения (по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии [89]) позволяет разрабатывать на основе этого вещества лечебно-профилактические препараты.
Поскольку синтез ПП является многостадийным, такой доступный природный источник этих полипрениловых спиртов как ДЗ хвойных пород открывает перспективу создания лекарственных средств с высокой проникающей способностью через биологические мембраны и барьеры [135, 163].
Наряду с ПП, хвоя пихты содержит богатейший набор тритерпеноидов, в том числе ТТК ланостанового ряда (рис. 2), отсутствующие у других хвойных пород [73, 139]. Тритерпеновые соединения, в эволюционном аспекте являются наиболее древними регуляторами многих процессов, обеспечивающих жизнедеятельность растений. Возраст ТТК составляет около 2 млрд. лет [272]. Сумма «сильных» кислот, выделенных эмульсионным способом из ДЗ пихты [98], примерно на 70% представлена ТТК (фирмановая кислота 1, изофирмановая кислота 2, оксо-мариесовые кислоты 3 и 4), близкими друг к другу по своим адсорбционным свойствам [202]. Согласно литературным данным, сумма ТТК ланостано-вого ряда и биогенетически родственных ему структурных типов является сложной смесью и наиболее эффективным оказывается их разделение адсорбционной хроматографией на силикагеле [140].
Исследование прооксидантно-антиоксидантного статуса организма экспериментальных животных
Биологический способ заключался в записи постепенного снижения концентрации кислорода, растворенного в среде инкубации, до полного исчерпания и оценке линейности ответа электрода на внесение в полярографическую ячейку 200 мкл свежеприготовленного гомогената ткани. Химическую калибровку и определение остаточного тока, а также сопоставление кислородного нуля с электрохимическим нулем ячейки проводили путем связывания растворенного кислорода с сульфитом натрия (Na2S03).
Гетерогенность каталазы (наличие 4х изоформ) [80, 94], проявление максимальной активности каталазы, как и любого другого фермента, в физиологических условиях биологической среды (температура, рН, ионный состав и так далее) [101], а таже пропорциональность скорости катализируемой ею реакции количеству фермента при стандартизованных условиях эксперимента [114] свидетельствуют о нецелесообразности выделения каталазы в чистом виде для изучения ее активности. Руководствуясь этим, в нашей работе за показатель ферментативной активности каталазы, характеризующий отклик АОС экспериментальных животных, была принята каталазная активность следующих образцов биоматериала: крови (Ккр), как интегрального показателя антиоксидантного статуса организма, а также гомогенатов тканей сердца (Кс), почки (Кпчк) и печени (Кп).
Оценку энергетического статуса лимфоцитов осуществляли цитохимическим методом по активности индикаторного фермента MX — сукцинатдегидро-геназы [123] с использованием готовых наборов реактивов (производитель ООО НПФ «Либрус», г. Москва), в состав которых входил сукцинат натрия, п-нитротетразолий фиолетовый, фосфатный буфер и трилон Б. Этот метод основан на способности п-нитротетразолия фиолетового, при окислении определенных типов субстратов, восстанавливаться и образовывать в клетках нерастворимые окрашенные депозиты пигмента в виде гранул формазана.
Реакция проводилась на стандартных свежих мазках крови, которую отбирали из хвоста крысы на 6-е сутки после профилактического введения исследуемых веществ или сразу же после тестирующих воздействий.
Количество и геометрию депозитов формазана изучали методом количественной морфометрии с помощью комплекса аппаратно-программной визуализации гистологических препаратов «ВидеоТесТ». Использовали показатели: Q - суммарное количество депозитов цитохимической СДГ-реакции [21] в 50 клетках (интегральная активность СДГ) и S - среднюю площадь депозитов [мкм ], характеризующую структурно-функциональную организацию систем энергопродукции лимфоцитов в виде МХ-ретикулума [61, 306].
