Содержание к диссертации
Введение
1. Фармакология некрахмальных полисахаридов 8
1.1. Химическая структура и физико-химические свойства полисахаридов 10
1.2. Некрахмальные полисахариды и сердечно-сосудистые заболевания 22
1.3. Некрахмальные полисахариды и заболевания желудочно-кишечного тракта 24
1.4. Антибактериальные, противовирусные и иммуномодулирующие свойст ва некрахмальных полисахаридов 29
1.5. Связывание тяжелых металлов и радионуклидов некрахмальными полисахаридами 31
2. Материалы и методы 35
2.1. Общая характеристика экспериментальных животных 35
2.2. Общая характеристика препаратов 35
2.3. Методы оценки антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов 38
2.4. Биохимические методы 41
2.5. Статистическая обработка результатов 45
3. Оценка антиоксидантной активности некрах мальных полисахаридов в условиях in vivo на экспери ментальных животных с окислительным стрессом 46
3.1. Оценка лечебного действия некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса 48
3.2. Оценка профилактического действия некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса 61
3.3. Оценка лечебно-профилактического действия некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса 67
4. Оценка антиоксидантного действия некрах мальных полисахаридов на модели Fe2+-ackopeat- индуцированного перекисного окисления липидов мембран гепатоцитов 70
4.1. Оценка антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов на модели Ре2+-аскорбатиндуцированного перекисного окисления липидов в мембранах гепатоцитов крыс 71
4.2. Оценка антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов на модели Ре2+-аскорбатиндуцированного перекисного окисления липидов в мембранах гепатоцитов крыс с окислительным стрессом 74
5. Оценка антиоксидантной активности некрах мальных полисахаридов методами in vitro 77
5.1. Оценка антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов модифицированным методом FRAP 78
5.2. Оценка антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов по ингибированию Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до мало нового диальдегида in vitro 91
Обсуждение 98
Выводы 110
- Некрахмальные полисахариды и сердечно-сосудистые заболевания
- Методы оценки антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов
- Оценка профилактического действия некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса
- Оценка антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов по ингибированию Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до мало нового диальдегида in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблемы лекарственной регуляции окислительного стресса и поиск фармакологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, по-прежнему остаются в центре внимания исследователей по различным направлениям экспериментальной и клинической фармакологии (Кения и др., 1993; Lewis et al., 2000; Kanner et al., 2001; Halvorsen et al., 2002; Matthaus, 2002; Ladas et al, 2004). В физиологических условиях окислительно-восстановительные процессы, обеспечивающие энергетические потребности клеток и утилизацию кислорода в тканях, контролируются регуляторними системами, поддерживающими сбалансированное взаимодействие реакций образования продуктов оксидации и антиокислительных факторов. Нарушение этого взаимодействия, которое сопровождается активацией свободно-радикальных процессов и накоплением продуктов перекисного окисления липидов, рассматривается в качестве универсального механизма повреждения биологических мембран (Gorman et al., 1999; Halliwell, 2001; Vertuani et al., 2004), лежащего в основе таких патофизиологических процессов, как воспаление, атерогенез и канцерогенез (Bounous, Molson, 2003), и является важным звеном в патогенезе атеросклероза (Heinecke, 1998; Азизова, 2000; Kaul et al., 2001), инфаркта миокарда (Klipstein-Grobusch et al., 1999), злокачественных опухолей (Kumaraguruparan et al., 2002; Saintot et al., 2002), перитонита (Konukoglu et al., 1999), хронического гломерулонефрита (Тугушева и др., 1994), острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами (Shaikh et ah, 1999; Gaetke, Chow, 2003).
Установление роли окислительного стресса в развитии многих заболеваний свидетельствует о том, что эндогенная антиоксидантная система не обеспечивает в достаточной степени защиту клеток и тканей от повреждающего действия свободных радикалов. Поэтому вполне оправдан поиск новых подходов и средств подавления прооксидантных процессов и активации ре-
5 акций антиоксидации (Fang et al., 2002; Schlesier et al., 2002; Violi et al., 2004).
Среди природных соединений, обладающих фармакологической активностью, обращают на себя внимание некрахмальные полисахариды, такие как соли альгиновой кислоты, пектины, фукоиданы, хитозан и каррагинаны. В той или иной степени они оказывают гипохолестеринемический (Miura et al., 1995; Knopp et al., 1999; Ylitalo et al., 2002), противоязвенный (Shibata et al., 1999; Ito et al., 2000; Yamamoto et al., 2000), антикоагулянтный (Huang et al., 2003; Mourao, 2004), энтеросорбционный (Соболев и др., 1999; Савченко, Хотимченко, 2002), иммуномодулирующий (Назарова и др., 1998; Pratt-Pearce, Phillips, 1996) и противовирусный (Ponce et al., 2003) эффекты. Некоторые из этих эффектов сопровождаются снижением уровня продуктов пере-кисного окисления липидов в крови экспериментальных животных (Хотимченко и др., 1997; Иванова, Янькова, 1998; Шевцова, 1999; Хотимченко и др., 20006; Шевцова, 2000). Кроме того, показано, что экстракты из ряда бурых и красных водорослей, содержащие соединения полисахаридной природы, проявляют антиоксидантные свойства (Xue et al., 2001; Ruperez et al., 2002; Zhang et al., 2003). Эти данные наводят на мысль, что некрахмальные полисахариды могут обладать антиоксидантными свойствами. Проверке этого предположения и анализу возможных механизмов антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов посвящена настоящая работа.
