Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1. Роль иммунной системы в регуляции физиологических процессов в организме 13
2. Классификация и биологические эффекты современных иммунотропных средств 29
3. Влияние производных бензимидазола на некоторые физиологические процессы в условиях нормы и патологии 40
2. Собственные результаты и их обсуждение
4. Материалы и методы 51
5. Первичная оценка иммунотропнои активности конденсированных производных бензимидазола 57
5.1. Влияние производных бензимидазола на массу и клеточность селезенки на фоне антигенной стимуляции 57
5.2. Влияние производных бензимидазола на продукцию антител в реакции гемагглютинации 65
5.3. Влияние производных бензимидазола на формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа 68
5.4. Зависимость иммунотропнои активности от химической структуры производных бензимидазола 69
6. Дозозависимость иммунотропного эффекта производных бензимидазола РУ-185, РУ-25 4, РУ-284 и РУ-355 75
7. Влияние производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 на показатели периферической крови и лимфоидных органов 86
7.1. Влияние производных бензимидазола на массу и клеточность тимуса и селезенки 8 6
7.2. Влияние производных бензимидазола на показатели белой крови 89
8. Влияние производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 на фагоцитарную активность нейтрофилов 95
9. Зависимость иммунотропного эффекта производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 от фазы иммуногенеза 98
10. Изучение иммунокорригирующеи активности производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 при экспериментально вызванной иммуносупрессии 107
11. Обсуждение результатов исследования 112
Выводы 135
- Классификация и биологические эффекты современных иммунотропных средств
- Влияние производных бензимидазола на продукцию антител в реакции гемагглютинации
- Влияние производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 на показатели периферической крови и лимфоидных органов
- Изучение иммунокорригирующеи активности производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 при экспериментально вызванной иммуносупрессии
Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время накоплены убедительные научные данные, дающие основание утверждать, что роль иммунной системы в организме много шире, чем ее защитная или цензорная функция.
Исследования последних лет доказывают, что лимфоид-ная ткань занимает одно из центральных мест в адаптации организма к действию различных экстремальных факторов не только в качестве резерва энергетического и пластического материала, но и потому, что лимфоциты под влиянием подобных воздействий изменяют свои свойства, и, как следствие, передаваемую с их помощью к различным органам и тканям информацию (Черешнев В.А. и соавт., 2003) .
Доказана принципиальная возможность воздействия иммунной; системы на ДНК, РНК и ферментативные системы клетки (Антоненко В.Т., 1979; Ломакин М.С., 1990; Karounos D.G. et al., 1988).
Сложилось отчетливое представление о том, что при любом стрессе иммунная система занимает одно из важных мест. Доказан факт поступления лимфоидных клеток в первые 6-12 часов после стрессирующего воздействия из тимуса и селезенки в различные органы и ткани, в том числе и костный мозг, где они могут осуществлять свою функцию. Эта срочная миграция различных лимфоидных клеток не имеет специального характера и является фрагмен том общей адаптационной реакции в отношении любого неблагоприятного воздействия на организм (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983).
В последние годы накоплено много данных, касающихся синтеза клетками иммунной системы гормонов, играющих регулирующую роль в функционировании многих систем и органов (Кветной И.М., 2000).
Большое количество наблюдений подтверждают иммунную регуляцию апоптоза, что является еще одним механизмом физиологической регуляцией обновления тканей (Ханана-швили Я.А. и. соавт., 2001).
В настоящее время общепризнано, что иммунная и эндокринная системы перекрестно взаимодействуют, используя сходные или тождественные лиганды и рецепторы (Say-ino W. et al., 1999). Представляется вероятным, что. . в поддержании гомеостаза и при действии на организм различных экстремальных факторов нервная, эндокринная и иммунная системы действуют как единое целое, дополняя и дублируя друг друга. Но, в зависимости от природы воздействия, в регуляции адаптивных и компенсаторных реакций ведущей становится одна из них.
Возможная общность регуляторных механизмов этих систем выдвигает новый аспект гомеостатического контроля многих патологических состояний (Черешнев В. А. и соавт. , 2003).
Таким образом, регулируя функции иммунной системы, можно опосредованно воздействовать на различные физиологические процессы.
Кроме того, стимулом к созданию, и детальному изучению новых иммунотропных средств является также тот факт, что в последнее время в популяции отмечается интенсивный рост первичных форм иммунодефицитов, а также вторичной иммунной недостаточности, обусловленной различными стрессовыми состояниями, нарушением сбалансированности питания с дефицитом белков, витаминов, микроэлементов, длительной антибиотико- и химиотерапии при большинстве хронических заболеваний, ожогов, тяжелых травм; и; др. (Манько В.М., 2002) . .,. . .
Ситуация утяжеляется нарастающим экологическим неблагополучием и возрастающей нагрузкой на организм неблагоприятных антропогенных факторов (Черешнев В.А. и соавт., 2001) , а также возрастающей неэффективностью традиционных методов терапии заболеваний, ростом устойчивости патогенных факторов к традиционным- лекарственным средствам и1 др.
Сложившаяся обстановка делает проблему фармакологической профилактики патологических состояний и лечения возникших иммунологических заболеваний, диктующих, в свою очередь, необходимость поиска новых эффективных иммунотропных лекарственных веществ, весьма актуальной.
