Содержание к диссертации
Введение
1 Структура, физико-химические свойства и фармакологическая активность пектинов 8
1.1. Химическое строение пектинов 9
1.2. Физико-химические свойства пектинов 12
1.3. Фармакологические эффекты пектинов 18
1.4. Зависимость фармакологических эффектов от структуры и физико-химических свойств пектинов 26
2. Материалы и методы исследования
2.1. Определение металлов в растворах и биологических образцах 29
2.2. Сырьевые источники изучаемых препаратов 30
2.3. Характеристика экспериментальных животных 30
2.4. Биохимические методы 31
2.5. Статистическая обработка результатов 32
3. Способы получения и стандартизация препаратов низкоэтерифицированных пектинов 33
3.1. Способ получения образцов пектина с разной степенью этерификации 37
3.2. Способ получения низкоэтерифицированного пектина из морской травы Zostera marina 42
3.3. Получение пектинов с заданной степенью этерификации способом смешивания 44
4. Металлсвязывающая активность пектинов с разной степенью этерификации 46
4.1. Кинетика связывания меди пектином со степенью этерификации 1,2% 47
4.2. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с медью 59
4.3. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии со свинцом 60
4.4. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с кадмием 66
4.5. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с ртутью 67
4.6. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с цинком 70
4.7. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с железом 72
4.8. Кинетика связывания металлов пизкоэтерифицированным пектином из морской травы Zostera marina 73
4.9. Оценка сорбционной емкости образцов пектина с разной степенью этерификации, полученных разными методами 83
5. Фармакологические эффекты пектинов с разной степенью этерификации
5.1. Сравнительная оценка связывания металлов пектинами и лекарственными препаратами in vitro 87
5.2. Влияние пектинов с разной степенью этерификации на выведение свинца у крыс 93
5.3. Гиполипидемическая активность пектинов 96
5.4. Антитоксическая активность пектинов 100
Обсуждение 103
Практические рекомендации 112
Выводы 114
- Физико-химические свойства пектинов
- Сырьевые источники изучаемых препаратов
- Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии со свинцом
- Гиполипидемическая активность пектинов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Фундаментальной проблемой теоретической фармакологии является установление закономерных связей между структурой химических соединений и их воздействием на живой организм. Удобным объектом для анализа таких связей могут служить пектиновые вещества, представляющие интерес и как потенциальный источник новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище (Thakur et al., 1997; Хотимченко и др., 2001а, б; Sun et al., 2002; Nangia-Makker et al., 2002), и как материал для современных фармацевтических технологий (Miyazaki et al., 2000; Semde et al., 2000; Liu et al., 2003; Cheng, Lim, 2004).
Пектины относятся к классу полимерных углеводов и, как большинство полисахаридов, являются гетерогенными по структуре, молекулярной массе и физико-химическим свойствам. Их состав различается в зависимости от источника сырья, места произрастания растений и условий выделения (Chang et al., 1994). Первичными блоками полимерной цепи пектинов являются остатки D-галактуроновой кислоты, соединенные друг с другом а(1->4)-связью. Пектиновая цепь может состоять от нескольких десятков до нескольких сотен галактуроновых блоков (Thibault et al., 1993), между которыми на разных расстояниях друг от друга располагаются остатки L-рамнозы. От основной линейной цепи рамногалактуронана берут начало боковые цепи, состоящие из 8-20 молекул нейтральных Сахаров, таких как D-галактопираноза, L-арабинофураноза, D-ксилопираноза, D-глюкопираноза, L-фукопираноза, D-апиоза, 2-0-метил-В-ксилоза и 2-О-метилфукоза (Schols, Voragen, 1996; Thakur et al., 1997; Ridley et al., 2001). В зависимости от относительного количества карбоксильных групп в остатках галактуроновой кислоты, этерифицирован-ных метиловым спиртом, различают высокометоксилированные и низкометоксили-рованные пектины. Все эти структурные особенности молекул полисахарида создают разнообразие физико-химических параметров пектинов, что должно отражается на их биологических и фармакологических свойствах.
В спектре фармакотерапевтических эффектов пектинов их способность снижать уровень сывороточного холестерина и липопротеинов низкой плотности (Gonzalez et al., 1998; Vergara-Jimenez et al., 1998; Bladergroen et al., 1999), связывать тя-
5 желые металлы (Kohn, 1987; Dongowski et aL, 1997), увеличивать экскрецию желчных кислот (Garcia-Diez et al 1996), проявлять антимутагенную активность в отношении нитроароматических соединений (Hensel, Meier, 1999) и ингибировать пролиферацию злокачественных клеток (Heitman et al, 1992; Hsteh and Wu, 1995). Пек-тинсодержащие препараты оказывали лечебные эффекты у больных с гиперхолесте-ринемией (Groudeva et al., 1996; Knopp et al, 1999), сахарным диабетом (Levitt et al., 1980) и персистирующей диареей (Rabbani et al., 2001). Вместе с тем, анализ литературы свидетельствует о существенных противоречиях как в результатах близких по содержанию работ, так и в их интерпретации. Эти противоречия обусловлены отсутствием стандартизованных препаратов исследованных пектинов. В различных работах используются пектины неодинакового происхождения, с разной степенью эте-рификации, с разной молекулярной массой и с неодинаковыми реологическими свойствами. Лишь в единичных работах предприняты попытки установить связь структуры пектинов с их фармакологической активностью, например, с гипохоле-стеринемическим действием (Kishimoto et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995; Trautwein et al., 1998), воздействием на активность микрофлоры кишечника (Langhout et al., \ 1999) и сорбцией желчных кислот (Dongowski, 1995). Отсутствие в литературе достаточных сведений о закономерных связях между физико-химическими характеристиками пектинов, такими как вязкость, массовая доля полиуроновых кислот, относительное содержание свободных карбоксильных групп, с одной стороны, и фармакологическими эффектами, с другой стороны, определило цели и задачи настоящей работы.