Цель работы.
Цель работы состояла в сравнительной оценке и изучении механизмов антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов растительного и животного происхождения.
Задачи работы:
1. Экспериментально изучить эффекты альгинатов кальция и натрия, низкоэтерифицированного и высокоэтерифицированного пектинов, фукоида-на, хитозана и каррагинанов на модели окислительного стресса, вызванного индукторами перекисного окисления липидов у лабораторных животных.
Исследовать профилактические эффекты некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса у лабораторных животных.
Исследовать антиоксидантное действие некрахмальных полисахаридов на модели Fe +-аскорбатиндуцированного перекисного окисления липи-дов в мембранах гепатоцитов здоровых животных и животных с экспериментальным окислительным стрессом.
В условиях in vitro изучить антиоксидантные эффекты некрахмаль-ных полисахаридов по восстановлению трехвалентного железа (метод FRAP).
В условиях in vitro изучить антиоксидантные эффекты некрахмаль-ных полисахаридов по ингибированию Fe -аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида.
Провести сравнительную оценку антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов и лекарственных препаратов-антиоксидантов -милдроната и эмоксипина.
Научная новизна. Впервые проведены сравнительные исследования антиоксидантных свойств некрахмальных полисахаридов, таких как натриевая и кальциевая соли альгиновой кислоты, пектины с разной степенью эте-рификации, каррагинаны, фукоидан и хитозан. Установлено, что исследованные полисахариды, за исключением высокоэтерифицированного пектина и каррагинанов, на различных моделях окислительного стресса у экспериментальных животных снижают интенсивность перекисного окисления липидов и способствуют нормализации показателей эндогенной антиоксидантной системы. На модельных системах in vitro, позволяющих судить о механизмах антиоксидантного действия тестируемых веществ, показано, что полисахариды обладают восстанавливающей активностью и ингибируют Fe -аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида. Впервые показано, что антиоксидантных эффект полисахаридов зависит от их структуры и физико-химических свойств.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные об антиоксидантных свойствах исследуемых веществ послужат базой для дальнейших исследований фармакологической активности некрахмальных полисахаридов. Эти сведения расширяют теоретические представления о закономерных связях структуры и физико-химических свойств органических соединений с фармакологической активностью. Они дополняют представления о фармакологической регуляции оксидативных процессов при патологических состояниях. Полученные данные могут стать основой для разработки новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для применения в качестве антиоксидантных средств.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на итоговой конференции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2002, 2003), на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), на 2-ом съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004).
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Семинара по морфологии, физиологии и биохимии Института биологии моря ДВО РАН. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 138 страницах машинописного текста и состоит их введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 28 рисунков и 19 таблиц. Библиография состоит из 49 отечественных и 213 зарубежных источников.
Некрахмальные полисахариды и сердечно-сосудистые заболевания
Известны эпидемиологические исследования, свидетельствующие о наличии обратной связи между потреблением пищевых волокон и риском сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе инфаркта миокарда (Khaw, Barret-Connor, 1987; Humble et al., 1993; Rimm et aL, 1996). Отсутствие волокон в рационе может способствовать развитию ожирения. У лиц с избыточным весом потребление волокон существенно ниже, чем у худых (Alfieri et al., 1995). В связи с этим для более успешного лечения ожирения рекомендуется диета, богатая волокнами (Pasman et al, 1997). Пищевые волокна, с одной стороны, могут обеспечить появление чувства раннего насыщения за счет растяжения стенок желудка, а с другой — уменьшить абсорбцию экзогенной глюкозы, вероятно, благодаря замедленной диффузии углеводов через гелевый слой полисахарида (Toeller et al,, 1999). Экспериментальные исследования на животных и клинические наблюдения на людях доказывают, что некрахмальные полисахариды снижают такой важный фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний, как уровень холестерина в сыворотке крови. Этот эффект отчетливо показан для пектинов (Rolandelli et al., 1989; Glore et aL, 1994; Yamaguchi et al., 1994; Fernandez, 1995; Truswell, 1995; Yamaguchi et aL, 1995; Ті wary et al., 1997; Gonzalez et al., 1998; Terpstra et aL, 1998; Brown et aL, 1999; Knopp et al, 1999), альгинатов (Mouecoucou et aL, 1991; Zee, 1991; Nishide et aL, 1993; Suzuki et al., 1993; Yoshie et al, 1995; Kimura et aL, 1996; Wang, Yang, 1997) и хитозана (Fukada et aL, 1991; Ikeda et aL, 1993; Maezaki et aL, 1993; Deuchi et aL, 1995; Razdan, Pettersson, 1996; Ormrod et al., 1998; Gallaher et aL, 2002; Ylitalo et al., 2002; Bokura, Kobayashi, 2003). Механизм холестерин-снижающего действия полисахаридов обусловлен связыванием в просвете кишечника желчных кислот, обеспечивающих всасывание холестерина в кровь. В результате повышения вязкости содержимого кишечника усиливается фекальная экскреция желчных кислот (Topping, 1994). Вследствие усиленного синтеза в печени новых желчных кислот происходит снижение уровня холестерина в крови (Kritchevsky, 1995; Seal, Mathers, 2001; Stark et ah, 1996). Кроме того, так как полисахариды слабее связывают гидрофильные желчные кислоты, то в плазме увеличивается относительное содержание гидрофобных желчных кислот, которые сильнее, чем гидрофильные кислоты, ингибируют активность холестерин-7о гидроксилазы в печени (Matheson et al., 1995).