Иммуностимуляторы в настоящее время используются в разных областях медицины с различной целью - для повышения неспецифической резистентности к инфекциям и эффективности химиотерапевтических средств, для коррекции иммунодепрессивной терапии, в онкологии- и гематологии, с целью устранения бактерионосительства (Манько В.М., 2002; Сибиряк СВ., .1990) . Значение иммуностимуляторов возрастает и в связи с необходимостью устранения побочных эффектов применения иммуносупрессоров при трансплантации органов и тканей и лечении лейкозов (Хаитов P.M., 2004) .
Актуальность изучения иммунодепрессивных свойств ле- . карственных средств обусловлена успехами, достигнутыми в лечении ряда аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, бронхиальная астма и др. Исследования последнего времени указывают на ведущее значение селективных препаратов (Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000).
Лекарственные средства, применяемые для профилактики и лечения иммунопатологических состояний, не всегда отвечают предъявляемым требованиям. Это связано с токсичностью ряда иммуномодуляторов, наличием у них побочных явлений, а также с неселективностью модулирующего эффекта (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2004).
В этой связи перспективным химическим классом могут явиться новые конденсированные производные имида-зо(1,2а)бензимидазола, обладающие широким спектром воздействия на физиологические процессы в условиях нормы и патологии.
Актуальность этих исследований обусловлена: во-первых, тем, что в указанном ряду химических соединений уже найдены вещества с выраженными иммуностимулирующими свойствами (дибазол, беметил, тиетанилбензимидазолы); во-вторых, новыми полученными данными об их механизме действия. Доказано, что бензимидазол близок по строению к пуриновым основаниям нуклеиновых кислот - аденину и гуанину, что объясняет его способность стимулировать синтез РНК и, как следствие, синтез различных белков. Активизирующее действие этих веществ может, по-видимому, реализоваться и на уровне системы иммунитета.
Цель исследования.
Изучить иммунотропную активность новых конденсированных производных бензимидазола,. выявить перспективные соединения для дальнейшей разработки и создания на их основе иммуномодулирующих препаратов.
Задачи исследования.
1.-Провести первичное изучение иммунотропной активности одиннадцати конденсированных производных бензимидазола: РУ-13, , РУ-36, РУ-64, РУ-85, РУ-185, РУ-254, РУ-284, РУ-355, РУ-354, РУ-670, РУ-353, исследовав их влияние на гуморальные и -клеточные звенья иммунитета при первичном иммунном ответе мышей на эритроциты барана. Выявить наиболее перспективные из них для дальнейшей разработки соответственно поставленной цели.
2. Изучить степень влияния исследуемых перспективных производных бензимидазола на функциональное состояние лимфоидных органов и некоторые показатели гемопоэза.
3. Изучить зависимость иммунотропного эффекта исследуемых перспективных производных бензимидазола от используемой дозы - «доза-эффект».
4 . Изучить зависимость иммунотропного эффекта исследуемых перспективных производных бензимидазола от фазы иммуногенеза - «время-эффект».
5. Изучить степень влияния исследуемых перспективных производных бензимидазола на неспецифическое звено иммунного ответа.
б. Провести оценку перспективных производных бензимидазола как иммунокорректоров на фоне экспериментально вызванной циклофосфановой иммунодепрессии.
Научная новизна. Впервые изучены иммунофизиологические аспекты влияния одиннадцати новых конденсированных производных бензимидазола (Ng и Ni. замещенных имида-зо(1,2а)бензимидазолов) с целью выявления перспективных соединений для дальнейшей разработки и создания на их основе иммуномодулирующих препаратов.
Впервые получены данные, что производные бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 стимулируют пролиферацию тимоцитов и спленоцитов; вызывают выраженные изменения показателей белой крови, стимулируя процессы лейкопоэза. Повышают фагоцитарную активность нейтрофи-лов периферической крови, увеличивая количество активных клеток; оказывают влияние на клеточное и гуморальное звенья первичного иммунного ответа. Определены наиболее эффективные минимальные дозы изученных веществ и оптимальное время введения в зависимости от фазы иммуногенеза. Выявлена их способность оказывать иммуно-корригирующее действие в условиях экспериментально вызванной циклофосфановой иммунодепрессии.
Научно-практическая значимость работы заключается в. том, что проведенные исследования позволили выявить им-мунотропность ряда новых конденсированных производных имидазо(1,2а)бензимидазола. В ходе работы выбраны наиболее перспективные соединения для их дальнейшей разработки с целью создания на их основе новых лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Производные бензимидазола обладают иммунотропно-стью. Наиболее перспективными из них по влиянию на клеточное (РГЗТ) и гуморальное (число АОК, РПГА) звенья иммунитета являются химические соединения,. известные под лабораторными шифрами РУ-185, РУ-25.4, РУ-284 и РУ-355.
2 . Иммунотропный эффект веществ РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-353 проявляется при их применении в дозах от 1/20 до 1/5 LD50, что позволяет рекомендовать дозу 1/20 LD5o как базовую.
3. Конденсированные производные бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-353 эффективно воздействуют на показатели иммунитета при введении в различные фазы иммуногенеза.
4. Конденсированные производные бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 оказывают стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов.
5. Конденсированные производные бензимидазола РУ-185,- РУ-254, РУ-284 и РУ-355 стимулируют пролиферацию клеток тимуса, селезенки, а также нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов периферической крови.
6. Конденсированные производные бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 восстанавливают индукцию РГЗТ и уровень выработки антител к эритроцитам барана в РПГА
после экспериментально вызванной циклофосфановой имму нодепрессии.
Апробация диссертации.