Возрастание Q от уровня соответствующего контроля свидетельствовало об усилении процессов энергопродукции в лимфоцитах путем их интенсификации, то есть посредством роста удельной ферментативной активности СДГ. А увеличение S при сохранении Q интерпретировали как повышение энергопро-дуцирующей способности лимфоцитов крови за счет дополнительного биогене 35 за MX и увеличения протяженности и разветвленности МХ-ретикулума [61, 306]. Снижение Q от значения этого показателя у интактной группы, на наш взгляд, отражало угнетение активности СДГ и формирование энергодефицита, которое может сопровождать иммунодепрессивные состояния, а снижение S -отражало деградацию МХ-аппарата.
Изучение окисления энергетических субстратов в тканях висцеральных органов Энерготропные свойства исследуемых веществ как способность влиять на энергетический обмен и элемент их адаптогенного действия оценивали по активности окислительных процессов в тканях внутренних органов крыс в зависимости от типа воздействия.
После эвтаназии животных вскрывали и извлекали сердце, печень, почку, помещая их на ледяную баню, все последующие манипуляции осуществляли охлажденными инструментами. 25%-ные гомогенаты тканей внутренних органов в среде выделения фиксированного состава (табл. 2) с «нативными» MX получали синхронно в стандартных условиях, согласно рекомендациям М.Н. Кондрашовой [84]. Готовые препараты во время эксперимента хранили строго при 0С (ледяная баня).
Для приготовления растворов использовали следующие реактивы: сахарозу, КН2Р04, MgS04, КС1 квалификации х.ч., фирмы «Реахим» (Россия); трис-НС1, ЭДТА - фирмы «Serva» (Германия). Субстратом окисления служила натриевая соль ЯК. Все растворы готовили ex tempore на дистиллированной воде.
Тканевое дыхание изучали с помощью закрытого кислородного датчика гальванического типа [78] в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при постоянном перемешивании в солевой среде инкубации фиксированного состава (табл. 2), уравновешенной по газовому составу с воздухом, при температуре 37С.
Измерительная установка, в соответствии с требованиями метода [78, 84], состояла из электрода, ячейки с перемешивающим стержнем, термостатируемо-го кожуха для ячейки, водяного термостата І ТЖ-0 03 (Россия), магнитной ме 36 шалки ММ-ЗМ (Россия), самописца LKB Bromma 2210 2-Channel Recorder (Швеция).
Влияние исследуемых веществ на температуру тела и устойчивость к предельной физической нагрузке при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов
Влияние комбинаций неблагоприятных факторов и исследуемых веществ на устойчивость крыс к предельной физической нагрузке (горизонтальная сплошная линия обозначает среднее значение времени удержания на плаву интактной группы, пунктирными линиями вдоль нее - 95% ДИ). Обозначения: ось абсцисс - обозначения групп сравнения по типам тестирующего воздействия, ось ординат — время удержания на плаву в секундах
Введение ЯК+Глу на фоне токсического поражения печени с предельной физической нагрузкой после острого охлаждения (группа ТХП ЯК+Глу) значительно повышало физическую выносливость в соответствии с увеличением Тпл на 118% (р=0,04) относительно контрольной группы ТХП, то есть практически нивелировало последствие действия патогенного фактора ССЦ. Примечательно, что время удержания на плаву животных и группы ХП ЯК+Глу, и группы ТХП ЯК+Глу превосходило значение аналогичного показателя у интактных животных. Следовательно, ЯК+Глу обладает актопротекторным действием не только при экстремальном охлаждении и предельной физической нагрузке, но и при суммации неблагоприятных воздействий в виде их сочетания с токсическим поражением печени.
При введении ПП был отмечен наиболее выраженный актопротекторный эффект на фоне экстремального охлаждения (группа ХП ПП), проявляющийся в достоверном возрастании Тпл на 482% (р=0,004) в сравнении с контрольной группой (ХП) и на 323% (р=0,007) - с группой интактных животных.
Введение ПП на фоне модели острого гепатита (группа ТХП ПП) способствовало повышению Тпл на 234% (р=0,002) в сопоставлении с контрольной группой (ТХП) и на 80% (р=0,03) - с интактными животными, что свидетельствует об актопротекторном действии ПП при СС14 - гепатите.