Другое объяснение может состоять в продукции короткоцепочных жирных кислот (пропионовой, уксусной и масляной) при бактериальной ферментации некрахмальных полисахаридов (Kishimoto et al., 1995). Экспериментально показано, что эти кислоты ингибируют синтез холестерина в печени (Chen et al., 1984; Moundras et al., 1995). Кроме этого, хитозан способен образовывать ионные комплексы с жирами, в том числе и с холестерином, и ингибировать их абсорбцию и рециркуляцию из кишечника в печень (Ylitalo et al., 2002). Повышенное потребление пищевых волокон связано также обратной зависимостью с уровнем систолического и диастолического давления (Ascherio et al.t 1996). Диета уменьшала диастолическое и систолическое давление на 10-15 мм рт.ст. (Bagger et al., 1996). У мужчин-гипертоников избыточное потребление волокон значительно снижало риск гипертонических кризов (Ascherio et al., 1998). В патогенезе осложнений атеросклероза большое значение придают состоянию свертывающей и антисвертывающей систем крови. Предполагается, что не только концентрация фибриногена, но и состояние фибриновой сети вносит вклад в риск сердечно-сосудистых осложнений. Наблюдения, проведенные на добровольцах с гиперлипидемией, показали, что прием пектинов по 15 г в день в течение 4 недель приводит к изменению качественных характеристик фибриновой сети: она становится более проницаемой, менее прочной при растяжении и легко лизируемой. Поэтому пектиновая добавка была рекомендована больным с повышенным уровнем общего холестерина и плазменного фибриногена (Veldman et al, 1999). Показано, что ряд производных хитозана in vitro проявляет антикоагулянтную активность (Huang et ah, 2003). Хорошо известны антикоагулянтные свойства и фукоидана (Chevo-lot et ah, 1999). Однако более важными и перспективными представляются исследования, посвященные способности фукоиданов индуцировать образование сосудов и оказывать лечебный эффект при критической ишемии мышц (терапевтический ангиогенез). Известно, что в регуляции восстановления сосудов в ишемизированных участках тканей участвуют факторы роста фиб-робластов (ФРФ), которые инициируют митотическое деление эндотелиаль-ных клеток сосудов, фибробластов и гладкомышечных клеток. Высокомолекулярные фукоиданы связываются с факторами роста, в том числе с ФРФ, защищают их от протеолиза (Bel ford et ah, 1993) и тем самым способствуют образованию новых сосудов (Matou et ah, 2002). Кроме того, высокомолекулярные фукоиданы индуцируют высвобождению глюкозаминогликан-связанного стромального фактора-1 (СФ-1), который мобилизует прогенито-ры стволовых клеток костного мозга (Amara et ah, 1999; Sweeney et ah, 2000; Sweeney et ah, 2002). Последние, в свою очередь, участвуют в ангиогенезе вместе с фактором роста сосудистого эндотелия и ФРФ. Низкомолекулярный фукоидан (7±2 kDa) на модели ишемизированной конечности крыс также потенцировал сосудо восстанавливающие эффекты ФРФ, мобилизовал СФ-1 и повышал плотность капилляров в пораженных тканях (Luyt et ah, 2003).