Апробация диссертации проведена на III, IV и V международных конференциях «Клинические исследования лекарственных средств в России» (Москва, 2003, 2004 и 2005), на III конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2 004), на научно-практической конференции, посвященной 85-летию АГМА (Астрахань, 2003) .
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные результаты, обсуждение собственных результатов, выводы, список литературы. Материалы диссертации изложены на 183 страницах машинописного текста, включают 15 таблиц, 18 диаграмм. Список литературы состоит из 320 работ, из них 207 отечественных и 113 зарубежных авторов.
Классификация и биологические эффекты современных иммунотропных средств
Возможность регуляции иммунологической реактивности фармакологическими средствами, влияющими на иммуноком-петентные клетки и их взаимодействие, делает актуальным создание веществ, позволяющих воздействовать на отдельные звенья иммуногенеза. В прикладном аспекте это означает, что необходимо разрабатывать лекарственные средства, пригодные для иммунокоррекции организма, . то есть для профилактики и лечения многочисленных заболеваний, при которых нарушения иммунного статуса являются либо причиной патологии, либо очень существенным звеном патогенеза (Алехин Е.К., 1994; Утешев B.C. и соавт., 1995) . Кроме того, в настоящее время стало очевидным, что очень многие лекарственные вещества, относящиеся к различным химическим и фармакологическим группам, в терапевтических дозах оказывают влияние на иммунную систему, то есть иммунотропность является широко распространенным явлением. И, наконец, очень многие факторы окружающей среды (климатические, сезонные и др.), пищевые факторы, различные стрессорные, профессиональные воздействия, возрастные изменения часто приводят к неблагоприятным влияниям на иммунную систему (Черешнев В.А. и соавт., 2001; Хаитов P.M.и соавт., 1995) . Таким образом, современное состояние проблемы диктует поиск и разработку новых универсальных иммунотроп-ных средств не только для лечения больных с уже возникшей патологией иммунной системы, но и для повышения функциональных возможностей организма в различных неблагоприятных условиях, способных привести к срыву адаптации. По современным представлениям, иммуномодуляторами являются вещества химической или биологической природы, обладающие иммунотропнои активностью, которые способны в терапевтических дозах восстанавливать функции иммунной системы в результате воздействия на иммунокомпе-тентные клетки, на процессы, их миграции или на взаимодействие (Богданов Ю.В. и соавт., 2003; Хаитов P.M., 2000) . В соответствии с результатом действия на иммунную систему иммуномодуляторы могут оказывать как иммуностимулирующее, так и иммунодепрессивное действие, что зависит от использования различных доз и/или схем их применения. На ряде примеров показано, что отдельные иммуномоду-лирующие препараты характеризуются нормализующим действием на иммунную систему и- проявляют способность, исправлять ее конкретные нарушения — повышать сниженные показатели и подавлять повышенные.
Такие препараты могут быть отнесены к категории иммунокорректоров. Считают, что иммунокорректоры — это иммуномодуляторы. "точечного" действия (Манько В.М. и соавт., 2002; Петров Р.В. и соавт. , 2000) . Согласно классификации, предложенной J.W. Hadden (1993) и дополненной отечественными иммунологами (Хаитов P.M., 2000), все иммуностимуляторы и иммунокор-ректоры разделены на б основных групп: I. Препараты микробного происхождения: 1. Препараты микробного происхождения 1-го поколения: микробные липополисахариды (пирогенал, продигиозан), дрожжевые гидролизаты (натрия нуклеинат). 2. Препараты микробного происхождения 2-го поколения: высокоочищенные бактериальные лизаты (ИЕС-19, бронхому-нал) . 3. Комбинированные иммуномодуляторы, содержащие рибосомы бактерий (вакцинальный эффект) и мембранные фракции бактерий (неспецифическая, иммуномодуляция)(рибомунил) 4. Синтетические аналоги мембранных фракций бактерий (ликопид) II. Препараты тимического происхождения: 1. Препараты тимуса: тималин, Т-активин, тимоптин, ти- мактид, тимостимулин, вилозен. 2. Синтетические аналоги тимических факторов: тимоген, иммунофан. III. Препараты костного мозга: миелопид. IV. Цитокины и их синтетические аналоги: рекомби- нантные ИЛ-2 (ронколейкин) и ИЛ-1 (беталейкин) ; ос- интерфероны (интерферон человеческий, локферон, рофе- рон, реаферон, виферон, интрон А, реальдирон, вэллфе- рон); р-интерферон (ребиф, фрон) и др. V. Синтетические индукторы интерферона: циклоферон, амиксин, ридостин, мегосин, полудан и др. VI. Синтетические иммуностимуляторы разных химических групп: леакадин, левамизол, полиоксидоний, дибазол, диуцифон, метилурацил, пентоксил и др. В настоящее время все иммуностимуляторы микробного происхождения делятся на основные группы: очищенные бактериальные лизаты, иммуностимулирующие, мембранные фракции, бактериальные рибосомы в комбинации с мембранными фракциями. Механизм действия препаратов микробного происхождения, содержащих липополисахариды грамотрицательных бактерий (пирогенал, продигиозан) и мембранные фракции (ликопид) связан с активирующим влиянием на функциональный статус макрофагов. Эти препараты стимулируют фагоцитоз и через него могут влиять на иммунокомпетент-ные клетки (Андронова Т.М. и соавт., 2002; Пинегин Б.В. и соавт., 1994). Бактериальные лизаты (ИРС-19, бронхомунал) инициируют специфический иммунный ответ на бактериальные антигены, присутствующие в препарате. При иммунотерапии этими средствами происходит увеличение содержания специфических антител к микробам, входящим в состав препарата (Лопатин А.С, 2000; Маркова Т.П. и соавт., 1999) . ИРС-19 состоит из 19 штаммов наиболее частых бактериальных возбудителей инфекций дыхательных путей (Богомильский М.Р. и соавт., 2000).