Цель работы. Цель работы состояла в установлении связи физико- t химических свойств пектинов с их металл связываю щей активностью.
Задачи работы:
Получить пектины с заданной степенью этерификации в диапазоне от 1 до 60% и охарактеризовать их физико-химические свойства по относительному содержанию свободных карбоксильных групп, содержанию ангидрогалактуроновой кислоты, характеристической вязкости и теоретической сорбционной емкости.
Определить сорбционные характеристики пектинов с разной степенью этерификации по отношению к ионам меди, свинца, кадмия, ртути, цинка и железа.
Изучить влияние рН среды на сорбционную активность пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с металлами.
Провести сравнительную оценку металлевязывающей активности пектинов с одинаковой степенью этерификации, полученных методом щелочной деэтерифи-кации и способом смешивания низкоэтерифицированных и высокоэтерифицирован-ных пектинов.
Оценить металл связывающую, гиполипидемическую и антитоксическую активность пектинов с разной степенью этерификации у экспериментальных животных.
Научная новизна. В работе впервые проведен анализ связи физико-химических свойств пектинов с их металлсвязывающей активностью. Исследованы сорбционные свойства пектинов, различающихся относительным содержанием эте-рифицированных и деэтерифицированных карбоксильных групп, полигалактуроно-вой кислоты, вязкостью. Установлено, что эффективность связывания металлов пектинами in vitro зависит от их физико-химических свойств, при этом более значимую роль играют такие параметры, как степень этерификации и содержание свободной ангидрогалактуроновой кислоты. Характеристическая вязкость играет меньшую роль, по крайней мере, по отношению к связыванию изученных металлов. Существенное влияние на связывание металлов пектинами оказывает кислотность среды. Сдвиг рН в щелочную сторону приводит к повышению сорбционной емкости по меди, кадмию, свинцу и железу. Сорбционная емкость пектинов по ртути практически не зависит от рН среды.
В качестве важного количественного параметра сорбционной активности пектинов предложен показатель теоретической сорбционной емкости, позволяющий более точно судить о количестве карбоксильных групп, участвующих в связывании металлов.
Установлено, что эффективность выведение тяжелых металлов из организма экспериментальных животных с помощью пектиновых веществ зависит от степени этерификации пектинов. Гиполипидемическая и гепатопротекторная активность пектинов не зависит от степени их этерификации.
Практическая значимость. На основе результатов экспериментальных исследований по оценке металлсвязывающей активности пектинов с разной степенью
7 этерификации разработана технологическая схема производства биологически активных добавок к пище, активным компонентом которых является низкоэтерифици-рованный пектин. Предложены к выпуску биологически активные пищевые добавки, сертифицированные в Федеральном центре Госсанэпиднадзора, зарегистрированные в Министерстве здравоохранения Российской Федерации (регистрационные удостоверения № 001310.Р.643.11.99 и № 001310.Р.643.11.99, которые разрешены для реализации через аптечную сеть в качестве источника пищевых волокон.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Всесоюзном семинаре «Проблемы производства продукции из красных и бурых водорослей» (Владивосток, 1987), Региональной конференции Сибири и Дальнего Востока «Перспективы развития малотоннажной рсимии» (Красноярск, 1989), 2-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), 5, 6 и 11-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 1999, 2004), 12-м съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), 4-м Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2000), 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы.
Работа содержит 16 рисунков и 36 таблиц. Библиография состоит из 219 отечественных и зарубежных источников.