В отличие от высокомолекулярного фукоидана и гепаринсульфатов низкомолекулярный фукоидан не обладает прямым антитромбиновым эффектом (Millet et ah, 1999) и поэтому лишен геморрагических побочных эффектов, что делает его перспективным для клинического применения. 1.3. Некрахмальные полисахариды и заболевания желудочно-кишечного тракта Первый эффект, который оказывают некрахмальные полисахариды после приема, связан с изменением вязкости содержимого желудка и кишечника, что приводит к замедлению желудочно-кишечного транзита. После про- хождения по тонкой кишке некрахмальные полисахариды ферментируются в толстой кишке анаэробными бактериями в короткоцепочные жирные кислоты. В толстой кишке следствием наличия некрахмальных полисахаридов и продуктов их бактериальной деградации являются увеличение объема стула, ускоренный транзит по толстой кишке и повышенное образование кишечных газов. Благодаря сильной водоудерживающей способности некрахмальные полисахариды увеличивают содержание воды в стуле (Plaami, 1997). На поверхности слизистой желудка и кишечника высокомолекулярные полисахариды формируют гель и благодаря этому оказывают обволакивающее и защитное действие, предохраняя слизистые оболочки от раздражающего влияния агрессивных факторов. Продукты кишечной ферментации некрахмальных полисахаридов — это Сі-Сб-монокарбоновьіе кислоты, в том числе С2-С4-кислоты: уксусная, про-пионовая и масляная, соотношение между которыми зависит от состава анаэробной флоры и рН содержимого кишки. У человека эти кислоты легко абсорбируются в кишечнике и обеспечивают от 5 до 10% базальной энергетической потребности. Они же являются основными компонентами питания для эпителиальных клеток выстилки толстой кишки (Clausen, Mortensen, 1994). За счет стимуляции пролиферации эпителиальных клеток эти кислоты обеспечивают заживление поврежденной поверхности кишечника. Слизистая толстой кишки реагирует острым или хроническим воспалением на резкое уменьшение доступности бутирата, пропионата и ацетата. Поэтому недостаточное потребление некрахмальных полисахаридов приводит к низкой продукции жирных кислот и обусловливает высокую частоту расстройств толстого кишечника. Включение в диету дополнительных количеств полисахаридов оказывает лечебный эффект (Plaami, 1997; Luhrs et aL, 1999). Короткоцепочные жирные кислоты улучшают микроциркуляцию в стенке толстой кишки и усиливают моторную функцию кишечника, ограничивая тем самым обсеменение тонкой кишки рефлюксирующим содержимым толстой кишки. В опытах на животных с экспериментальным колитом пектин увеличивал высоту ворсинок и глубину крипт тонкой кишки, повышал уровень энтероглюкагона в плазме и стимулировал продукцию монокарбоновых жирных кислот (Fukunaga et al., 2003).
Методы оценки антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов
Антиоксидантную активность исследуемых веществ определяли тремя способами. Во-первых, по их способности в условиях in vivo подавлять процессы пероксидации и активировать антиоксидантные механизмы при окислительном стрессе, вызванном различными активаторами перекисного окисления липидов у экспериментальных животных. Во-вторых, по способности исследуемых веществ тормозить Ре2+-аскорбатиндуцированное перекисное окисление липидов мембран гепатоцитов в 0,05 М трисовом буфере (рН 7,4). В-третьих, по их способности восстанавливать Fe3+ in vitro (модифицированный метод FRAP) и ингибировать Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида. На экспериментальных животных были проведены три серии опытов: по проверке лечебного действия (1 серия), профилактического действия (2 серия) и лечебно-профилактического действия (3 серия) некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса, вызванного различными индукторами перекисного окисления липидов. В качестве индукторов перекисного окисления липидов использовали следующие вещества: тетрахлорметан (ССЦ), ацетат свинца и этанол. Указанные вещества вводили внутрижелу-дочно, натощак, за 1 ч до кормления животных. Ацетат свинца растворяли в дистиллированной воде, а тетрахлорметан - в оливковом масле. Интактные животные получали обычную виварийную пищу. Для исследования лечебного действия некрахмальных полисахаридов был проведен ряд экспериментов. В первом опыте крысам с окислительным стрессом, вызванным введением 1,0 мл тетрахлорметана в дозе 300 мг/кг массы тела животного в течение 7 дней, энтерально водили 1,0 мл раствора низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в дозах 10, 50 и 250 мг/кг массы тела, а фукоидана, хитозана, Х-каррагинана и к-каррагинана в дозе 200 мг/кг массы тела в течение 21 дня. Во втором опыте крысам с окислительным стрессом, вызванным введением ацетата свинца в дозе 100 мг/кг в течение 15 дней, внутрижелудочно вводили раствор низкоэтерифицированного пектина в дозе 200 мг/кг массы тела в виде 1% геля в течение 15 дней. В третьем эксперименте лабораторным животным в начале вводили ацетат свинца в дозе 100 мг/кг массы тела в течение 20 дней, а затем раствор низкоэтерифицированного пектина в дозе 200 мг/кг массы тела в виде 1% геля в течение 14 и 28 дней.
