Введение к работе
Актуальность. Одной из актуальных проблем современной биомедицины, в частности фармакологии, является поиск и изучение веществ, стимулирующих когнитивные функции мозга (внимание, познавательная деятельность, процессы обучения и памяти). Нарушения этих функций характерны для широкого круга неврологических и психических заболеваний, в том числе травматических повреждений мозга, цереброваскулярных расстройств, нейродегенеративных заболеваний мозга (болезнь Альцгеймера, Паркинсона). Когнитивные нарушения относятся к одному из важнейших проявлений шизофрении. Для лечения когнитивных нарушений широкое применение получили ноотропные препараты, в том числе пирацетам и его аналоги [Воронина Т.А. и Середенин СБ., 1998]. Вместе с тем известно, что ноотропные средства не лишены ряда недостатков, что свидетельствует о целесообразности поиска новых соединений с подобным профилем действия. Важно отметить, что пирацетам и его аналоги неэффективны при когнитивных нарушениях в основе которых лежит нейродегенеративное повреждение мозга. В связи с этим возникает необходимость создания и изучения механизма действия веществ, обладающих не только ноотропной, но и нейропротекторной активностью [Островская Р.У. и соавт., 2002].
Оригинальное направление нейробиологии и психофармакологии памяти и обучения' связано с исследованиями пептидов, являющихся фрагментами адренокортикотропного гормона (АКТГ). Было показано, что ряд структурных аналогов АКТГ обладают способностью активировать процессы обучения и памяти у животных и человека [De Wied, 1997]. Недостатком этих соединений оказалась короткая продолжительность эффекта, связанная с их быстрой метаболической деградацией в организме.
В исследованиях Института молекулярной генетики РАН и кафедры физиологии человека и животных МГУ им. М.В.Ломоносова было обнаружено, что модификация фрагмента АКТГ4-7 путем введения дополнительной аминокислотной последовательности Pro-Gly-Pro с С-конца молекулы приводит к значительному увеличению продолжительности действия пептида [Пономарева-Степная М.А. и соавт., 1986]. Результатом этих исследований явилось создание нового оригинального гептапептида - семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-GIy-Pro), обладающего широким спектром
нейротропной активности [Ашмарин И.П. и соавт., 1997]. В настоящее Бремя семакс
широко применяется в клинике в качестве ноотропного и неиропротекторного средства при лечении когнитивных расстройств, неврологических нарушений при остром ишемическом инсульте, в офтальмологии и других областях медицины.
Известно о тесных функциональных и анатомических, связях между меланокортиновой и моноаминергическими системами мозга [Florijn et al., 1993; Drago et al., 1999; Lindblom et al., 2001]. He вызывает сомнения также участие дофаминергической и серотонинергической систем мозга в процессах памяти и нейрональной пластичности [Раевский К.С., 1998; Barros et al., 2003; Hefco et al., 2003; Jay, 2003]. В то же время, нейрохимические механизмы, лежащие в основе действия аналогов АКТГ, в частности семакса, до настоящего времени изучены недостаточно. Несмотря на наличие у семакса антиишемических и антигипоксических свойств, нейропротекторные свойства пептида на нейрогоксических моделях повреждения мозга не исследовались.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение влияния семакса (AKTT4-7-Pro-Gly-Pro) на нейрохимические характеристики серотонин- и дофаминергических систем мозга, а также оценка возможной нейропротекторной активности пептида на моделях дофамин- и серотонинергической нейротоксичности в условиях in vitro и in vivo.
В соответствии с указанной целью, были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние семакса на нейрохимические характеристики серотонинергических систем мозга животных: тканевое и внеклеточное содержание серотонина и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в гипоталамусе и стриатуме мозга животных.
Исследовать эффекты семакса на нейрохимические параметры дофаминергической системы мозга: тканевое и внеклеточное содержание дофамина и его метаболитов 3,4-дигидроксифенилуксусной (ЦОФУК) и гомованилиновой кислот (ГВК) в стриатуме, а также способность семакса модулировать психостимулирующее действие d-амфетамина.