Физико-химические свойства пектинов
По способности растворяться пектины могут быть двух типов: водорастворимые, или свободные, и водонерастворимые. Растворимость в воде зависит от степени полимеризации, числа и распределения метоксильных групп. Растворимость в воде увеличивается с уменьшением молекулярной массы пектина и увеличением степени этерификации карбоксильных групп. На растворение влияют рН раствора, температура, природа и концентрация растворенных веществ, а также соотношение пектин : сахар (Simpson et al., 1984). Скорость растворения пектина обычно рассматривается как более важный показатель по сравнению с абсолютной растворимостью, которая зависит, прежде всего, от распределения пектиновых цепочек в среде. В 70-х годах прошлого столетия было обнаружено, что сухой порошок пектина при попадании в водную среду быстро набухает (обводняется), образуя своеобразные агрегаты (Davis et al., 1980). Последние состоят из практически сухого пектина покрытого оболочкой из сильно обводненного внешнего пектинового слоя. Дальнейшее растворение пектиновых агрегатов проходит очень медленно. Интенсивность процесса растворения напрямую зависит от молярной массы и характеристической вязкости пектиновых агрегатов, что во многом определяется методов выделения пектина (Fishman et al., 2000). Для предотвращения образования комков сухой порошок пектина может быть смешан с каким-либо водорастворимым материалом. Также можно подвергнуть пектин технологической обработке, улучшающей растворимость пектина. В качестве дисперсных веществ для повышения растворимости пектина обычно применяют сахарную пудру или порошок D-глюкозы в соотношении 1 : 5-10. Установлено, что при большом количестве агрегатов пектина в вводном растворе хемолюминисценция последнего усиливается. Мутность пектиновых растворов увеличивается с повышением степени этерификации. Наибольшее количество медленно растворимых агрегатов полисахарида образуется в воде. При использовании в качестве растворителя слабо концентрированных растворов ацетатов лития или аммония показатели мутности раствора значительно снижаются (Fishman et al., 2001). Одной из важных физических характеристик пектина является характеристическая вязкость.
Наиболее высока вязкость у крупномолекулярных пектинов; с уменьшением размера молекулы уменьшается и значение характеристической вязкости (Forster et al., 2002). Важным свойством пектинов является их способность образовывать гель в присутствии ионов Са или сахара и кислоты. Гель формируется в результате образования непрерывной трехмерной сети полимерных молекул, поперечно связанных друг с другом в жидкой среде. На молекулярном уровне водный гель пектина состоит из трех элементов (Jarvis М.С., 1984): 1. Зоны контакта, представляющие собой элементарные ячейки, в которых полимерные молекулы жестко фиксированы; 2. Межконтактные участки относительно мобильных полимеров; 3. Вода, вовлеченная в полимерную сеть. Элементарная ячейка содержит одиночную ковалентную связь между двумя цепочками или комбинацию из водородных связей и гидрофобных взаимодействий между двумя полимерами, расположенными вдоль друг друга. Хотя формирование стабильного межмолекулярного связывания является основным требованиям для ге-леобразования, существуют некоторые ограничения взаимодействия между полимерами, что необходимо для образования гидратированной структуры, а не нерастворимого осадка (Axelos, Thibault, 1991). Полимеры, не образующие контактных зон, в водной среде остаются в растворенном состоянии, в то время как пектины, формирующие элементарные ячейки на протяжении всей длины молекулы, не растворяются до тех пор, пока факторы энтропии не будут препятствовать схождению цепей полимера. На молекулярном уровне пектиновый гель может быть рассмотрен как гомогенный, что отличает его от многих гелей, образованных денатурированными протеинами (Clark et al., 1992). На текстуру пектинового геля влияют степень этерификации, боковые цепи нейтральных Сахаров, ацетилирование и перекрестные участки пектиновых молекул (Baier et al., 1994). Пектиновые цепи заряжены отрицательно и, в зависимости от плотности заряженных частиц, молекулы отталкиваются друг от друга, что определяет межмолекулярное расположение пектиновых полимеров в растворе. Конформа-ция молекул не зависит от степени разветвленности молекулы, хотя последний фактор может вести к значительному усложнению пространственной структуры полимеров в концентрированных растворах (Hawang, Kokini, 1992). В чистых пектиновых гелях такой жидкой фазой является вода. Прочность геля зависит от степени полимеризации, этерификации и ацетилирования и от наличия боковых цепей из нейтральных Сахаров. Но механизм образования гелей различен у высокометоксилированных и низкометоксилированных пектинов. И те, и другие пектины образуют гели в присутствии кислоты (при рН ниже 3,6). Наличие сахара (обычно сахароза в концентрации более 55% по массе) в среде ведет к формированию слабого, неустойчивого геля в случае низкометоксилированного пектина, и бо- лее плотного в случае высокометоксилированого.
Обратная ситуация наблюдается в присутствии кальция. При смешивании высоко- и низкоэтерифицированного пектинов прочность геля обычно соответствует показателям того пектина, который образует более слабый гель в данной среде (Lofgren et al., 2002). Образование геля в вы-сокометоксилированных пектинах обеспечивают водородные связи и гидрофобные взаимодействия между галактуронановыми цепями (Davies et al., 1980; Walkinshaw, Arnott, 1981). Роль сахара в формировании гелей этих пектинов состоит в стабилизации соединительных зон за счет поддержания гидрофобных взаимодействий между эфирными (метиловыми) группами (Oakenfull, Scott, 1984). При увеличении давления прочность образовавшегося в присутствии сахара геля возрастает и остается неизменной даже после снижения давления до уровня атмосферного (Abbasi, Dickinson, 2002). Желирование низкометоксилированных пектинов происходит в результате образования в зоне контакта ионных связей через кальциевые мостики между карбоксильными группами, принадлежащими двум разным цепям. Прочность контакта пектиновых цепей усиливается благодаря образованию водородных связей между кислородными атомами гидроксильных групп и пиранозного кольца, с одной сторо-ны, и ионами кальция - с другой. Взаимодействие между ионами Са и цепями по-лигалактуроновой кислоты описывается моделью «egg-box» («упаковка для яиц»), предложенной для альгинатов (Kohn, 1987). В растворе длинные извитые молекулы пектина образуют клубок нитей (цепей). Эти нити могут располагаться друг от друга на разных расстояниях. Время от времени участки цепочки одной и той же или разных молекул очень близко подходят друг к другу и образуют зоны контакта. Элементарную ячейку зоны контакта, которую образуют четыре остатка галактуроновой кислоты, по два из двух цепочек, и один атом металла (например, кальция). Между атомом металла и кислородными атомами пиранозных циклов образуются водородные связи, а между атомом металла и карбоксильными группами — ионные связи. Помимо описанной модели известны еще как минимум две модели комплек-сообразования с кальцием: модель Walkinshow и Arnott (1981), в которой соотношение Са2+: RCOO равно 1 :3, и модель Mackie et al. (1983), в которой зона связывания иона кальция включает две карбоксильные группы и три атома кислорода (0-6, О-З и 0-2 ). Кальций особенно эффективен в комплексообразовании с углеводами вследствие того, что радиус его иона (0,1 им) сопоставим с естественным расположением атомов кислорода во многих сахарах (Angyal, 1989). Присутствие метиловых групп предотвращает образование зон контакта, а боковые цепи на молекулах пектина препятствует их агрегации (Smidsrod, Haug, 1971). И наоборот, чем больше свободных карбоксильных групп и чем меньше боковых цепей, тем более вероятно, что образуются кальциевые мостики.