Препарат усиливает как специфический, так и неспецифический иммунитет, вызывая непосредственную стимуляцию местного специфического иммунитета, повышая фагоцитарную активность макрофагов и лизоцима (Белоусов Ю.Б. и соавт., 2002). ИРС-19 также способствует повышению секреторных иммуноглобулинов. Доказано и десенсибилизирующее действие ИРС-19 (Моска- лец О.В., Сучков СВ., 2002). Бронхомунал, содержащий также бактериальные лизаты наиболее частых возбудителей респираторных заболеваний, повышает гуморальный и клеточный иммунитет. Оказывая воздействие на пейеровы бляшки в слизистой кишечника, стимулирует перитонеальные макрофаги. В сыворотке крови повышается количество Т-лимфоцитов, IgA, IgG, IgM. Увеличивается количество антител в дыхательных путях (Мос-калец О.В., 2002; Новиков Ю.К., 1998). Селективные неантигенные мембранные фракции бактерий стимулируют неспецифические факторы иммунной защиты организма,, не влияя на выработку специфических антител. Они оказывают стимулирующее действие на макрофаги, на выработку ИЛ-1. Неантигенные мембранные фракции бактерий приводят к мобилизации 3 уровней защиты: фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета (опосредованно) . Следует отметить, что продолжительность иммуностимулирующего эффекта после отмены этих препаратов ограничена. Представителем препаратов селективных мембранных фракций является ликопид. Действующее начало этого препарата представляет собой универсальный компонент клеточной стенки бактерии Lactobacillus bulgaricus и является естественным стимулятором иммунной системы человека, особенно, моноцитарно-макрофагального звена (Андро- нова Т.М..И соавт., 2002; Пинегин Б. В. и соавт., 1994; Пынзарь М.А. и соавт., 1998). Комбинированный препарат рибомунил, сочетающий в себе антигенные носители бактерий (рибосомы) (специфи ческая иммуностимуляция) и активные неантигенные ком поненты бактериальной оболочки (протеогликаны) (неспецифическая иммунокоррекция) , вызывает вакцинальный и иммуномодулирующий эффекты (Маркова Т.П. и соавт., 2001). Применение рибомунила приводит к активной выработке секреторного IgA, специфических антиклебсиеллезных, антистрептококковых антител и созданию поствакцинального иммунитета (Гаращенко Т.И., и соавЗг. резуйШ ате попытки выделения активных начал из центральных органов иммунитета тимуса и костного мозга был создан препарат Т-активин, который дал начало мно гим другим препаратам.
Влияние производных бензимидазола на продукцию антител в реакции гемагглютинации
Исследование проведено на 150 мышах линии СВА. Эксперимент состоял из двух серий. В 1-ой серии изучали влияние на процесс антителообразования в реакции гемагглютинации производных бензимидазола РУ-13, РУ-3 6, РУ-284, РУ-185, РУ-354, РУ-355, во 11-ой - РУ-64, РУ-85, РУ-254, РУ-353, РУ-670. Исследуемые вещества в опытных группах вводили внутри брюшинн о в день иммунизации в дозе 50 мг/кг в 0,5 мл дистиллированной воды. В контрольных группах иммунизированные мыши в качестве плацебо получали по 0,5 мл дистиллированной воды (контроль I) и дибазол в той же дозе, что и исследуемые соединения (контроль II) При постановке РПГА мышей иммунизировали подкожно субоптимальной дозой ЭБ (2х107) в 0,2 мл дистиллированной воды. Исследование крови проводили на пике иммунного ответа - на 7-й день после антигенной стимуляции. Результаты, полученные в ходе исследований, приведены в таблице 6. Как видно из таблицы, наиболее сильное влияние на продукцию антител к ЭБ оказывали производные бензимидазола РУ-185, РУ-284, РУ-354, РУ-355 (р 0,001). Титр антител в сыворотке крови мышей при введении этих соеди- нений возрастал в 1,7-1,9 раз по сравнению с группой животных, получавших дистиллированную воду (р 0,001) . Эти изменения были практически сопоставимы с воздействие на выработку антител к ЭБ дибазола. Соединение РУ-Зб также статистически достоверно, но в меньшей степени стимулировало продукцию антиэритроци-тарных антител, при этом титр AT был близок к показателям, наблюдаемым при использовании дибазола. Значительно стимулировали, в сравнении с контролем I, выработку антител химические соединения, известные под шифрами РУ-64, РУ-85, РУ-254 и РУ-670. У мышей, получавших эти вещества, показатели титра AT превышали контрольные в 1,5-2,2 раза. Однако влияние их уступало воздействию дибазола. Здесь следует отметить, что выявленная разница между группами, получавшими исследуемые вещества и дибазол, за исключением РУ-670, не являлась статистически достоверной. Соединение РУ-13 практически не оказывало воздействия на процесс антителообразования. РУ-353 по влиянию также не отличался от контроля I. 5.3 Влияние производных бензимидазола на формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа Эксперимент проведен на 130 мышах линии СВА.
