Роль глутаматергической системы в процессах острой и хронической боли [Электронный ресурс] Малышкин Андрей Анатольевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 10

1.1 Определение хронической боли 10

1.2 Моделирование хронических болевых синдромов в эксперименте 11

1.2.1. Хронические болевые синдромы травматической природы 13

1.2.1.1. Повреждение спинного мозга 14

1.2.1.2. Повреждениепериферических нервов 14

1.2.2 Хронические болевые синдромы воспалительной природы 16

1.2.2.1. Повреждение периферических нервов при воздействии физических факторов 16

1.2.2.2. Повреждение периферических нервов при различных заболеваниях 16

1.2.3. Хронические болевые синдромы онкологического генеза. 17

1.2.3.1. Модель нейротоксической нейропатической боли при действии химиопрепаратов 17

1.2.3.2. Повреждение периферических нервов при инвазии нервных структур опухолевыми клетками 17

1.2.3.3. Модель нейропатической боли при введении опухолевых клеток в костные структуры 18

1.3 Физиологические основы передачи и интеграции ноцицептивной информации 19

1.4 Развитие и поддержание хронических болевых процессов 26

1.4.1. Хроническая боль воспалительного генеза 26

1.4.2. Хроническая боль травматического генеза 31

1.4.3. Хроническая боль при онкологической патологии 35

1.4.4. Механизмы хронических болевых процессов 36

1.5 Роль глутаматергической системы в формировании и развитии хронических болевых синдромов 39

1.5.1. NMDA-рецепторный комплекс 40

1.5.2. NMDAepzii4ecKue механизмы хронических болевых синдромов 43

1.5.2.1. Спинальный уровень 43

1.5.2.2. Супраспинальный уровень 45

1.5.3. Терапевтический потенциал антагонистов NMDA-рецепторного комплекса46

1.5.4. Метаботропные рецепторы 52

1.5.5. Средства, влияющие на метаболизм глутамата 53

1.6 Толерантность к аналгетикам 54

ГЛАВА 2. Материалы и методы 57

2.1 Экспериментальные животные 57

2.2 Препараты 57

2.3 «Формалиновая» модель хронических болевых синдромов воспалительного происхождения 59

2.4 Хирургические манипуляции 61

2.4.1. Модель послеоперационной боли (метод Брэннана) 61

2.4.2. Модель нейропатической боли (метод Беннетта и Сие) 61

2.4.3. Модель онкологической боли (метод Медхёрста) 62

2.4.4. Операция вживления силиконового катетера в яремную вену крысы 62

2.4.5. Имплантация мини-насосов 63

2.5 Определение среднеэффективного порога тактильной реактивности 63

2.6 Модель послеоперационной боли (метод Брэннана) 64

2.7 Модель нейропатической боли (длительное механическое повреждение -метод Беннетта и Сие) 64

2.7.1. Опыты с однократным введением антагонистов NMDA-рецепторного комплекса 64

2.7.2. Опыты с субхроническим введением антагонистов NMDA-рецепторного комплекса (мемантин, нерамексан) 65

2.7.3. Опыты с острым однократным введением морфина и клофелина 66

2.7.4. Опыты с острым сочетанным введением антагонистов NMDA-рецепторов

с клофелином или морфином 67

2.7.5. Опыты с субхроническим сочетанным введением антагониста NMDA-рецепторов нерамексана и морфина 67

2.7.6. Опыты с ингибиторами фермента глутамил карбоксипептидазы (GPI

5693, GPI16072, РМРА) 68

2.7.7. Опыты с МТЕР и ЕМОМСМ 69

2.7.8. Опыты с габапентином 69

2.8. Модель онкологической боли (метод Медхёрста) 70

2.8.1. Оценка развития и проявления тактильной аллодинии 70

2.9. Тест «вращающийся стержень» 70

2.10 Тест «опрокидывающаяся плоскость» 73

2.11 Методы статистической обработки результатов 73

3. Результаты экспериментальных исследований 75

3.1 Болевой синдром воспалительного происхождения 75

3.1.1. Влияние антагонистов NMDA-рецепторного комплекса на I фазу болевого поведения, вызванного введением формалина 75