Сырьевые источники изучаемых препаратов
Для получения различных образцов пектина использовали высокоэтерифици-рованный пектин, произведенный компанией Copenhagen Pectin A/S, Lille Skensved (Дания). Коммерческий пектин очищали от балластных веществ промывкой водно-спиртовыми растворами и высушивали. Полученные образцы имели следующие характеристики: содержание чистого галактуронана в молекуле пектина 79,4%, степень этерификации 60,2%, характеристическая вязкость 915 мл/г галактуронана. Для сравнительных исследований получали образцы низкоэтерифицированно-го пектина из морской травы Zostera marina, собранной в зал. Петра Великого (Японское море) в весенне-летний период. Экспериментальные исследования были выполнены на 135 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах массой 150 - 200 г. Животных содержали в виварии ТИБОХ ДВО РАН. Во время экспериментальных исследований крыс помещали в специальные пластмассовые клетки со стружечной подстилкой по 5 - 6 животных в каждой. В эксперименте по оценке выведения тяжелых металлов с фекалиями животные содержались в индивидуальных обменных клетках. Все животные помимо сбалансированного рациона получали овес, хлеб, свежие овощи и фрукты, мел, также в зимнее время были добавлены комплексные поливитаминные препараты. Основные требования к содержанию, выбору и подготовке животных для экспериментов осуществляли с принятыми рекомендациями. При разделении животных на группы проводили их ранжирование по массе тела с целью обеспечения идентичности указанных групп по данному показателю. Содержание животных, наркоз, де- капитацию проводили в соответствии с рекомендациями Рабочей группы Федерации Европейского Сообщества по науке лабораторных животных (Копаладзе, 1998). Степень этерификации и содержание ангидрогалактуроновой кислоты в пектинах определяли титриметрическим методом (Афанасьев и др., 1984). Характеристическую вязкость определяли, используя вискозиметр Уббелоде. Молекулярную массу вычисляли по эмпирическому уравнению Марка-Хауинка (Kravtchenko, Pilnik, 1990). Для определения общего холестерина в сыворотке крови к 12 мл смеси спирт-ацетон добавляли 0,3 мл сыворотки, смешивали, тщательно встряхивали и добавляли б мл эфира.
Раствор фильтровали, фильтрат выпаривали, осадок после охлаждения растворяли в 0,5 мл хлороформа и добавляли 1,9 мл ледяной уксусной кислоты. К 0,4 мл полученного раствора прибавляли 2,4 ледяной уксусной кислоты, 0,2 мл 1% раствора хлорного железа и медленно добавляли 2,0 мл концентрированной серной кислоты. Через 1 ч проводили спектрофотометрию при длине волны 580 нм (Портяная и др., 1990). Определение активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансфе-разы в сыворотке крови проводили с помощью наборов реактивов «Биолахема-тест». 0,25 мл субстрата аланинаминотрансферазы или аспартатаминотрансферазы инкубировали 3 мин при 37С, добавляли 0,05 мл сыворотки крови и инкубировали в течение 60 мин при 37С. К смеси добавляли 0,25 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Раствор перемешивали, оставляли на 20 мин, добавляли 2,5 мл раствора NaOH, перемешивали и спустя 10 мин измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 520 нм. Содержание диеновых коньюгатов ненасыщенных жирных кислот оценивали по характерному спектру поглощения раствора липидов в смеси изопропан — гексан. К 2,0 мл гомогената приливали 4,0 мл смеси изопропанол-гексан (1:1), встряхивали 10-15 мин на шейкере и прибавляли 1,0 мл раствора НС1 (рН=2,0) и 2,0 мл гексана. Смесь встряхивали и через 20-30 мин отбирали гексановый слой, в котором измеряли оптическую плотность при длине волны 232 нм (Владимиров, Арчаков, 1972) Для определения малонового диальдегида к 1,0 мл гомогената добавляли 1,0 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75% раствора тиобарбитуро-вой кислоты. Полученную смесь перемешивали и ставили на водяную баню на 15 мин, а затем центрифугировали. Оптическую плотность надосадочной жидкости, содержащей водорастворимые продукты перекисного окисления липидов, определяли при длине волны 532 нм (Yagy, 1984). Для измерения восстановленного глутатиона в печени, кусочки органа гомогенизировали, к 1 мл супернатанта приливали 120 мкл 50% раствора трихлоруксусной кислоты, пробу ставили на 30 мин на холод и центрифугировали. К 0,2 мл супернатанта приливали 1,8 мл 0,2 М трис-HCl (рН=8,5), 20 мкл раствора Элл мана и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 412 нм. (Anderson, 1985). 2.5. Статистическая обработка результатов Для статистического анализа и обработки результатов исследования рассчитывали средние арифметические величины и ошибки средних арифметических.