В данном разделе работы изучали влияние производных бензимидазола, известных под шифрами РУ-13, РУ-Зб, РУ-284, РУ- 185, РУ-354, РУ-355, РУ-64, РУ-85, РУ-254, РУ-353, РУ- 0 на формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа. Исследуемые вещества вводили внутри-брюшинно в день иммунизации в дозе 50 мг/кг в 0,5 мл дистиллированной воды (Хаитов P.M. и соавт., 2000). Контролем I служили иммунизированные мыши, получавшие вместо препаратов 0,5 мл дистиллированной воды. В качестве контроля II использовали животных, которым вводили дибазол в той же дозе, что и исследуемые вещества. Для иммунизации применяли оптимальную дозу ЭБ (2х108) в 0,2 мл, разрешающую дозу - 108 ЭБ в 0,05 мл физиологического раствора. Результаты, полученные в ходе, эксперимента, показали, что подавляющее большинство изучаемых "соединений оказывают влияние на величину индекса реакции ГЗТ (табл.7). К веществам сильного действия следует отнести РУ-13, РУ-185, РУ-254, РУ-355. При их введении индекс реакции ГЗТ мышей возрастал, по сравнению с контролем І, в 3-4 раза. Степень их влияния была либо сопоставима, либо выше эффекта дибазола. К несколько меньшему, но также статистически достоверно повышению ИР гиперчувствительности замедленного типа приводило введение животным соединений РУ-284, РУ-64, РУ-85 и РУ-670. В этих группах у мышей индекс реакции ГЗТ увеличивался в 2-2,5 раза. Эффективность действия этих соединений была сопоставима с действием дибазола (за исключением РУ-85). При изучении иммунотропной активности производных трициклических бензимидазольных систем с общим атомом азота: Ni-и Ng-замещенных имидазо(1,2-а)бензимидазола (ИМБИ), а также Ыю-замещенных пиримидо(1,2 - а)бензимидазола (ПМБИ) получили следующие результаты. Наиболее выраженные иммуномодулирующие свойства в отношении клеточного звена первичного, иммунного ответа выявлены у Ng-замещенных 2,3-дигидроИМБИ (РУ-254) и Nx-замещенных ИМБИ с морфолиноэтильным заместителем в положении ,1 (РУ-355). Изменение положения морфолиноэтиль-ного заместителя с 1 на 9 (РУ-28 4) приводит к некоторому уменьшению влияния на Т-клеточное звено иммуногенеза. В ряду Ng-замещенных ИМБИ, имеющих в положении 9 диэтиламиноэтильный заместитель наибольшую иммунотроп-ную активность в реакции гиперчувствительности замедленного типа проявляют соединения, имеющие в положении 2 фенильный и 3,4-гидроксифенильный заместители (РУ-13, РУ-64 и РУ-185) . Замена радикала в положении 2 на 4-гидроксифенильный (РУ-85) приводит к некоторому снижению клеточной инфильтрации ткани лап лабораторных животных. Соединение с терт-бутильным радикалом в положении 2 (РУ-36) влияния на индекс реакции ГЗТ не оказывало . Вещество из группы Nx-замещенных ИМБИ, имеющих в положении 1 диэтиламиноэтильный заместитель (РУ-353) стимулирует клеточноопосредованную иммунную реакцию аналогично соединениям с диэтиламиноэтильной группой, имеющим 4-гидроксифенильный радикал в положении 2. Химическое соединение из группы Nxo-замещенных 2,3,4-тригидроПМБИ (РУ-670) проявляет иммуномодулирую- щие свойства, стимулируя пролиферацию Т-лимфоцитов, но показатели ИР ГЗТ при применении этого соединения ниже, нежели у веществ Ng-замещенных ИМБИ с диэтиламиноэтиль- ным заместителем. 2-фенил-Ы1-пиперидиноэтил-ИМБИ (РУ-354) не проявляет модулирующего влияния на ,клеточное звено иммунного ответа..." В отношении гуморального звена первичного иммунного ответа наиболее активными оказались химические соединения из группы морфолиноэтилзамещенных Ng-ИМБИ (РУ-284), их применение приводит к значительному увеличению как антителопродуцентов, так и количества антител в сыворотке крови.
В ряду Ng-замещенных ИМБИ, имеющих в положении 9 диэтиламиноэтильный заместитель наиболее выражено стимулируют процессы пролиферации и дифференцировки анти-телообразующих клеток в селезенке и образование антител вещества с фенильным и 3,4-гидроксифенильным радикалом в положении 2 (РУ-185). Замена радикала в положении 2 на терт-бутильный (РУ-Зб) и 4-гидроксифенильный (РУ-85) приводит к снижению активности. Значительная иммуностимулирующая активность в отношении гуморального звена иммунного ответа (кол-во АОК и титр антител) отмечается у пиперидиноэтил- и морфолино-этил- Ni-ИМБИ, имеющих в положении 2 фенильный радикал (РУ-354 и РУ-355) . 2-фенил-Ы9-диэтиламиноэтил-ИМБИ, имеющий в положении 2 фенильный радикал оказывает неоднозначное воздействие на гуморальное звено: дигидрохлорид (РУ-13) этого соединения значительно стимулирует образование анти-телообразущих клеток, практически не влияя на титр антител, тогда как динитрат (РУ-64) подобной активностью не обладает. Химическое соединение из группы Nio-замещенных 2,3,4-тригидроПМБИ (РУ-670) проявляет иммуномодулирую-щие свойства, стимулируя пролиферацию антителопродуцен-тов и образование антител в сыворотке крови. Дигидрохлорид 2,3-дигидро-ИМБИ с диэтиламиноэтиль-ным радикалом в положении 9 (РУ-254) имеет средние по величине показатели гуморального иммунного ответа. Вещество из группы Ni-замещенных ИМБИ, имеющих в положении 1 дизтиламиноэтильный заместитель (РУ-353) практически не вызывает изменений в развитии реакций-гемагглютинации и локального гемолиза. Таким образом, наиболее выраженную иммунотропную активность проявляют химические соединения из групп Ni и Ng-замещенных производных ИМБИ, имеющих диэтиламино-этильный, морфолинозтильный и пиперидиноэтильный радикалы. Наличие фенильного и 3,4-гидроксифенильного заместителей в положении 2 у атома С гетероцикла существенно повышает выраженность данного вида фармакологической активности.