Для исследования профилактического действия полисахаридов крысам в начале эксперимента вводили внутрижелудочно 1,0 мл раствора низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в дозах 10, 50 и 250 мг/кг массы тела за 1 час до кормления в течение 21 дня, а на 22 день - тетрахлор-метан в дозе 300 мг/кг за 1 час до кормления в течение 7 дней. Для исследования лечебно-профилактического действия полисахаридов крысам ежедневно в течение 7 дней вводили 1% раствор пектина-зостерина в дозе 100 мг/кг массы тела, а через 1 ч - 40% раствор этилового спирта в дозе 7 мл/кг. По завершении экспериментов животных декапитировали под легким эфирным наркозом, собирали кровь, извлекали печень и хранили их при -20С до проведения анализов. Для определения в печени животных содержания продуктов перекис-ного окисления липидов, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), после индукции перекисного окисления липидов системой Fe2+-acKop6aT брали навеску печени, промывали физиологическим раствором, гомогенизировали при 0-4С в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4) и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. В супернатанте определяли концентрацию белка. К супернатанту добавляли 10 мкМ раствор FeiT и 0,5 мМ раствор аскорбиновой кислоты, затем смесь инкубировали в течение 30 мин в водяном термостате при 37С при постоянном перемешивании. Через 30 мин с момента добавления прооксидантов (10 мкМ раствор Fe и 0,5 мМ раствор аскорбиновой кислоты) из смеси отбирали аликвоту в 1,0 мл и реакцию останавливали добавлением к ней 1,0 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1,0 мл 0,75% тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Полученную смесь перемешивали и нагревали в горячей водяной бане в течение 15 мин, а затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Содержание ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) в надосадочной жидкости определяли спектрофотомет-рически при длине волны 532 нм, используя молярный коэффициент экстин-ции є=1,56х105М" см"1 (Владимиров, Арчаков, 1972). Для определения способности некрахмальных полисахаридов в уело-виях in vitro ингибировать Fe -аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида к 2,0 мл 1% твина-80 добавляли 0,2 мл 1 мМ раствора FeSC 4 7НгО, 0,2 мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты и 0,2 мл 0,1%, 0,5% или 1% раствора полисахарида, в контрольную пробу - соответствующее количество дистиллированной воды. Смесь инкубировали 48 ч при 37С, затем к 2,0 мл смеси приливали 1,0 мл 40% раствора ТХУ, выдерживали 60 мин и центрифугировали при 8000 об/мин 15 мин. После этого к 1,0 мл надосадочной прибавляли 2,0 мл 0,25% раствора ТБК и кипятили в водяной бане в течение 15 мин. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 532 нм против дистиллированной воды. Расчет проводили по формуле: где DK и D„ - оптическая плотность соответственно контрольной и опытной проб (Галактионова и др., 1998).
Для определения восстанавливающей способности полисахаридов in vitro (модифицированный метод FRAP), к 0,3 мл свежеприготовленного реагента (0,5 мкМ раствор FeCb 6Н20, 0,25 мкМ раствор 2,4,6-трипиридил-8- триазина в 1 мкМ НС1 и 75 мкМ ацетатный буфер (рН 3,6)) добавляли 0,04 мл 0,1%, 0,5% или 1% раствора полисахарида или дистиллированной воды. Восстановительную способность определяли спектрофотометрически по количеству образовавшегося в течение 60 мин окрашенного комплекса Fe2+ с 2,4,6-трипиридил-Б-триазином при длине волны 593 нм (Benzie, Strain, 1996). Содержание уроновых кислот определяли колориметрическим т-гидроксидифениловым методом (Blumenkrantz, Asboe-Haunsen, 1973). Степень этерификации пектинов устанавливали титриметрическим методом (Афанасьев и др., 1984). Характеристическую вязкость определяли в смеси 0,05 М раствора NaCl и 0,005 М раствора оксалата натрия при температуре 25 С и рН 6,0, использую вискозиметр Уббелода. Характеристическая вязкость связана с молекулярным весом империческим уравнением Марка-Куна-Хауинка (Kravchenko, Pilnik, 1990). Содержание первичных продуктов перекисного окисления - диеновых конъюгатов (ДК) ненасыщенных жирных кислот - определяли по характерному спектру поглощения раствора липидов в смеси изопропанол-гептан. К 0,2 мл плазмы крови приливали 4,0 мл смеси изопропанол-гептан (1:1), встряхивали 10-15 мин на шейкере, прибавляли 1,0 мл раствора НС1 (рН 2,0), 2,0 мл гептана и интенсивно встряхивали. Через 20-30 мин отбирали верхний гептановый слой, в котором измеряли оптическую плотность при длине волны 233 нм (Гаврилов, Мишкорудная, 1983). Для определения в печени экспериментальных животных содержания продуктов перекисного окисления липидов, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), навеску печени промывали физиологическим раствором, гомогенизировали при 0-4С в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4) и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. В супернатанте определяли концентрацию белка. К 1,0 мл супернатанта добавляли 1,0 мл 30% раствора ТХУ и 1,0 мл 0,75% раствора ТБК. Полученную смесь перемешивали и нагревали в горячей водяной бане в течение 15 мин, а затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Содержание ТБК-АП в на-досадочной жидкости определяли спектрофотометрически при длине волны 532 нм, используя молярный коэффициент экстинции =1,56x105 М"1см"1 (Владимиров, Арчаков, 1972). Содержание ТБК-АП в плазме крови экспериментальных животных определяли следующим образом. К 0,3 мл плазмы крови добавляли 3,0 мл 30% раствора ТХУ, 1,0 мл 0,65% раствора ТБК и 2,5 мл 0,05 М раствора сульфата натрия.