Оценку достоверности различия результатов экспериментальных наблюдений проводили в сравнении с контролем с применением t-критерия Стьюдента для малых величин (п 30). Для оценки результатов исследований с несколькими выборками использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими проведением post hoc теста Tkuey s. Уровень значимости считали достоверным при р 0,05 (Гублер, 1978, Fan, Li, 2000). Как мы уже упоминали в 1-й главе, большинство пектинов, применяемых в пищевой промышленности, относится к высокоэтерифицированным пектинам, то есть характеризуются степенью этерификации более 50%. Несмотря на то, что многие растительные объекты содержат пектиновые вещества со степенью этерификации менее 50%, далеко не все из них могут использоваться в качестве источника для получения низкоэтерифицированных пектинов и удовлетворять требованиям производства, а именно: а) доступность сырья, его относительная дешевизна и наличие достаточного количества возобновляемых запасов. В этом отношении наиболее удобным сырьем являются неликвидные и малоликвидные отходы какого-либо массового производства, например, сахара, растительного масла, соков и т.д.; б) кондиционность сырья, то есть соответствие его характеристик санитарным нормам и технологическим требованиям пищевого пектинового производства, а также возможность хранения и транспортирования к месту переработки; в) достаточно высокое содержание пектина в сырье (не менее 10-15%); г) удовлетворительные физико-химические и органолептические характеристики получаемого пектина, соответствующие областям его использования. Указанные требования, в первую очередь экономического характера, существенно ограничивают перечень потенциального сырья, и в настоящее время для промышленного производства использую два природных низкоэтерифицированных пектина - свекловичный со степенью этерификации около 40% и пектина из корзинок подсолнечника со степенью этерификации 30 -50% (Pilnik, Rombouts, L985). Методы получения обоих пектинов в общих чертах сходны и состоят из следующих основных этапов (Crandall et al., 1978; Hoebler et al., 1989; Renard et al., 1991): 1) гидролиз сырья и экстракция пектина раствором минеральной или органической кислоты; 2) отделение и очистка экстракта пектина; 3) осаждение пектина из экстракта; 4) отжим и промывание осадка пектина; 5) сушка и измельчение полученного пектина. Несмотря на широкую распространенность свеклы и подсолнечника как тех- j нологических культур и сравнительно простую технологию получения пектина из них, производство этих двух пектинов не получило широкого распространения. Одной из причин этого является невысокое качество получаемых пектиновых веществ, особенно свекловичных.
Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии со свинцом
Сорбционную емкость по свинцу изучали при рН от 2,0 до 6,0, так как при рН выше 6,0 происходит выпадение гидроксида свинца в осадок. Так же как и в опытах с медью, сорбционная емкость всех образцов пектина, выраженная в миллиграммах на грамм сорбента, закономерно снижается с увеличением степени этерификации. Эта закономерность наблюдается при всех исследованных значениях рН. При рН 2,0 у образца пектина со степенью этерификации 60,2% сорбционная емкость по свинцу в 2,95 раза меньше, чем таковая у образца пектина со степенью этерификации 1,2%. При рН 3,0 эти различия составляют 2,40 раза, при рН 4,0 - 2,28 раза, при рН 5,0 - 2,32 раза, при рН 6,0 - 2,24 раза. Для всех образцов пектинов отмечается повышение сорбционной емкости по мере увеличение рН. У пектина со степенью этерификации 1,2% сорбционная емкость по свинцу при рН 6,0 в 1,46 раза выше, чем при рН 2,0. У пектина со степенью этерификации 9,6% сорбционная емкость по свинцу при рН 6,0 в 1,44 раза выше, чем при рН 2,0. У пектина со степенью этерификации 18,8% эти различия составляют 1,48 раза, у пектина со степенью этерификации 27,4% - 1,51 раза, у пектина со степенью этерификации 40,1% - 1,57 раза, у пектина со степенью этерификации 52,0% -1,71 раза и у пектина со степенью этерификации 60,2% -1,93 раза (табл. 12). Сорбционная емкость по свинцу, выраженная в процентах от ТСЕ, также как и в случае с медью, практически не зависит от степени этерификации пектинов, корме сорбции при рН 2,0. При этом значении рН наблюдается некоторое снижение сорбционной емкости, и у образца со степенью этерификации 40,1% она ниже на 7,43%, чем у образца со степенью этерификации 1,2%, у образца со степенью этерификации 52,0% - на 13,3%, у образца со степенью этерификации 60,2% - на 21,9%. При остальных значениях рН сорбционная емкость у образцов с разной степенью этерификации различается не более, чем на 1-3%. При увеличении рН растворов с 2,0 до 6,0 сорбционная емкость по свинцу у пектинов со степенью этерификации 1,2%, 9,6%, 18,8%, 27,4%, 40,1%, 52,0 и 60,2% повышается в 1,47, 1,44, 1,48, 1,50, 1,57, 1,71, 1,92 раза, соответственно (табл. 13). На графике зависимости сорбции свинца пектинами от рН раствора видно, что относительная сорбционная емкость у всех образцов пектинов в целом возрастает с увеличением рН среды. На участке от рН 2,0 до рН 3,0 повышение относительной сорбционной емкости происходит достаточно быстро. При рН выше 3,0 эта величина изменяется более плавно. При рН 2,0 относительные сорбционные емкости у образцов пектина с различной степенью заметно различаются.