При моделировании избыточной физической нагрузки после экстремального охлаждения введение ТТК (группа ХП ТТК) оказывало актопротекторное действие - наблюдалось увеличение Тпл на 153% (р=0,002) от показателей контрольной группы ХП и на 84% (р=0,01) от группы интактных крыс.
В условиях токсического поражения печени с последующим острым охлаждением и избыточной физической нагрузкой отмечено выраженное актопротекторное действие ТТК (группа ТХП ТТК) согласно увеличению Тпл - на 198% (р=0,0004) от показателей животных без защиты (группа ТХП) и на 60% от уровня значения этого параметра у интактной группы (р=0,001).
Таким образом, при остром охлаждении с ограничением подвижности у крыс наблюдалось снижение температуры тела, измеряемой в нашем исследовании, по 4 точкам - развитие гипотермии [67] в результате нарушения функции терморегуляции (уменьшения теплообразования в условиях повышенной теплоотдачи) и снижение устойчивости к предельной физической нагрузке. Воздействие токсиканта усугубляло проявления гипотермии, поскольку за счет действия СС14 на печень нарушается углеводный, белковый и липидный обмен, уменьшаются резервы энергетических субстратов [25, 63, 92]. Дальнейшее снижение теплообразования приводило к дополнительному уменьшению толерантности к физической нагрузке.
На основании сравнительного анализа динамики показателей-откликов in vivo (tny, ілу, t,„ tXB и Тпл) установлено, что исследуемые соединения значительно расширили адаптационный ресурс организма при комбинированном действии неблагоприятных факторов физической природы и патогенного фактора химической природы.
Препарат сравнения ЯК+Глу проявлял наибольший из всех исследуемых веществ хладопротекторный эффект на фоне экстремального охлаждения. Ак-топротекторное действие ЯК+Глу было практически идентично при обеих комбинациях неблагоприятных воздействий и при СС14 - гепатите, что, на наш взгляд, обусловлено гепатопротекторными свойствами препарата сравнения, описанными в клинике и эксперименте [59, 184, 207].
В условиях комбинации острого охлаждения и избыточной физической нагрузки ПП обладали максимальным актопротекторным действием в условиях нашего эксперимента. При токсическом поражении печени отмечали значительный хладопротекторный эффект наряду с актопротекторным действием данного соединения, что согласуется уже известными гепатопротекторными свойствами 1111 [99, 151]. При патологии в виде острого токсического гепатита введение ТТК сопровождалось более выраженным хладопротекторным эффектом, чем в условиях комбинации физических неблагоприятных факторов.
Исходя из вышеизложенного, ПП и ТТК обладают широким спектром адаптогенного действия, причем при патологии печени по типу ССЦ - гепатита по хладопротекторным и актопротекторным свойствам превосходят эталонный препарат ЯК+Глу.
Жизнеспособность, нормальное функционирование организма и поддержание гомеостаза обеспечивается за счет высокой активности АОС, возникновение которой в эволюционном аспекте было ответом на переход к аэробным формам жизни [72, 118, 241, 278]. Непрерывное образование активных кислородных метаболитов (АКМ), также известных как прооксиданты, происходит во многих метаболических процессах, в том числе и энергопродукции в MX, и сбалансировано дезактивирующей функцией АОС [65, 118, 220, 283, 301]. Нарушения этого динамического равновесия в виде активизации прооксидантной системы и ослабления АОС сопровождаются накоплением окислительных повреждений, что приводит к возникновению окислительного стресса - состояния активации СР-процессов в клетке до уровня, вызывающего повреждение ее структур, который является общим звеном патогенеза при поражении организма различными факторами [72, 118, 221].