Влияние производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 на показатели периферической крови и лимфоидных органов
Эксперимент поставлен на 60 мышах линии СВА, синхронизированных по возрасту и условиям содержания. Исследуемые соединения вводили в течение 5 дней внутрибрюшинно в дозах: РУ-185 - 11,3 мг/кг; РУ-254 -13,75 мг/кг; РУ-284 - 9,75 мг/кг и РУ-355 - 6,75 мг/кг, что соответствует 1/20 LD5o для каждого соединения. Контролем I служили животные, получавшие вместо изучаемых соединений 0,5 мл дистиллированной воды. Группой сравнения служили также животные, получавшие дибазол в дозе 10 мг/кг (контроль II). Забой животных и забор материала проводили через сутки после последнего введения изучаемых веществ. Результаты по изучению влияния производных бензими- дазола на массу и клеточность тимуса, отражены в таблице 9. Применение производного бензимидазола РУ-2 8 4 способствовало более, чем двукратному увеличению массы тимуса и количества тимоцитов (р 0,01). Использование химических соединений РУ-185 и РУ-355 привело также к ярко выраженной стимуляции пролифера-тивных процессов, что повлекло возрастание массы и количества клеток изучаемого органа (р 0,001 и р 0,01), но по абсолютным показателям эти изменения были несколько менее выражены, чем при введении РУ-284. Курсовое применение РУ-254 вызвало незначительное увеличение массы тимуса и его клеточного состава, эти изменения были статистически не достоверны (р 0,05). В сравнении с дибазолом РУ-185, РУ-284 и РУ-355 были менее эффективны. РУ-254 статистически значимо уступал дибазолу (табл. 9) . Результаты изучения влияния производных бензимидазо-ла на массу и клеточность селезенки, отражены в таблице 10. Все исследуемые производные бензимидазола в разной степени стимулировали пролиферативные процессы в селезенке. Так, соединение РУ-284 способствовало значительному по абсолютным показателям увеличению массы селезенки и количества в ней ядросодержащих клеток. Количество клеток белой пульпы возросло в 2 раза, а масса - в 1,8 раза (табл.10). Использование веществ РУ-185 и РУ-355 привело также к выраженным изменениям изучаемых показателей с высокой степенью достоверности (р 0,001). Менее выраженное, но также статистически значимое нарастание массы селезенки и количества ЯСК наблюдалось при введении мышам химического соединения РУ-254 (р 0,05) . Сравнение с дибазолом показало, что химические соединения РУ-185, РУ-284 и РУ-355 идентичны дибазолу по степени влияния. РУ-254 менее эффективен, нежели известный иммуномодулятор.
Таким образом, все изучаемые вещества оказывали стимулирующее влияние на массу и клеточность таких лимфо-идных органов, как тимус и селезенка. 7.2 Влияние производных бензимидазола на показатели белой крови мышей Эксперимент поставлен на 60 мышах линии СВА, также синхронизированных по возрасту и условиям содержания. Исследуемые соединения вводили в течение 5 дней внутрибрюшинно в дозах: РУ-185 - 11,3 мг/кг; РУ-254 -13,75 мг/кг; РУ-284 - 9,75 мг/кг и РУ-355 - 6,75 мг/кг, что соответствует 1/20 LD5o для каждого соединения. Контролем I служили животные, получавшие вместо изучаемых соединений 0,5 мл дистиллированной воды. Группой сравнения служили также животные, получавшие дибазол в дозе 10 мг/кг.(контроль II). Забой животных и забор ма- териала проводили через сутки после последнего введения изучаемых веществ. Анализ.результатов, полученных в ходе эксперимента, показал, что изучаемые соединения вызывают изменения показателей белой крови мышей (табл.11). У животных всех опытных групп введение производных і бензимидазола стимулировало пролиферативные процессы, приводящие к. увеличению количества лейкоцитов. У мышей, получавших химические соединения под шифрами РУ-185, РУ-284 и РУ-355, количество лейкоцитов статистически значимо возрастает в 1,4-1,6 раза. Введение РУ-254 менее эффективно: число лейкоцитов увеличивается, но эти изменения не достоверны. Введение дибазола статистически достоверно способствует увеличению числа лейкоцитов, сопоставим по эффекту с РУ-185, РУ-284 и РУ-355 и значительно превышает таковой при применении РУ-25 4. Результаты, отражающие изменения лейкоцитарной формулы под влиянием новых производных бензимидазола, представлены на рисунках 9 и 10. Статистически значимо у мышей всех опытных групп, в сравнении с контролем, возрастает количество неитрофилов. Введение соединений под шифрами РУ-185 и РУ-355 способствует увеличению неитрофилов практически в 2 раза. Менее выраженные, но также статистически достоверные изменения наблюдаются под влиянием РУ-25 4 и РУ-2 84. Колебание относительного числа лимфоцитов имеет обратную зависимость. Более ярко эти изменения проявляются при введении производных бензимидазола РУ-185, РУ-284 и РУ-355. Менее выражены - при использовании РУ-254. У мышей, получавших вещества РУ-185, РУ-284, РУ-355, в среднем, вдвое возрастает процентное содержание моноцитов. При введении РУ-254 изменение содержания моноцитов менее значимо и не является статистически достоверным. При подсчете абсолютного числа клеток оказалось, что количество всех видов лейкоцитов статистически значимо превышало показатели контроля (табл.12). Влияние диба зола на процесс дифференцировки идентично его воздейст вию на процессы пролиферации и сопоставимо с РУ-185, РУ-28 4.