Оценить возможную нейропротекторную активность семакса в культуре мезенцефалических нейронов, полученных из эмбрионального мозга крыс (Е16), при моделировании цитотоксического повреждения, обусловленного 6-гидроксидофамином (6-ОНДА) in vitro.
Оценить нсйропротекторные свойства с семакса на моделях дофаминергической нейротоксичности, вызванной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидрошфидином (МФТП) и d-амфетамином на мышах линии С57/Ы.
Изучить нейропротекторные свойства семакса на модели серотонинергической нейротоксичности, вызванной внутримозговым введением 5,7-дигидрокситриптамина (5,7-ДГТ) на мышах линии С57/Ы.
Научная новизна. При изучении эффектов семакса на нейрохимические показатели моноаминергических систем мозга впервые показано, что семакс вызывает активацию серотонинергических систем мозга, которая проявляется в повышении тканевого и внеклеточного содержания метаболита серотонина 5-ГИУК через 30 мин, 2 и 24 ч после введения пептида. В микродиализных исследованиях на свободноподвижных крысах обнаружено свойство семакса усиливать эффект d-амфетамина, проявляющийся в повышении внеклеточной концентрации дофамина в диализатах стриатума, что свидетельствует об усилении дофаминергической нейропередачи в этих условиях. Потенцирующее влияние семакса на психостимулирующие эффекты d-амфетамина проявляется, также, в экспериментах с регистрацией локомоторной активности мышей линии С57/Ы.
Впервые проведено исследование нейропротекторной активности семакса с использованием моделей дофамин- и серотонинергической нейротоксичности in vitro и in vivo. Выявлен цитопротекторный эффект семакса в нейро-глиальной культуре клеток мезенцефалона крыс (Е16) in vitro при их нейротоксическом повреждении 6-гидроксидофамином, который, однако, не проявляется в нейрональной культуре клеток, полученных из того же отдела мозга. На моделях дофамин- и серотонинергической нейротоксичности на мышах линии С57/Ы ex vivo выявлены умеренные нейропротекторные эффекты семакса в стриатуме при воздействии d-амфетамина (р<0,1) и 5,7-дигидрокситриптамина (р<0,05).
Научно-практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют представления о нейрохимических и нейропротекторных свойствах семакса, а также вносят существенный вклад в понимание нейрохимических основ механизма действия семакса как оригинального нейротропного средства. Результаты, полученные в диссертационной работе, раскрывают новый аспект механизма действия семакса - его способность усиливать действие веществ, активирующих дофаминергическую передачу
в мозге. Обнаружено также свойство семакса оказывать позитивное модулирующее влияние на серотонинергическую передачу в структурах мозга. Эти данные могут послужить основой для разработки новых стратегий терапии дофамин и серого ниндефицитных состояний.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии», Казань, 2001; Всероссийской научной конференции «Нейрофармакология в XXI веке», Санкт-Петербург, 2002; II Съезде Российского Научного Общества Фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии», Москва, 2003; Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, Москва, 2003; на межлабораторной конференции Института молекулярной генетики РАН, 2004, а также на лабораторных и межлабораторных конференциях ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и б тезисов.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их
обсуждения, заключения, выводов и списка литературы содержащего 53 отечественных
и 265 зарубежных источников. Диссертация содержит 5 таблиц и 28 рисунков.
В работе было использовано 296 самцов мышей линии С57/Ы массой 18-24 г, 35 самцов крыс линии Спрег-Доули и 10 самцов крыс линии Вистар массой 250-300 г.
В работе использовали следующие фармакологические агенты: семакс [ИМГ РАН], МФТП [ГУ НИИФ РАМН], паргилин [Serva], 5,7-ДГТ [Пика], d-амфетамин, 6-ОНДАи NSD1015 все - [Sigma]. Для приготовления буферных растворов, перфузирующих растворов, сред для культивирования клеток in vitro, а также подвижных фаз для хроматографического разделения веществ использовались реактивы фирм Биохром, ICN, Merk, Sigma.