3.1.2 Влияние антагонистов NMDA-рецепторного комплекса на II фазу болевого поведения, вызванного введением формалина 76

3.1.3. Обсуждение результатов 87

3.2. Послеоперационный болевой синдром 92

3.2.1. Опыты с морфином и нерамексаном 92

3.2.2. Обсуждение результатов 95

3.3. Нейропатический болевой синдром (модель Беннетта и Сие) 97

3.3.1. Опыты с острым введением веществ 97

3.3.1.1. Опыты с антагонистами NMDA-рецепторного комплекса 97

3.3.1.1.1. Влияние на тактильную аллодинию 97

3.3.1.1.2. Влияние на моторную функцию 98

3.3.1.1.3. Обсуждение результатов 99

3.3.1.2. Опыты с антагонистами метаботропных глутаматных рецепторов 104

3.3.1.2.1. Опыты с МТЕР и EMQMCM 104

3.3.1.2.2. Обсуждение результатов 104

3.3.1.3. Опыты с габапентином 107

3.3.1.3.1. Влияние габапентина на тактильную аллодинию 107

3.3.1.3.2. Влияние габапентина на моторную функцию 108

3.3.1.3.3. Обсуждение результатов 112

3.3.1.4. Опыты с ингибиторами фермента глутамил карбоксипептидазы 113

3.3.1.4.1. Влияние GPI 5693, GPI 16072 и РМРА на тактильную

аллодинию 113

3.3.1.4.2. Влияние ингибиторов карбоксипептидазы на моторную функцию120

3.3.1.4.3 Обсуждение результатов 120

3.3.2. Опыты с острым сочетанным введением веществ 122

3.3.2.1. Опыты с клофелином 122

3.3.2.2. Обсуждение результатов 122

3.3.2.3. Опыты с введением мемантина и нерамексана совместно с клофелином 127

3.3.2.4. Опыты с морфином 128

3.3.2.5. Обсуждение результатов 128

3.3.2.6. Опыты с введением мемантина и нерамексана совместно с морфином. 133

3.3.2.7. Обсуждение результатов 134

3.3.3. Опыты с субхроническим введением веществ 136

3.3.3.1. Развитие тактильной аллодинии. Опыты с мемантином и нерамексаномІЗб

3.3.3.2. Проявление тактильной аллодинии. Опыты с мемантином и нерамексаном 140

3.3.3.3. Обсуждение результатов 143

3.3.4. Опыты с субхроническим сочетанным введением веществ 145

3.3.4.1. Опыты с нерамексаном и морфином 145

3.3.4.2. Обсуждение результатов 149

3.4. Болевой синдром онкологической природы 154

3.4.1. Опыты с морфином и нерамексаном 154

3.4.2. Обсуждение результатов 156

Заключение 161

Выводы 167

Научно-практические рекомендации 168

Список литературы

• Повреждениепериферических нервов
• Механизмы хронических болевых процессов
• «Формалиновая» модель хронических болевых синдромов воспалительного происхождения
• Влияние антагонистов NMDA-рецепторного комплекса на II фазу болевого поведения, вызванного введением формалина

Введение к работе

Актуальность проблемы

Боль играет ключевую роль в физиологических процессах адаптации организма к постоянно меняющимся условиям внешней и внутренней среды. Однако патологическая боль является актуальной медицинской и социальной проблемой (Филатова, Вейн, 1999). Клинически выделяют два вида боли, острую и хроническую. Это подразделение чрезвычайно важно для понимания самого феномена боли, так как острая и хроническая боли имеют разные физиологический смысл и клинические проявления, в их основе лежат различные патофизиологические механизмы, что требует применения различных методов лечения.