При рН 3,0 и выше эти различия становятся незначительными (рис. 4). В таблицах 14 и 15 отсутствуют данные для образцов VI и VII при рН 2,0S так как эти два высокоэтерифицированных пектина не образовывали осадок пектата кадмия и переходили в раствор. Сорбционная емкость по кадмию, выраженная в миллиграммах на грамм сорбента, у всех образцов пектина снижается с увеличением степени этерификации. При рН 2,0 у образца пектина со степенью этерификации 40,1% сорбционная емкость по кадмию в 4,19 раза меньше, чем таковая у образца пектина со степенью этерификации 1,2%. При рН 3,0 у образца пектина со степенью этерификации 60,2% сорбционная емкость по кадмию в 4,82 раза меньше, чем таковая у образца пектина со степенью этерификации 1,2%. При рН 4,0 эти различия составляют 4,27 раза, при рН 5,0 - 4,05 раза, при 6,0 — 3,86, при рН 7,2 — 3,81 раза и при рН 8,0 - 3,84 раза. У всех образцов пектинов отмечается повышение сорбционной емкости по мере увеличение рН. У пектина со степенью этерификации 1,2% сорбционная емкость по кадмию при рН 8,0 в 2,86 раза выше, чем при рН 2,0. У пектина со степенью этерификации 9,6% эта величина выше в 2,6 раза, у пектина со степенью этерификации 18,8% - в 2,51 раза, у пектина со степенью этерификации 27,4% — в 2,77 раза, у пектина со степенью этерификации 40,1% — в 5,25 раза (табл. 14). Сорбционная емкость по кадмию, выраженная в процентах от ТСЕ, в отличие от сорбционной емкости по меди, зависит от степени этерификации пектинов. При рН 2,0 эта величина у образца со степенью этерификации 40,1% в 2,38 раза ниже, чем у образца со степенью этерификации 1,2%. При рН 3,0 у образца со степенью этерификации 60,2% сорбционная емкость по кадмию (в % от ТСЕ) в 2,09 раза ниже, чем таковая у образца со степенью этерификации 1,2%. При рН 4,0 эти различия составляют 1,85 раза, при рН 5,0 - 1,76 раза, при рН 6.0 - 1,68, при рН 7,2 - 1,66 раза, при рН 8,0 - 1,67 раза (табл. 15). На графике зависимости сорбции кадмия от рН раствора видно, что относительная сорбционная емкость у всех образцов пектинов в целом возрастает с увеличением рН среды. На участке от рН 2,0 до рН 6,0 повышение относительной сорбционной емкости происходит достаточно быстро. При рН выше 6,0 эта величина изменяется незначительно. При всех значениях рН от 2,0 до 8,0 относительные сорбци- онные емкости у образцов пектина с различной степенью этерификации существенно различаются (рис. 5), 4.5. Сорбционная емкость пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с ртутью При рН выше 6,0 ртуть выпадала в осадок в виде оксида, поэтому сорбцион-ную емкость по ртути изучали при рН от 2,0 до 6,0. Сорбционная емкость всех образцов пектина, выраженная в миллиграммах на грамм сорбента, снижается с увеличением степени этерификации. Эта закономерность наблюдается при всех исследованных значениях рН. При рН 2,0 у образца пектина со степенью этерификации 60,2% сорбционная емкость по ртути в 2,61 раза меньше, чем таковая у образца пектина со степенью этерификации 1,2%. При рН 3,0 эти различия составляют 2,44 раза, при рН 4,0 - 2,35 раза, при рН 5,0 - 2,31 раза, при рН 6,0 - 2,35 раза.