1. Определение тканевого содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга методом ВЭЖХ. Мышей С57/Ы забивали через указанные промежутки времени после введения веществ, выделяли структуры мозга, которые размельчали на холоду в гомогенизаторе Поттера стекло-тефлон. Структуры гомогенизировали в 40 объемах среды выделения, которая содержала 0,1н НСЮ4 с добавлением внутреннего стандарта 2,3-дигидроксибензойной кислоты (0,25 нмоль/мл). Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин (+4С) на центрифуге K70D (ГДР). Супернатант использовали для определения моноаминов и их метаболитов.
Содержание дофамина (ДА), серогонина (5-НТ) и их метаболитов ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК определяли с помощью ВЭЖХ с ЭД на хроматографе LC - 304 Т (BAS, США) и Gilson-307 на колонке Phenomenex С-18, 4 мкм, 150x4,6 мм и амперометрическом детекторе LC - 4В с ячейкой TL - 5 (BAS, США). Измерения проводили на стеклоуглеродном электроде +0.85В против электрода сравнения Ag/AgCl. Объем
вводимого образца составлял 20 мкл. Подвижная фаза содержала (г/л): дигидрофосфат калия - 9,56; цитрат натрия - 5,76; 1-октансульфонат натрия - 0,4 г; ЭДТА Na2 — 0,1; ацетонитрил - 8%, рН - 3,0. Скорость подвижной фазы составляла 1,0 мл/мин [Кудрин B.C. исоавт., 1995].
2. Определение внеклеточного содержания моноаминов и их метаболитов в
стриатуме свободноподвижных крыс с использованием методики внутримозгового
микродиализа и ВЭЖХ. Крыс линии Спрег-Доули анестезировали хлоралгидратом
(400 мг/кг, в/б) и фиксировали в стереотаксическом аппарате. В работе применялись
аналоги микродиализных зондов СМА12 (СМА Microdialysis, Швеция) изготовленные в
лаборатории по оригинальной методике (с диализной мембраной проницаемостью до 10
кДа), которые имплантировали в стриатум с координатами АР +0,5, L -3.0, DV +6,5
относительно т. Брегма [Paxinos & Watson, 1986] и фиксировали на черепе. Перфузию
проводили через 1 сут после имплантации зондов искусственной цереброспинальной
жидкостью, содержащей (в мМ): Na+ - 155,0, К* - 2,9, Са1+ - 1,1, Mg2* - 0,8, CI* - 133,0,
рН - 7,4 (30 мин 5% СОг). Для подачи жидкости использовали шприцевый насос (СМА,
Швеция), скорость тока составляла 2 мкл/мин. Для «уравновешивания»
имплантированных зондов их перфузировали в течение 1-1,5 ч перед экспериментом.
Диализаты собирали каждые 20 мин в течение всего эксперимента. Для предотвращения
разрушения моноаминов в каждую пробирку предварительно добавляли 10 мкл 0,Ш
НС1.3-4 базальные пробы были собраны перед первой инъекцией препарата.
Образцы диализата (50 мкл) без дополнительной очистки анализировали на содержание ДА, ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК с помощью ВЭЖХ с ЭД на хроматографе ESA 850 с электрохимическим детектором Coulochem II (ESA) и ячейкой Microdialysis Cell 5014 В (ESA) при потенциалах -175 и +200 мВ на колонке Phenomenex С-18, 4 мкм, 150x4,6 мм. Подвижная фаза содержала (г/л): дигидрофосфат натрия - 9,16; цитрат натрия - 5,76; 1-октансульфонат натрия - 0,4; ЭДТА Na2 — 0,1; ацетонитрил - 8%, рН -2,8. Скорость потока подвижной фазы составляла 1,0 мл/мин [Андяржанова Э.А. и соавт., 1999].