Развитие острой боли непосредственно связано с повреждением поверхностных или глубоких тканей. Длительность острой боли определяется временем действия повреждающего фактора, в то время как хроническая боль - это боль, которая перестала зависеть от основного заболевания или повреждающего фактора и развивается по своим законам. Одним из основных патогенетических механизмов хронических болевых синдромов является феномен центральной сенситизации (Звартау, Медведев, 2001), в развитии и поддержании которой ключевую роль играет глутаматергическая система. К нейропатологическим состояниям, обусловленным гипер активностью глутаматергической системы, относят не только болевые синдромы, но и классические нейродегенеративные расстройства, ишемические поражения головного мозга, различные энцефалопатии (включая диабетические), наркотическую и алкогольную зависимость. Эффекты глутамата могут опосредоваться через ионотропные (NMDA) и метаботропные рецепторы.

Большая часть исследований роли глутаматергической системы в механизмах боли была выполнена с использованием моделей острой боли, не позволяющих оценить патологические болевые процессы, сопровождающие клинические состояния, и, следовательно, не позволяющих разработать адекватные схемы применения ингибиторов глутаматергической системы.

В клинике на данный момент применяется только 4 препарата, в разной степени селективных по отношению к NMDA-рецепторам: канальные блокаторы мемантин и амантадин для лечения болезни Паркинсона, кетамин как неингаляционный общий анестетик и декстрометорфан как противокашлевое средство. Основная причина столь ограниченного клинического применения заключается в наличии у многих представителей этой группы побочных эффектов, таких как психотомиметическая активность, способность вызывать лекарственную зависимость, когнитивные расстройства и нейротоксичность.

Настоящая работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы
«Разработка эффективных методов и средств профилактики, диагностики и
лечения наркологических заболеваний на основе медико-биологических,
клинических и медико-социальных исследований» договор № 010/055/001 от
10.07.2001. Тема: «Изыскание и изучение средств фармакотерапии

наркотоксикоманий и алкоголизма в ряду веществ, влияющих на ионные каналы и нейрональные рецепторы»

Целью данной работы явилось изучение аналитической активности блокаторов глутаматергической передачи на различных моделях острых и хронических болевых синдромов и исследование возможности комбинирования этих веществ с традиционными аналитическими препаратами.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить аналитические эффекты антагонистов NMDA-рецепторов на моделях острой боли (послеоперационной и воспалительной).

2. Изучить аналитические эффекты веществ, влияющих на глутаматергическую нейропередачу, на моделях хронической боли, возникающей при повреждении нервных структур.

3. Изучить аналитические эффекты антагонистов NMDA-рецепторов на модели хронической боли, возникающей при развитии онкологической патологии.

4. Оценить эффективность антагонистов NMDA-рецепторов при сочетанном применении с другими аналитическими препаратами на моделях острой и хронической боли.

5. Оценить способность антагонистов NMDA-рецепторов предотвращать развитие толерантности к аналитическим эффектам морфина на модели хронической боли.

Положения, выносимые на защиту:

1. Активация NMDA-рецепторного комплекса играет ключевую роль в

механизмах развития хронических болевых синдромов независимо от природы повреждающего воздействия.

2. В развитие и проявление хронических болевых синдромов вовлечены не только

NMDA-рецепторы, но и другие рецепторные и метаболические механизмы, определяющие эффективность глутаматергической нейропередачи.

3. NMDA-рецепторы играют ограниченную роль в процессах, лежащих в основе

проявления как острой, так и хронической боли.

4. Антагонисты NMDA-рецепторов могут рассматриваться в качестве средств

профилактики развития хронических болевых синдромов травматической природы.

5. Сочетанное введение ингибиторов глутаматергической передачи с

традиционными аналгетиками на моделях хронической боли не обладает

преимуществами, выявленными на моделях острой боли. Научная новизна работы. Впервые изучены эффекты антагонистов NMDA-рецепторного комплекса на модели острой послеоперационной боли. Впервые культура клеток лимфосаркомы Плисса использована для моделирования хронической онкологической боли и описано взаимодействие морфина и нерамексана на данной модели. Впервые оценены эффекты антагонистов метаботропных глутаматных рецепторов 1-го и 5-го подтипов на модели нейропатической боли. Впервые произведен анализ эффективности комбинации широко используемых аналгетиков (морфин и клофелин) с антагонистами NMDA-рецепторного комплекса (мемантин и нерамексан) на модели хронической боли. Также впервые оценена способность нерамексана влиять на развитие толерантности к аналгетическим эффектам морфина на моделях хронической боли.