Оценка профилактического действия некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса
В этой серии экспериментов вначале вводили полисахариды в течение определенного промежутка времени, а затем вещества, вызывающие индукцию перекисного окисления липидов. Предварительное введение низкоэте-рифицированного пектина и альгината кальция в дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг массы тела здоровым интактным животным в течение 21 дня не приводило к достоверным изменениям параметров, определяющих состояние про- и анти-оксидантных систем, а также активности аланинаминотрансферазы и аспар-татаминотрансферазы, уровня общего и конъюгированного билирубина (при сравнении с группой «интактные-1») (табл. 10-13). В дозе 250 мг/кг массы тела пектин и альгинат кальция достоверно понижали уровень ТБК-активных продуктов в печени в среднем соответственно на 26,3% и 48,5%, ТБК-активных продуктов в плазме крови - на 28,9% и 32,2% (табл. 10, 11). Профилактическое введение полисахаридов существенно повлияло на развитие патологических изменений в печени, вызванных 7-ми дневным введением тетрахлорметана в дозе 300 мг/кг массы тела. В группе животных, получавших пектин и альгинат в дозе 250 мг/кг массы тела в течение 21 дня перед введением тетрахлорметана, все регистрируемые биохимические показатели состояния печени и плазмы крови достоверно отличались от соответствующих показателей в группе «контрольная-2». В группе животных, получавших низ-коэтерифицированный пектин, значения активности про- и антиоксидантной систем были следующими: содержание ТБК-активных продуктов в печени было меньше на 40,1%, ТБК-активных продуктов в плазме крови - на 57,7%, диеновых конъюгатов - на 39,2%; уровень восстановленного глутатиона был выше на 75,9%, тиоловых групп - на 65,5% и антиоксидантной активности плазмы крови - на 83,2% (табл. 10). В группе животных, получавших альги-нат кальция, уровень ТБК-активных продуктов в печени был ниже на 42,5%, ТБК-активных продуктов в плазме крови - на 52,9%, диеновых конъюгатов — на 42,5%, а уровень восстановленного глутатиона был выше на 76,6%, тиоло- вых групп — на 92,7% и антиоксидантной активности плазмы крови — на 71,1% (табл. 11).
Под влиянием низкоэтерифицированного пектина наблюдали значимое снижение активности аланинаминотрансферазы и аспартатами-нотрансферазы соответственно на 68,8% и 60,6% и уровня общего и конъю-гированного билирубина - на 50,6% и 40,7% (табл. 12). У животных, получавших альгинат кальция, активность аланинаминотрансферазы и аспартата-минотрансферазы была ниже на 69,7% и 59,2% соответственно, а уровень общего и конъюгированного билирубина - на 47,0% и 48,6% (табл. 13). У животных, которым предварительно вводили пектин и альгинат кальция в дозе 50 мг/кг, после последующего введения тетрахлорметана достоверно изменились четыре показателя из десяти. В группе животных, получавших пектин, уровень глутатиона был на 34,6%, а антиоксидантной активности на 37,7% выше, чем в группе животных, не получавших пектин перед введением тетрахлорметана. Активность аланинаминотрансферазы была ниже на 22,5%, а аспартатаминотрансферазы - на 27,1% (табл. 10, 12). В группе животных, получавших альгинат кальция, уровень глутатиона был на 59,6%, а антиоксидантной активности на 39,2% выше, чем у животных, не получав- t ших альгинат перед введением тетрахлорметана. Активность аланинами- нотрансферазы была на 21,6%, а аспартатаминотрансферазы - на 30,7% ниже (табл. 11, 13). И низкоэтерифицированный пектин и альгинат кальция в дозе У животных, получавших в течение 7 дней одновременно с 40% этанолом в дозе 7 мл/кг массы тела пектин-зостерин в дозе 100 мг/кг массы тела в виде 1% геля, все регистрируемые показатели достоверно отличались от соответствующих параметров в контрольной группе животных. Уровень ТБК-активных продуктов в плазме крови был ниже на 9,4%, а в печени - на 28,9%. У животных экспериментальной группы содержание общего холестерина в плазме крови было на 24,7% ниже, чем у животных, не получавших пектин-зостерин. Количество триглицеридов в плазме крови было на 23,5% ниже, чем в контрольной группе животных (табл. 14). Таким образом, полученные результаты первой серии эксперимента, проводимой для изучения лечебного действия исследуемых полисахаридов показывают, что на фоне окислительного стресса, индуцированного 7-ми дневным введением тетрахлорметана в дозе 300 мг/кг массы тела, внутриже-лудочное введение растворов низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в течение 21 дня в различных дозах по-разному отражается на показателях про- и антиоксидантной систем и состояния печени животных. Введение пектина и альгината кальция в дозе 250 мг/кг массы тела приводило к нормализации всех регистрируемых показателей по сравнению с таковыми в контрольной группе животных. Оба полисахарида в дозе 50 мг/кг массы тела достоверно повлияли на восемь показателей, а в дозе 10 мг/кг массы тела максимум на три показателя из одиннадцати. Введение хитозана и фукоидана в дозе 200 мг/кг массы тела приводило к нормализации всех регистрируемых показателей. Лямбда и каппа карраги-наны в той же дозе ни на один из показателей не повлияли. 15-дневное введение низкоэтерифицированного пектина в дозе 200 мг/кг массы тела крысам с окислительным стрессом, вызванным 15-дневным введением ацетата свинца в дозе 100 мг/кг массы тела, приводило к нормализации всех регистрируемых параметров функционального состояния печени и про- и антиоксидантной систем. На фоне окислительного стресса, индуцированного 20-дневным введением ацетата свинца в дозе 100 мг/кг массы тела, введение низкоэтерифицированного пектина в дозе 200 мг/кг массы тела в течение 14 дней приводило к нормализации всех регистрируемых показателей про- и антиоксидантной систем и состояния печени. У животных, получавших пектин в течение 28 дней, исследуемые показатели более значимо отличались от аналогичных в контрольной группе животных.