Эффекты веществ рассчитывали по отношению к среднему содержанию ДА, ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК в базальньж образцах. По окончании эксперимента животных декапитировали и проводили морфологический контроль для определения положения зонда.
3. Методика оценки скорости биосинтеза дофамина и серотонина в структурах
мозга мышей линии С57/Ы. Для изучения эффектов семакса на скорость биосинтеза
дофамина и серотонина использовали центральный ингибитор декарбоксилазы 1-
ароматических аминокислот NSD 1015. По скорости накопления диоксифенилаланина
(ДОФА) и 5-гидрокситрипгофана (5-ГТ) судили об активности ключевых ферментов
биосинтеза дофамина и серотонина - тирозингидроксилазы (ТГ) и
триптофангидроксилазы, соответственно.
Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили однократно или хронически ежедневно в течение 1 недели. NSD 1015 в дозе 100 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до декапитации животньж. Тканевое содержание ДОФА, 5-ГТ, а также ДА, 5-НТ, ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК в стриатуме мозга мышей определяли с помощью ВЭЖХ с ЭД.
4. Методика регистрации спонтанной двигательной активности мышей линии
С57/Ы.
Регистрацию индивидуальной локомоторной активности мышей проводили с помощью установки Opto-Varimex (США) в течение 10 мин. В каждой группе было 10-14 животньж. В ходе опыта животньж каждой группы трижды последовательно
помещали в регистрационную камеру, измеряя их двигательную активность в течение 10 мин [Новоселов И.А. и Раевский К.С., 2003]. Первая посадка - тестирование 0-10 мин, сразу после этого введение семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б) или 0,9% NaCl. Вторая посадка - через 10 мин после инъекции (20-30 мин), сразу после этого введение d-амфетамина в дозе 2 мг/кг (в/б) или 0,9% NaCl. Третья посадка - через 20 мин после второй инъекции (50-60 мин).
5. Моделирование нейротоксического повреждения.
5.1. Моделирование повреждения дофаминергических нейронов, вызванного 6-ОНДА в мезенцефалических клеточных культурах in vitro
Получение нейроналъной культуры клеток Культуру нейронов получали из среднего мозга 16-дневных (Е16) эмбрионов крыс линии Вистар. Ткань мезенцефалона ресуспендировали в среде, содержащей DMEM:F-12 (1:1) с 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Суспензию клеток в объеме 500 и 150 мкл и плотностью 200 и 60 тыс/лунку помещали, соответственно, на 48- и 96-луночные плашки (Costar), предварительно (за 1 сут) обработанные поли-L-лизином (0,1 мг/мл). Клетки культивировали в среде DMEM:F-12 (1:1), содержащей: HEPES 15мМ, NaHC03 1,2 г/л, d-глюкозу 6 г/л, 1-глутамин 0,665 г/л, трансферин 0,1 г/л, инсулин 0,025 г/л, путресцин 100 нМ, селенит 30 нМ и прогестерон 20 нМ при 3 гС, 5% 0( И 100% отн. влажности воздуха [Konig et al 1989; Lauderetal, 1989].
Получение смешанной нейро-глиалъной культуры клеток. Все операции проводились как описано выше за исключением того, что клетки содержали в 48-луночных плашках в объеме 500 мкл и плотностью 200 тыс/лунку в среде (см. выше), содержащей также 10% эмбриональной бычьей и 10% лошадиной сыворотки (HS).
Добавление веществ к культурам. На 5-е сутки in vitro в нейрональные и нейроглиальные культуры клеток добавляли 6-ОНДА в конечной концентрации 5 мкМ в объеме 1% от общего объема среды. Семакс в концентрациях 0,1 и 1 мкМ в объеме 1% от общего объема среды добавляли к культурам за 24 ч (4-е сутки in vitro) или за 30 мин (5-е сутки in vitro) до добавления токсина.