Научно-практическая значение работы. Полученные данные

обосновывают перспективность изолированного, но не сочетанного применения
блокаторов глутаматных рецепторов в терапии хронических болевых синдромов.
Практическая ценность работы заключается в том, что был проведен
сравнительный анализ аналгетиков с различными механизмами действия на модели
нейропатической боли. Были разработаны и апробированы новые модели для
изучения аналгетических свойств в послеоперационный период и при развитии
онкологической патологии. Экспериментально обосновано применение

низкоаффинных канальных блокаторов NMDA-рецепторного комплекса при развитии хронических болевых синдромов.

Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы кафедры фармакологии и НИЦ СПбГМУ им. И.П. Павлова.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на III, V и VI научно-практических конференциях «Санкт-Петербургские научные чтения» (С.-Петербург, 2001; 2003; 2004), на научных сессиях Института фармакологии им. А.В. Вальдмана СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (С.-Петербург, 2002, 2003), на юбилейной научной конференции молодых ученых Северо-Западного региона РФ (С.-Петербург, 2004), на 33-й ежегодной международной конференции общества нейронаук (Новый Орлеан, США, 2003), на Региональной конференции Европейской Коллегии Нейропсихофармакологии (Москва, 2005).

По результатам исследования опубликовано 10 работ.

Повреждениепериферических нервов

В зависимости от вида вызвавшего стимула гипералгезия может быть температурной, механической и химической. Первичная гипералгезия представлена тремя типами - тепловая, механическая и химическая, а вторичная гипералгезия двумя - механическая и холодовая.

Тепловая гипералгезия является ведущим симптомом боли, связанной с воспалением. Этот симптом наблюдается также при нейропатии, но преимущественно в зоне тканевого повреждения (первичной гипералгезии).

Механическую гипералгезию разделяют на 2 типа — статическая и динамическая (аллодиния). Статическая гипералгезия может быть вызвана легким надавливанием предметом с большой поверхностью и поколачиванием. Динамическая гипералгезия (аллодиния) может быть вызвана легким скользящим прикосновением («кисточковая», прикосновение волоском, укол иглой).

Динамическая гипералгезия (аллодиния) является следствием усиленного ответа чувствительных нейронов задних рогов спинного мозга на стимуляцию, проводимую по А-волокнам от низкопороговых механорецепторов. В норме активация указанных рецепторов не связана с проведением болевых ощущений. Развитие аллодинии связанно с развитием центральной сенситизации, что и позволяет выделить ее в особый вид гипералгезии. Подобное разделение требует раздельного подхода к поиску терапии, особенно в случае аллодинии, так как ее формирование и проявление связано с феноменом центральной сенситизации.

Данные о моделировании болевых синдромов при повреждении центральных отделов весьма разнородны. Были описаны различные механизмы повреждения структур центральной нервной системы, участвующих, как в проведении, так и в регуляции болевых ощущений.

Моделирование болевых синдромов при повреждении периферических отделов нервной системы имеет ряд преимуществ. Основным преимуществом является относительная простота выполнения повреждения нервной системы. Кроме того, различные модели позволяют оценить вклад разнообразных факторов (воспаление, травма и прочее) при развитии болевых синдромов.

В данном разделе приведено описание основных моделей повреждения периферических отделов нервной системы, используемых для моделирования проявлений болевых синдромов у лабораторных животных.

Травма спинного мозга. Наиболее ранняя модель, использование которой резко уменьшилось по этическим причинам. Травму осуществляют сбрасыванием груза на дорсальную поверхность спинного мозга в районе грудного или поясничного отдела, вследствие чего развивается тяжелая параплегия, сопровождающаяся болевыми проявлениями (Wang, Wang, 2003).