В физиологических концентрациях АКМ выступают в качестве универсальных регуляторных агентов, благотворно влияющих на различные системы и функции организма: адаптивную реакцию, поддержание структурного гомео-стаза посредством обновления липидов клеточных мембран в результате инициируемых ими процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), регуляции иммунитета, тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтеза простагланди-нов и регуляции метаболических процессов в качестве внутриклеточных мес-сенджеров [33, 118, 128, 218, 232, 239, 274, 276, 286]. Напротив, нарушения механизмов генерации АКМ, обусловленные генетически или приемом лекарственных препаратов, приводят к снижению неспецифического иммунитета и нарушению функции детоксикации, что является причиной либо развития патологических состояний, либо гибели организма [93, 116].
До сих пор наиболее популярной концепцией о причинах старения остается СР гипотеза о ведущей роли окисления биополимеров АКМ, генерируемых преимущественно MX, в ослаблении жизненных функций [248, 279, 284, 289]. При старении возрастает уровень окисленности ДНК, белков и липидов, что может быть следствием либо увеличения продукции АКМ, либо ослабления АОС, либо повреждающего воздействия АКМ, пропорционального возрасту организма [290, 301].
Изучение множественных проявлений антиоксидантных свойств исследуемых веществ по совокупности показателей прооксидантно-антиоксидантного статуса
При комбинации неблагоприятных и патогенного факторов введение ПП (группа ТХП ПП) не оказывало значимого воздействия на суммарное количество депозитов СДГ-реакции ни при сравнении со значением Q у соответствующего контроля (группа ТХП), ни у интактных животных. Наряду с этим, эффект гиперпродукции СДГ под влиянием сочетания неблагоприятных факторов устранялся введением ПП - наблюдалось уменьшение S на 18% (р=0,04) от уровня соответствующего контроля (группа ТХП) и приближение значения этого показателя к уровню интактных животных. Исходя из аналогии с эталонным препаратом, способность ПП оказывать регулирующее действие на процессы энергопродукции в иммунокомпе-тентных клетках расценивалась нами как проявление энергопротекторного эффекта этого вещества, который также реализуется при обеспечении хладопротекторного и актопротекторного эффектов на фоне острого токсического поражения печени.
Введение ТТК при комбинации острого охлаждения и избыточной физической нагрузки (группа ХП ТТК) способствовало снижению S на 14% (р=0,04) от значений этого показателя соответствующей контрольной группы (рис. 18) при неизменности Q. Следовательно, введение ТТК при данном сочетании неблагоприятных факторов препятствовало развитию эффекта гиперактивации СДГ путем поддержания активности процессов энергопродукции на уровне значений соответствующих показателей интактнои группы с сохранением структурно-функциональной организации МХ-ретикулума.
При остром охлаждении и избыточной физической нагрузке на фоне действия токсиканта введение ТТК (группа ТХП ТТК) вызывало уменьшение S на 15% (р=0,007) от значений этого показателя соответствующей контрольной группы при неизменности Q. В соответствии с этим, ТТК при данной комбинации неблагоприятных факторов (также как и в случае группы ХП ТТК) способствовали устранению гиперактивации СДГ, сохраняя их активность на уровне интактных животных. Такой эффект позволяет предположить наличие энергопротекторных свойств ТТК, которые осуществляются путем регулирования процессов энергопродукции с сохранением нативности МХ-аппарата лимфоцитов вне зависимости от вида негативного влияния и принимают активное участие в формировании резистентности организма под влиянием данного вещества.
Таким образом, неблагоприятные воздействия вызывали гиперактивацию СДГ в лимфоцитах, и, возможно, набухание MX, согласно увеличению площади депозитов формазана, что, по-видимому, является экстренным механизмом активизации энергетического обмена иммунокомпетентных клеток при состоянии организма, сопряженном с повышенной потребностью в энергии и позволяет корректировать состояние, вызванное негативным действием токсиканта на организм.
Из сопоставления полученных данных следует, что уже известное энергопротекторное действие ЯК+Глу и впервые обнаруженное нами энергопротекторное действие ПП осуществляются сходным образом при определенных состояниях организма — путем упреждающей мобилизации энергетического обмена в MX (по увеличению удельной активности СДГ) в условиях «нормы» и устранением гиперактивации СДГ под влиянием неблагоприятных воздействий (наряду с сохранением структурно-функциональной организации МХ-ретикулума). При этом ПП превосходили ЯК+Глу по протективному влиянию на энергопродукцию в лимфоцитах, что согласуется с более выраженным проявлением адаптогенных свойств ПП in vivo (см. рис. 8 и 9).