Иммуноцитохимическое определение количества ТГ-положительных нейронов. Через 24 ч после добавления 6-ОНДА (6-е сутки in vitro), нейрональные и нейроглиальные культуры клеток (48-луночные плашки) фиксировали 4% параформальдегидом в течение 1 ч. Фиксированные клетки инкубировали в течение ночи в растворе PBS (0,015 М), содержащем 2% HS, 0,1% Triton Х-100 и моноклональные антитела (разведение 1:5000) к тирозингидроксилазе (ТГ) [Sigma]. Дальнейшую окраску клеток осуществляли с помощью Vectastain ABC Kit [Vector] и диаминобензидина. Количество дофаминергических нейронов в культурах определяли путем подсчета количества ТГ-положительных нейронов в половине лунки на микроскопе Olympus СКХ41 (Япония).
Оценка выживаемости нейронов (МТТ анализ). Через 24 ч после добавления 6-ОНДА, к нейрональным культурам клеток (96-луночные плашки) добавляли митохондриальный краситель 3-(4,6-диметилтиазолил-2)-2,6-дифенилтетразол бромид (МТТ) в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Через 5 ч инкубации при 37С и 5% С02 образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО в течение 30 мин при перемешивании. Оптическую плотность, которая была прямо пропорциональна количеству живых клеток в культуре, определяли при 600 нм на автоматическом шишечном спектрофотометре (ELISA Reader).
5.2. Моделирование повреждения дофаминергических нейронов, вызванного
МФТП in vivo. 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) вводили
однократно (30 мг/кг, в/б) мышам линии С57/Ы. Нейротоксический эффект МФТП
определяли через 1 нед нейрохимически, измеряя тканевое содержание дофамина и его
метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме мозга мышей линии С57/Ы [Sedelis et al, 2000].
Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до и через 2 ч после введения нейротоксина и далее каждые сутки в течение 1 недели.
5.3. Моделирование повреждения дофаминергических нейронов, вызванного
d-амфетамином in vivo. D-амфетамин (5 и 10 мг/кг, в/б) вводили 4-х кратно через
каждые 2 ч мышам линии С57/Ы при температуре окружающей среды 21-25 С.
Нейротоксический эффект d-амфетамина определяли через 1 нед нейрохимически,
измеряя тканевое содержание дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме
мозга мышей линии С57/Ы.
Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до каждого введения психостимулятора и далее каждые сутки в течение 1 недели.
5.4. Моделирование повреждения серотонинергических нейронов, вызванного
5,7-дигидрокситриптамином in vivo. 5,7-дигидрокситриптамин (5,7-ДГТ) в количестве
50 мкг (в пересчете на основание) вводили в объеме 5 мкл в латеральный желудочек
мозга мышей линии С57/Ы с координатами АР = -0,6, L = 1,2, DV = 2,5 относительно т.
Брегма [Franklin & Paxinos, 1997]. Нейротоксический эффект определяли
нейрохимически, измеряя тканевое содержание серотонина и 5-ГИУК во фронтальной
коре, гипоталамусе и стриатуме мозга мышей линии С57/Ы через 1 нед после введения
нейротоксина [Hall et al, 1999]. Также определяли индивидуальную двигательную
активность мышей в установке Opto-Varimex в течение 10 мин на 2-е и 6-е сутки после
введения 5,7-ДГТ.
Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до и через 2 ч после введения нейротоксина и далее каждые сутки в течение 1 недели.
6. Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 5.О. Результаты нейрохимических экспериментов (тканевое содержание моноаминов и их метаболитов), поведенческих экспериментов, а также опытов с культурами клеток in vitro обрабатывались с использованием непараметрического U-кригерия Манна-Уитни. Результаты микродиализных экспериментов обрабатывались с помощью дисперсионного анализа ANOVA для повторных измерений с использованием Duncan's post hoc критерия. Данные представлены в виде среднее!стандартная ошибка среднего.