В данном разделе работы представлены результаты, полученные при исследовании влияния новых конденсированных производных бензимидазола, под лабораторными шифрами РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови. Эксперимент поставлен на 60 мышах линии СВА в возрасте 3-4 месяцев, массой 18-20 грамм, содержавшихся в стандартных условиях. Для исследования функционального состояния нейтрофилов периферической крови мышей, все вещества вводили внутрибрюшинно в течение 5 дней в дозе, составляющей 1/20 от LD5o в 0,5 мл дистилированной воды: РУ-185 -11,3 мг/кг; РУ-254 - 13,75 мг/кг; РУ-284. - 9,75 мг/кг; РУ-355 - 6,75 мг/кг. Контролем I служили животные, получавшие вместо изучаемых соединений 0,5 мл дистиллированной воды. Группой сравнения служили также животные, получавшие дибазол в дозе 10 мг/кг (контроль II) . Забор крови проводили через сутки после последнего введения изучаемых веществ. Результаты изучения влияния производных бензимидазола на неспецифическое звено иммунного ответа представлены в таблице 13. Как показал анализ полученных данных, исследуемые производные бензимидазола оказывают влияние на показатели неспецифического звена иммунного ответа. Производные бензимидазола РУ-18 5 и РУ-2 8 4 проявляют сходное воздействие. При их введении у мышей возрастает как абсолютное число фагоцитирующих неитрофилов, так и % фагоцитоза. Следует отметить, что количество активных неитрофилов увеличивается более, чем в 3 раза, тогда как фагоцитарный индекс лишь на 17-20 %. Использование этих соединений также приводит к возрастанию и числа фагоцитируемых частиц латекса (в 1,7 раза). Все перечисленные изменения статистически достоверны (табл. 13) . Применение РУ-355 и РУ-254 также вызывает изменение абсолютного количества активных неитрофилов и процент фагоцитоза, но практически не оказывает влияния на фагоцитарное число (табл. 13). Дибазол активно стимулирует процесс фагоцитоза по всем изучаемым нами показателям:.сравним по воздействию с РУ-185 и РУ-284, и несколько превышает по эффективности РУ-254 и РУ-355. Таким образом, наиболее яркую картину стимулирующего действия на фагоцитарную активность неитрофилов дает использование соединений РУ-185 и РУ-284.
Изучение иммунокорригирующеи активности производных бензимидазола РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 при экспериментально вызванной иммуносупрессии
В связи с ростом различных форм иммунной недостаточ ности, связанной с действием экзогенных и эндогенных факторов, большой,-интерес представляют сведения о воз можных иммунокорригирующих свойствах новых производных бензимидазола в условиях экспериментально вызванной им- муносупрессии. . Исследования, проведены на 1400 мышах линии СВА 3-4 месячного возраста, содержащихся в стандартных условиях. Изучаемые соединения РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355. вводили животным внутрибрюшинно в течение семи дней, начиная за три дня до иммунизации, в дозах, соответствующих 1/20 от LD50. Для сравнения выбрали группу животных, получавших дибазол в дозе 10 мг/кг. Подавление иммуногенеза вызывали применением циклофосфана в дозе 100 мг/кг в день иммунизации. Контролем I служили иммунизированные мыши, получавшие только циклофосфан в указанной выше дозе. В качестве контроля II - иммунизированные животные, получавшие вместо препаратов 0,5 мл дистиллированной воды. В данном эксперименте проведены две серии опытов. В первой серии изучали возможность коррекции производными бензимидазола «циклофосфановои» депрессии клеточного звена иммунного ответа на ЭБ в РГЗТ; во второй - гуморального звена иммуногенеза в РПГА. При изучении влияния веществ на индекс РГЗТ для иммунизации использовали оптимальную дозу ЭБ - 2х108 в 0,2 мл, разрешающую дозу - 108 ЭБ в 0,05 мл физиологического раствора. Антигенную стимуляцию при постановке РПГА проводили подкожным введением субоптимальной дозы ЭБ 2x10 в 0,2 мл дистиллированной воды. Результаты исследования иммунокорригирующей активности производных бензимидазола представлены в таблицах 14 и 15. Как видно из табл. 14, применение алкилирующего соединения из группы хлорэтиламинов - циклофосфана - в дозе 100 мг/кг в день антигенной стимуляции привело к значительному нарушению формирования РГЗТ, что проявилось в снижении индекса реакции, по сравнению с контролем II, практически в 3 раза (р 0,01). Кроме того, цик-лофосфан также вызывал угнетение и антителогенеза (р 0,001) (табл.15) . Курсовое введение химических соединений, известных под лабораторными шифрами РУ-185, РУ-254, РУ-284, РУ-355 (в дозах 11,3 мг/кг, 13,75 мг/кг, 9,75 мг/кг и 6,75 мг/кг соответственно) привело к выраженной стимуляции реакции гиперчувствительности замедленного типа (по сравнению с контролем I и II).