Также нами установлены энергопротекторные свойства ТТК, заключающиеся в мобилизации энергетического обмена в MX иммунокомпетентных клеток у зоровых крыс по увеличению площади гранул формазана, что свидетельствует об активизации биогенеза органелл. При последующих неблагоприятных воздействиях этот путь может способствовать оптимизации выработки энерге 80 тических эквивалентов при сохранении геометрии МХ-ретикулума. Такое стабилизирующее (компенсирующее) действие ТТК проявлялось идентично при обеих комбинациях тестирующих неблагоприятных воздействий и способствовало реализации адапотогенного действия ТТК in vivo.
Энергопротекторный эффект экстрактивных веществ из хвои пихты на уровне MX иммунокомпетентных клеток, согласуется с иммуномодулирующим действием ПП, описанным другими авторами [49, 50, 149, 160, 234, 282, 285], а также позволяет предположить существование таковых у ТТК.
Согласно современным представлениям, система окисления ЯК в MX играет ведущую роль в энергообеспечении адаптивной реакции организма к факторам окружающей среды при предельном напряжении гомеостатических функций и является чувствительной характеристикой состояния процессов клеточного дыхания при изменении физиологического состояния организма в условиях гипоксии, физической нагрузки и других неблагоприятных воздействий [68,85, 106, 110].
Адаптация к холоду, физической нагрузке, гипоксии связана с увеличением численности, массы и суммарной ферментативной активности MX, которые содержат повышенное количество цитохромов и способны продуцировать больше тепла [189, 245, 261]. Формирование резистентности к этим факторам, осуществляемое по пути наращивания резервов аэробной фазы катаболизма (ресинтез АТФ аэробным путем), не сопровождается выраженным закислением организма, не смотря на ограниченную доставку кислорода [68, 109].
Установлено, что MX подвержены действию многочисленных агентов различного происхождения и их ответная реакция может осуществляться посредством изменения их морфологического состояния, а также адаптивной, компенсаторно-приспособительной реакции в ответ на изменение физиологи 81 ческого состояния организма в целом [81, 178, 195]. Изменение функционального состояния MX является неотъемлемой частью перестроек в рамках общего адаптационного синдрома [68, 81, 195].
В поддержании энергетического гомеостаза ведущую роль играет быстрый метаболический кластер MX (часть цикла трикарбоновых кислот, способная функционировать в «усеченном» виде, с преимущественным окислением ЯК), ключевым ферментом которого является СДГ [82, 83, 88]. Система быстрого метаболического кластера MX может функционировать как регулирующий механизм, предоставляя возможность обеспечить ресинтез АТФ и предупредить повреждения клеток и тканей внутренних органов. Быстрый синтез и утилизация ЯК, как наиболее продуктивного энергетического субстрата, через быстрый метаболический кластер активизируют механизмы, ограничивающие интенсивность ее метаболизма, что имеет защитное значение для самих MX [68, 85, 109, 195].
MX, являясь многофункциональными органеллами, участвуют в регуляции кислородзависимых процессов, синтезе АТФ, 0-окислении жирных кислот, поддержании ионного гомеостаза, окислительно-восстановительного баланса клетки и клеточной пролиферации, управляют гибелью клетки, выполняют регулирующую и интегрирующую роль между различными путями метаболизма [85, 101, 136, 168,195].
Отклик функциональной активности MX носит неспецифический характер по отношению к виду неблагоприятного воздействия. Однако структура и направленность их ответных реакций находятся в зависимости от силы и длительности влияния внешнего фактора.
Поскольку процессы тканевого окисления чутко реагируют на введение лекарственных средств [19, 31, 74, 88, ПО], показатели их активности могут использоваться при изучении причастности процессов энергетического обмена к реализации фармакологических эффектов новых соединений.