Фотохимическая травма спинного мозга. В кровь животного вводят фоточувствительный краситель эритрозин В, который под действием излучения аргонового лазера вызывает окклюзию сосудов спинного мозга на уровне облучения. Возникает очаг ишемии, что приводит в дальнейшем к развитию аутотомии, механической и холодовой аллодинии и гипералгезии (Нао et al., 1991).

Модель формирования невромы. При проведении ампутации нервного волокна на проксимальном конце нерва формируется неврома, состоящая из отростков избыточно регенерирующих нервных волокон. Данная модель характеризуется наибольшей частотой возникновения аутотомии, но аллодиния и гипералгезия почти не выражены. По этическим соображениям эта модель имеет ограниченное применение (Seltzer et al., 1990; Zeltser et al., 2000).

Модель хронического сдавления нерва (модель Беннета и Сие). Осуществляют путем наложения слабо завязанных лигатур на седалищный нерв. Является наиболее часто используемой моделью, так как достаточно проста в исполнении и при этом характеризуется наличием всех признаков нейропатической боли (Bennett, Xie, 1988).

Модель частичной перевязки седалищного нерва (модель Селтцера). Является модификацией предыдущей и основана на частичной перевязке седалищного нерва на уровне верхней части бедренной кости. Нерв прошивают и перевязывают на Vi - Уз от общей толщины седалищного нерва. Также характеризуется наличием всех признаков нейропатической боли. Преимуществом модели является сохранение указанных признаков в течение 7 месяцев в отличие от предыдущей модели (до 2 месяцев) (Seltzer et al., 1990).

Модель перевязки корешков спинного мозга (модель Чанга). При перевязке или перерезке корешков спинного мозга (L5 и(ли) L6) дистальнее уровня спинномозговых ганглиев развиваются признаки нейропатической боли (аллодиния и гипералгезия). Преимуществом для упомянутой модели является отсутствие у животных явлений аутотомии. Серьезным недостатком указанной модели является сложность выполнения такой модели, требующая специальной хирургической техники и практики выполнения подобных операций (Kim, Chung, 1992).

Модель холодового повреждения (крионевролиза) периферического нерва. В течение первых 7 дней появляются все основные признаки болевого поведения, и признаки нейропатической боли и сохраняются на протяжении 15-21 дней. Преимущество этой модели является временное повреждение нервных структур, что позволяет изучать не только болевые процессы, но и процессы выздоровления после повреждения нервных структур (Kim et al.,1993).

Модель перерезки хвостового участка спинного мозга. На уровне отхождения S3 и S4 нервов осуществляют удаление фрагмента спинного мозга, вследствие чего болевые процессы развиваются не на одной из конечностей, а в районе невротомов, иннервирующих хвост животного

Механизмы хронических болевых процессов

Другой немаловажной причиной, способствующей растормаживанию нейронов при периферической денервации, является снижение количества опиоидных рецепторов в дорсальных ганглиях и рогах спинного мозга. Эти рецепторы играют важную роль в механизмах регуляции болевой чувствительности, осуществляя пре- и постсинаптическое торможение ноцицептивных нейронов. Так у крыс с болевой невропатией максимальное снижение опиоидных рецепторов в спинном мозге по срокам совпадало с развитием гипералгезии (Cahill et al., 2003).

В механизмах подавления тормозных реакций при неврогенных болевых синдромах существенное значение отводится дефициту глицин- и ГАМКергического торможения. ГАМКергические интернейроны присутствуют во II - V пластинах дорсального рога. Глицин и ГАМК-содержащие нейроны активируются толстыми периферическими миелинизированными волокнами, а также нисходящими супраспинальными проекциями. В результате секреции ГАМК и активации пресинаптических ГАМКВ- и отчасти ГАМКд-рецепторов происходит снижение выделения нейротрансмиттеров из центральных терминалей первичных афферентов (Waldvogel et al., 1990).