Во второй серии опытов, проводимой для изучения профилактического действия исследуемых полисахаридов на модели окислительного стресса, индуцированного 7-дневным введением тетрахлорметана в дозе 300 мг/кг 69 массы тела, установлено, что предварительное внутрижелудочное введение низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в течение 21 дня до-зо-зависимым образом влияет на показатели про- и антиоксидантной систем и состояния печени, вызванные тетрахлорметаном. Профилактическое введение пектина и альганата кальция способствует нормализации всех регистрируемых биохимических показателей состояния печени и плазмы крови. После предварительного введения пектина и альганата кальция в дозе 50 мг/кг массы тела достоверно изменялись только четыре показателя из десяти, а в дозе 10 мг/кг массы тела оба полисахарида не оказали достоверного воздействия ни на один из регистрируемых показателей. Полученные результаты третьей серии эксперимента, проводимой для исследования лечебно-профилактического действия полисахаридов на модели окислительного стресса, показывают, что одновременное внутрижелудочное введение 40% этанола и пектина-зостерина в течение 7 дней приводит к достоверному снижению уровня ТБК-активных продуктов, общего холестерина и триглицеридов у крыс по сравнению с таковыми в контрольной группе животных. Эксперименты по исследованию антиоксидантного действия некрах-мальных полисахаридов на Fe -аскорбатиндуцированное перекисное окисление липидов мембран гепатоцитов проводили на беспородных белых крысах-самцах, которых разделяли на группы: интактные, контрольные и экспериментальные. Интактные животные (негативный контроль) получали обычную пищу вивария на протяжении каждого эксперимента. Животным контрольных групп (позитивный контроль) внутрижелудочно с помощью зонда вводили индуктор перекисного окисления липидов: ацетат свинца в дозе 50 мг/кг массы тела в пересчете на металл. Для оценки антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов в условиях нормы животным экспериментальных групп внутрижелудочно вводили исследуемые полисахариды в виде растворов и суспензий. А для оценки антиоксидантного действия полисахаридов на фоне окислительного стресса животным экспериментальных групп вводили ацетат свинца и исследуемые полисахариды.
Оценка антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов по ингибированию Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до мало нового диальдегида in vitro
Антиоксидантные свойства некрахмальных полисахаридов изучали с помощью метода основанного на измерении способности тестируемых веществ тормозить Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида. Для этого в инкубационную среду, содержащую водные растворы твина-80, сернокислого железа и аскорбиновой кислоты, вводили полисахариды в виде 0,1%, 0,5% и 1% растворов. Полученную смесь инкубировали в течение 48 ч при температуре 37С. Об антиоксидантной активности полисахаридов судили по степени ингибирования ими Fe2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида и выражали в процентах. В результате экспериментальной работы было установлено, что среди всех исследуемых полисахаридов хитозан обладает максимальной ингиби-рующей активностью. В концентрации 1% степень ингибирования Fe+-аскорбатиндуцированного окисления твина составляла 27,3±1,1%. В концентрации 0,5% степень ингибирования твина составляла 22,1±0,9%, а в концентрации 0,1% - 18,2±0,5% (рис. 19). Следующим по антиоксидантной активности оказался фукоидан. Уровень антиоксидантной активности 1% раствора фукоидана составлял 23,8±0,7%, 0,5% раствора - 17,8±0,7%, а 0,1% раствора - 6,4±0,4% (рис. 20). Средней ингибирующей активностью обладали альгинат кальция, аль-гинат натрия, зостерин и низко- и высокоэтерифицированные пектины. В концентрации 1% степень ингибирования Fe -аскорбатиндуцированного окисления твина составляла 14,2±0,7%, 12,2±0,5%, 10,9±0,6%, 10,9±0,4% и 10,2±0,7% соответственно. В концентрации 0,5% степень ингибирования твина составляла соответственно 8,7±0,5%, 9,7±0,7%, 5,3±0,4%, 7,7±0,5% и В качестве сравнения были использованы камедь карайи, милдронат и эмоксипин. Уровень антиоксидантной активности 1% раствора камеди ка-райи составлял 12,7±0,5%, 0,5% раствора — 11,8±0,6%, а 0,1% раствора — 9,2±0,4% (рис. 26). У милдроната ингибирующая активность была выше, чем у эмоксипина. В свою очередь, ингибирующая активность эмоксипина была самой низкой по сравнению со всеми тестируемыми веществами. Уровень антиоксидантной активности 1% растворов милдроната и эмоксипина составлял соответственно 23,4±0,5% и 6,5±0,4%, 0,5% растворов - 14,3±0,5% и 6,5±0,4%, а 0,1% растворов - 8,6±0,6% и 2,0±0,3% (рис. 27, 28).