В отличие от сорбции других металлов, сорбция ртути не зависела от рН растворов, в которых происходило взаимодействие металла с пектином. Сорбционная емкость (в мг/сорбента) у всех образцов пектинов практически не изменяется при увеличении рН от 2,0 до 6,0, за исключением образцов со степенью этерификации 52,0% и 60,2%, у которых различия в сорбционной емкости между крайними значениями рН составляют 6,7% и 10,1%, соответственно (табл. 16). Сорбционная емкость по ртути, выраженная в процентах от ТСЕ, также как и в случаях с медью и свинцом, практически не зависит от степени этерификации пектинов, корме сорбции при рН 2,0 и 3,0. При рН 2,0 у образца со степенью этерификации 60,2% сорбционная емкость по ртути ниже на 11,9%, чем у образца со степенью этерификации 1,2%, при рН 3,0 - на 5,8%. Величина рН раствора также мало влияла на сорбционную емкость по ртути для всех образцов пектинов. Различия этой величины у образцов со степенью этерификации 1,2%, 9,6%, 18,8%, 27,4% и 40,1%, зарегистрированные при рН 2,0 и 6,0 различаются не существенно. У образцов со степенью этерификации 52,0% и 60,2% эти различия составляют 6,7% и 10,2%, соответственно (табл. 17). В таблицах 14 и 15 отсутствуют данные для образцов VI и VII при рН 2,0S так как эти два высокоэтерифицированных пектина не образовывали осадок пектата кадмия и переходили в раствор. Сорбционная емкость по кадмию, выраженная в миллиграммах на грамм сорбента, у всех образцов пектина снижается с увеличением степени этерификации. При рН 2,0 у образца пектина со степенью этерификации 40,1% сорбционная емкость по кадмию в 4,19 раза меньше, чем таковая у образца пектина со степенью этерификации 1,2%. При рН 3,0 у образца пектина со степенью этерификации 60,2% сорбционная емкость по кадмию в 4,82 раза меньше, чем таковая у образца пектина со степенью этерификации 1,2%. При рН 4,0 эти различия составляют 4,27 раза, при рН 5,0 - 4,05 раза, при 6,0 — 3,86, при рН 7,2 — 3,81 раза и при рН 8,0 - 3,84 раза. У всех образцов пектинов отмечается повышение сорбционной емкости по мере увеличение рН. У пектина со степенью этерификации 1,2% сорбционная емкость по кадмию при рН 8,0 в 2,86 раза выше, чем при рН 2,0. У пектина со степенью этерификации 9,6% эта величина выше в 2,6 раза, у пектина со степенью этерификации 18,8% - в 2,51 раза, у пектина со степенью этерификации 27,4% — в 2,77 раза, у пектина со степенью этерификации 40,1% — в 5,25 раза (табл. 14). Сорбционная емкость по кадмию, выраженная в процентах от ТСЕ, в отличие от сорбционной емкости по меди, зависит от степени этерификации пектинов. При рН 2,0 эта величина у образца со степенью этерификации 40,1% в 2,38 раза ниже, чем у образца со степенью этерификации 1,2%.
Гиполипидемическая активность пектинов
Экспериментальные исследования на данном этапе проводили на лабораторных животных, у которых вызывали алиментарную гиперлипидемию и на этом фоне оценивали действие трех образцов пектина: образец I (степень этерификации 1,2), образец IV (степень этерификации 52,0) и образец VII (степень этерификации 60,2). В работе использовали две модели гиперлипидемии: жировую и сахарозную. На модели гиперлипидемии, вызванной внутрижелудочным введением с кормом холестерина (2%), свиного сала (5%) и холевой кислоты (0,25%) в течение 21 дня, все образцы пектина в дозе 50 мг/кг массы тела в сутки препятствовали повышению уровня триглицеридов и общего холестерина в сыворотке крови и печени крыс. В группе животных, получавших образец пектина I, содержание общего холестерина в сыворотке крови было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 28,1%, а триглицеридов - на 38,1%. В группе животных, получавших образец пектина VI, содержание общего холестерина в сыворотке было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 31,3%, а триглицеридов - на 42,9%. В группе животных, получавших образец VII, содержание общего холестерина в сыворотке было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 31,3%, а триглицеридов - на 33,3%. Уровень холестерина липопротеидов высокой плотности достоверно не отличался. В печени наблюдали достоверное снижение уровня и общего холестерина и триглицеридов в тех группах, которые получали пектины. В группе животных, получавших образец пектина I, содержание общего холестерина в печени было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 36,4%, а триглицеридов - на 36,2%. В группе животных, получавших образец пектина VI, содержание общего холестерина в печени было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 32,0%, а триглицеридов - на 33,7%. В группе животных, получавших образец пектина VII, содержание общего холестерина в печени было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 42,0%, а триглицеридов - на 22,8% (табл. 33). Достоверных различий по всем исследованным показателям между группами, получавшими пектины с разной степенью этерификации, не было выявлено.