При этом, вещества РУ-185 и РУ-284 вызвали увеличение реакции местной сенсибилизации, по сравнению с контролем II, более чем в 2,5 раза (р 0,01), и более чем в 6,5 раз по сравнению с группой животных, получавших только циклофосфан (р 0,001). Производное бензимидазола РУ-355 при введении на фоне экспериментальной иммуносупрессии также привело к значительной стимуляции клеточной инфильтрации. Индекс реакции ГЗТ увеличился почти в 3 раза, если сравнивать с группой мышей, не получавших препараты (р 0,001) и более чем в 7 раз по сравнению с экспериментальной моделью иммунодепрессии (р 0,001) . В условиях лекарственной иммунодепрессии химическое соединение РУ-254 также стимулировало клеточное звено иммуногенеза: иммунный ответ не только достигал уровня контроля II, но и превышал его в 2 раза (р 0,001). О влиянии исследуемых производных бензимидазола на функционирование гуморального звена иммунного ответа у мышей с индуцированной иммунодепрессиеи судили по их способности к формированию в крови антиэритроцитарных антител (табл.15). Установлено,- что всем исследуемым веществам присущ иммунокорригирующий эффект. Максимальное воздействие наблюдалось при использовании РУ-185 и РУ-284, когда уровень титра антител повысился более, чем в 3 раза по сравнению с мышами, получавшими циклофосфан (р 0,001), что свидетельствовало не только о корригирующем, но и о активирующем влиянии на процесс антителообразования. Аналогичная направленность наблюдалась в действии и другого исследуемого вещества, известного под лабора- торным шифром РУ-254: количество антизритроцитарных антител при использовании этого соединения достоверно увеличилось по сравнению с контролем II в 1,4 раза (р 0,05), а по сравнению с экспериментальной моделью иммунодепрессии в 2,3 раза (р 0,001). Иммунотропная активность производного бензимидазола РУ-355 несколько отличалась по характеру действия от выше описанных веществ. На фоне циклофосфановой иммуно-супрессии соединение РУ-355 достоверно значимо увеличивало в крови количество антител к ЭБ (в 2 раза, при р 0,001). Но, в отличие от соединений РУ-284 и РУ-254, выраженного стимулирующего действия на процесс антите-лообразования не оказывало: титр антител, при этом, увеличился всего на 0,09 (р 0,1) (табл. 15) . Иммунокорригирующая способность РУ-185, РУ-2 84 и РУ-355 по указанным показателям сопоставима с активностью дибазола. Соединение РУ-254 проявляет менее выраженные свойства, но статистически достоверными эти отличия не являются. Таким образом, изучаемые нами производные бензимидазола под шифрами РУ-185, РУ-254, РУ-284 и РУ-355 проявляют выраженные иммунокорригирующие свойства. Они не только статистически достоверно восстанавливают показатели РПГА и РГЗТ у мышей, получавших циклофосфан, но и одновременно оказывают выраженный стимулирующий эффект. Обсуждение результатов исследования Проблема поддержания гомеостаза организма в современных условиях (ухудшающаяся экологическая обстановка, рост первичных и вторичных иммунодефицитов, неблагоприятные социальные факторы) требует разносторонних подходов, в том числе, коррекции работы различных физиологических систем через иммунное звено. В связи с этим возрастает необходимость разработки и внедрения в практику более совершенных эффективных иммунотропных средств.
Практическое применение средств, влияющих на функции иммунной системы, должно предваряться детальным изучением их действия в эксперименте, включающего моделирование иммунологического процесса, изучение влияния веществ на различные звенья иммунитета, отбор наиболее эффективных соединений (Утешев Б. С, Арзамасцев Е.В., 1996). Одним из основных условий формирования иммунного ответа служат постоянно протекающие процессы, в результате которых осуществляется пролиферация предшественников иммунокомпетентных клеток и их дифференцировка в зрелые антителопродуценты. Важно подчеркнуть, что, как известно, интенсивность иммунного ответа зависит, с одной стороны, от качественных и количественных характеристик антигенного раздражителя, а с другой - от особенностей состояния популяций иммунокомпетентных клеток в определенные периоды иммуногенеза, на что могут в значительной мере влиять самые различные иммуномодулирующие факторы. В определенных условиях могут формироваться состояния, когда популяция антителопродуцентов может значительно варьировать как в сторону активации иммуногенеза, так и его угнетения (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000). Производные имидазо(1,2-а)бензимидазола являются новым классом биологически активных веществ, обладающих широким спектром действия. В связи с этим, представляется перспективным изучение влияния соединений этой группы на функциональное состояние иммунной системы. Первый этап нашего исследования включал изучение, им-мунотропной активности одиннадцати новых конденсированных производных имидазо(Г,2-а)бензимидазола на гуморальное и клеточное звено первичного иммунного ответа мышей на эритроциты барана. Следует отметить, что все методы, применяемые в данной работе, были выбраны согласно методическим рекомендациям по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ (Хаитов Р.. М-..,, Гущин И.С, 2000) . Влияние указанных соединений на гуморальное звено иммунного ответа изучалось.. в реакции прямой гемагглюти-нации и методом локального гемолиза по Jerne-Nordin; клеточное звено - в реакции гиперчувствительности замедленного, типа.