В любой живой аэробной клетке происходит образование так называемых активных форм кислорода, т. е. соединений, имеющих неспаренный электрон: синглетный возбужденный кислород (CV), супероксидный анион-радикал (02 ) перекись водорода (Н2О2), пергидроксильный радикал (Н02), гидроксильный радикал (OFT), гипогалоиды (OCrWHOCl, OBrV»-HOBr, ОГ«- Н01), органические радикалы и перекиси (Ursini et al., 1989; Bast et al, 1991; Меньшикова, Зенков, 1993). Основными источниками активных форм кислорода являются: 1) ней-трофилы и другие фагоциты (моноциты, макрофаги, эозинофилы) в процессе активации их функций; 2) гипоксантин, накапливающийся при гипоксии и утилизации при реоксигенации под влиянием ксантиноксидазы; 3) процессы образования метаболитов арахидоновой кислоты, в частности, простагланди-нов G2 и Нг (эндоперекисей) и лейкотриенов (В4 и др.); 4) процессы образования катехоламинов; 5) аутоокисление гемоглобина до метгемоглобина; 6) неферментативное образование активных форм кислорода в реакции Хабера-Вейса при взаимодействии супероксидного радикала с перекисью водорода в присутствии ионов металла с переменной валентностью (железа и меди) или в реакции Фентона при взаимодействии перекиси водорода с двухвалентным железом (Михайлов, 1999). Физиологический уровень свободнорадикальных процессов и перекис-ного окисления липидов в организме является необходимым звеном метаболизма (Фархутдинов, Лиховских, 1995). Усиление свободнорадикального окисления в клетках и тканях приводит к синдрому пероксидации, включающему в себя повреждение мембран, инактивацию или трансформацю ферментов, нарушение процессов деления и дифференцировки клеток и накопление инертных биополимеров (Воскресенский, 1986). Выделяют следующие основные причины, способствующие активации свободнорадикального окисления в тканях: снижение поступления в организм алиментарных антиоксидантов, стресс, поступление в организм проок-сидантов (пестициды, лекарства-окислители, фотохимические продукты смога и др.), избыточное поступление жиров и углеводов при недостаточном их расходовании, гипокинезия с низким уровнем биологического окисления, физические факторы (радиация, ультрафиолетовое облучение, электромагнитное поле), снижение активности антиоксидантных ферментов (Воскресенский, 1986; Бобырев, 1989). Свободнорадикальные реакции контролируются системой антиокси-дантной защиты, к которой относят специализированные ферментативные и неферментативные антиоксиданти (Бобырев, 1994; Воскресенский, 1986). Антиоксидантом называют любое вещество, которое устраняет или тормозит чрезмерно активированные свободнорадикальные реакции и перекисное окисление липидов (HalHwell, Gutteridge, 1990; Михайлов, 1999). Число антиоксидантов постоянно возрастает. Однако универсальной классификации антиоксидантов пока нет.
Кения с соавторами (1993) разделяют антиоксиданты на три группы в зависимости от их молекулярной массы. Первую группу составляют высокомолекулярные соединения — ферменты антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионзави-симые пероксидазы), а также белки, способные связывать ионы железа и меди (лактоферрин, трансферрин, ферритин, церулоплазмин). Ко второй группе авторы относят низкомолекулярные соединения - некоторые аминокислоты, полиамины, мочевина, мочевая кислота, глутатион, аскорбиновая кислота, билирубин, оугокоферол. Третью группу составляют так называемые средние молекулы плазмы крови (Кения и др., 1993). Ряд авторов классифицируют антиоксиданты по механизму антиокислительного действия. Они различают превентивные антиоксиданты и ингибиторы активных форм кислорода. Действие последних в достаточной степени специфично. Механизмы антиоксидантного действия превентивных анти- оксидантов следующие: 1) изменение структурной организации субстрата, замедляющее окисление; 2) снижение концентрации молекулярного кислорода; 3) связывание или окисление ионов металлов переменной валентности, индуцирующих разложение перекисей и образование радикалов; 4) перевод перекисей в стабильные продукты окисления (спирты, альдегиды и кетоны). Механизмы антиокислительного действия ингибиторов активных форм кислорода следующие: 1) ингибирование радикальных форм активных форм кислорода, способных инициировать образование органических радикалов; 2) прерывание окислительной цепи посредством взаимодействия с органическими радикалами (Wayner et ai, 1987; Меньщикова, Зенков, 1993). Основными внутриклеточными ингибиторами свободнорадикальных процессов являются специальные ферменты супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионзависимые пероксидазы, которые катализируют реакции с активными формами кислорода, приводящие к образованию неактивных продуктов (Aruoma etal, 1989; Fridovich, 1989; Halliwell, Gutteridge, 1990). Супероксиддисмутаза катализирует реакцию дисмутации ( в Н2О2, каталаза разлагает Н2О2, глутатионзависимые пероксидазы удаляют органические перекиси (Fridovich, 1989). Антиоксидантные ферменты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных форм активных форм кислорода, специфичностью клеточной и органной локализации, а также использования в качестве катализаторов металлов, к которым относятся Си, Zn, Mn, Fe, Se (Sies, 1991). Супероксиддисмутаза и каталаза не нуждаются в кофакторах, что делает их работу автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур.