На модели гиперлипидемии, вызванной высокоуглеводным рационом, когда к рациону добавляли сахарозу (20%) в течение 30 дней, все образцы пектинов в дозе 50 мг/кг массы тела в сутки также препятствовали повышению уровня холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и печени и практически не изменяли уровень ли-попротеидов высокой плотности в сыворотке крови. В группе животных, получавших образец пектина I, содержание общего холестерина в сыворотке крови было достоверно ниже, чем в группе с углеводной нагрузкой в среднем на 41,6%, а триглицеридов - на 38,9%. В группе животных, получавших образец пектина VI, содержание общего холестерина в сыворотке было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 36,5%, а триглицеридов - на 41,7%. В группе животных, получавших образец пектина VII, содержание общего холестерина в сыворотке было достоверно ниже, чем в группе с углеводной нагрузкой в среднем на 35,0%, а триглицеридов - на 38,9%. Уровень холестерина липопротеидов высокой плотности достоверно не отличался. В печени наблюдали достоверное снижение уровня и общего холестерина и триглицеридов в тех группах, которые получали пектины. В группе животных, получавших образец I, содержание общего холестерина в печени было достоверно ниже, чем в группе с углеводной нагрузкой в среднем на 44,3%, а триглицеридов - на 36,0%. В группе животных, получавших образец VI, содержание общего холестерина в печени было достоверно ниже, чем в группе с холестериновой нагрузкой в среднем на 26,5%, а триглицеридов - на 40,0%. В группе животных, получавших образец пектина VII, содержание общего холестерина в печени было достоверно ниже, чем в группе с сахарозной нагрузкой в среднем на 31,2%, а триглицеридов - на 43,6% (табл. 34). Достоверных различий по всем исследованным показателям между группами, получавшими пектины с разной степенью этерифика-ции, и на данной модели также не было выявлено. Данные, полученные на двух моделях, показывают, что пектины с разной степенью этерификации в исследованной дозе (50 мг/кг) в равной степени препятствуют развитию гиперлипидемии у крыс. Тетрахлорметановая интоксикация является классической моделью повреждения клеток печени, с помощью которой проводится отбор гепатопротекторных средств. В механизме повреждающего действия тетрахлорметана имеет место активация свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов. Мы использовали эту модель для изучения антитоксического действия пектинов вообще и сравнительной оценки этого эффекта у пектинов с разной степенью этерификации, в частности. Экспериментальные животные были разделены на группы. Первой группе, контроль-1, получавшей стандартную диету, за час до кормления внутрижелудочно, с помощью металлического зонда, вводили 1 мл оливкового масла в течение 7 дней. Остальным животным в течение этого периода также внутрижелудочно вводили тетрахлорметан в дозе 300 мг/кг массы тела в 1 мл оливкового масла. Через 7 дней часть животных умерщвляли и брали кровь для анализа. После этого животные, которым водили тетрахлорметан, были разделены на 4 группы. Животным группы контроль-И за час до кормления вводили 1 мл дистиллированной воды в течение 21 дня.
Остальным трем группам за час до кормления внутрижелудочно вводили один из образцов пектина (образцы I, VI или VII). По завершению эксперимента животных умерщвляли и кровь анализировали. Как и ожидалось, 7-ми дневное введение тетрахлорметана привело к повышению активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы в крови соответственно в 6,6 и 10,3 раза. Одновременно повысился уровень малонового диаль-дегида в 3, 5 раза, диеновых коньюгатов - в 2,6 раза, а уровень восстановленного глутатиона уменьшился в 3,3 раза. Через 21 день в группах животных, которым вводили пектины, все регистрируемые показатели достоверно отличались от соответствующих биохимических параметров животных, которым на протяжении этого периода пектины не вводили. В группе животных, получавших образец пектина I, активность аланинаминотрансферазы в крови была ниже, чем в контрольной (+CCI4) группе в 2,1 раза, а активность аспартатаминотрансферазы в 3,2 раза. В группе животных, получавших образец пектина VI, активность аланинаминотрансферазы в крови была ниже, чем в контрольной (+ССЦ) группе в 1,8 раза, а активность аспартатаминотрансферазы в 3,0 раза. В группе животных, получавших образец пектина VII, активность аланинаминотрансферазы в крови была ниже, чем в контрольной (+ССІ4)группе в 1,7 раза, а активность аспартатаминотрансферазы в 2,5 раза (табл. 35). Кроме уменьшения активности ферментов, поступающих в кровь при цитолизе гепатоцитов, пектины влияли и на показатели активности прооксидантных и антиоксидантних систем. В группе животных, получавших образец пектина I, уровень малонового диальдегида в крови был ниже, чем в контрольной (+ССІ4) группе на 55,8%, диеновых коньюгатов - на 45,4%, а уровень восстановленного глутатиона был выше на 174,7%. В группе животных, получавших образец пектина VI, уровень малонового диальдегида в крови был ниже, чем в контрольной (+ССЦ) группе на 38,9%, диеновых коньюгатов - на 47,0%, а уровень восстановленного глутатиона был выше на 148,7%. В группе животных, получавших образец пектина VII, уровень малонового диальдегида в крови был ниже, чем в контрольной (+ССЦ) группе на 41,2%», диеновых коньюгатов - на 52,2%, а уровень восстановленного глутатиона был выше на 155,9%. (табл. 36). Анализ литературы, посвященной фармакологическим свойствам пектинов, свидетельствует о существовании противоречий как результатов близких по содержанию работ, так и их интерпретации. Большинство авторов приходит к выводу, что эти противоречия обусловлены отсутствием стандартизованных препаратов исследованных пектинов. В различных работах используются пектины, во-первых, неодинакового происхождения (цитрусовые, яблочные, свекловичные), во-вторых, с разной степенью этерификации природных пектинов, в-третьих, с разной молекулярной массой, в-четвертых, с неодинаковыми реологическими свойствами (Change et al., 1994).