Посредством активации постсинаптических ГАМКл-рецепторов и глициновых рецепторов осуществляется гиперполяризация и торможение активности нейронов ШДД в дорсальных рогах спинного мозга. Дефицит спинального глицин и ГАМКергического торможения возникает и при локальной ишемии спинного мозга, приводящей к развитию нейрональной гипервозбудимости и формированию аллодинии (Meyerson, Linderoth, 2000).

Следует сказать, что введение агонистов рецепторов ГАМК в нормальных условиях не вызывает аналгезии. Это позволяет предположить, глицин и ГАМКергические спинальные интернейроны в большей мере контролируют активность нейронов, возбуждаемых низкопороговыми афферентами, и нарушение этого контроля приводит к растормаживанию нейронов ШДД, получающих входы от низкопороговых Ар-волокон и высокопороговых С-волокон. Гиперактивность нейронов ШДД может служить патофизиологической основой аллодинии, так как в данном случае низкопороговая активация ШДД нейронов воспринимается как боль.

Нейропатическая онкологическая боль чаще всего связана инфильтрацией или компрессией нервных волокон опухолевыми структурами или может являться результатом лечения онкологической патологии (Regan, Peng, 2000).

При онкологической боли отмечают пролиферацию (увеличение числа) и гипертрофию (увеличение в размере тел нервных клеток и увеличение числа отростков) астроцитов, что сопровождается увеличением продукции глиального фибриллярного кислого белка (Honore et al., 2000).

Клинические данные указывают, что одним из основных факторов развития болевого синдрома у пациентов является остеолиз в результате воздействия опухолевых структур (Clohisy, Mantyh, 2003). Гистологический анализ подтверждает повышение активности остеокластов, отвечающих за разрушение кости (Clohisy et al., 1996). Также показано, что ряд веществ обладает способностью подавлять повышение активности остеокластов — белок остеопрогерин, активатор рецепторов для клеточного фактора каппа В (Clohisy, Ramnaraine, 1998; Clohisy et al., 2000).

Болевая информация поступает от ноцицепторов расположенных в надкостнице, которая обладает плотной симпатической иннервацией. Информация от афферентных волокон поступает в I слой дорсальных рогов спинного мозга (Clohisy, Mantyh, 2003).

Предполагается, что нейропатическая онкологическая боль, возникающая при повреждении костных структур, совмещает в своем генезе признаки воспалительной и нейропатической боли (Luger et al., 2001; см., однако, Honore et al., 2000).

Подобно другим видам хронических болевых процессов, онкологическая нейропатическая боль обладает способностью вызывать периферическую (высвобождение субстанции Р) и центральную сепситизацию (изменение активности ранних генов (c-fos) и повышение синтеза динорфина) (Clohisy, Mantyh, 2003; Honore et al., 2000).

Одной из первых гипотез о природе нейрогенных болей является концепция нарушения тормозного влияния лемнисковой соматосенсорной системы на восходящую палеоспиноталамическую систему (Head, Holmes, 1911). Более поздние гипотезы о механизмах формирования нейрогенной боли по существу являются детализацией концепции Хэда и Холмса о взаимодействии «специфических» латеральных и «неспецифических» медиальных структур мозга. Например, Л.А.Орбели (1936) придавал важное значение в механизмах развития патологической боли нарушению баланса между лемнисковой и экстралемнисковой системами мозга. В гипотезе «воротного механизма боли» Мелзака и Уолла (1965) существенное место отводится нарушению афферентного взаимодействия между потоком эпикритической болевой чувствительности и потоком протопатической боли. В качестве «ворот» выступает желатинозная субстанция, где сходятся ингибиторные (большого диаметра) и возбуждающие (малого диаметра) нервные волокна. Если преобладают импульсы от возбуждающих волокон, то «ворота» открываются, и в головной мозг поступает болевая информация независимо от характера афферентного стимула.

Целый ряд исследований был построен на гипотезе о том, что «wind-up» нейронов ШДД является основным механизмом развития хронических болевых синдромов. В доказательство этой теории говорят данные о гиперактивности ШДД на гомологичных моделях хронических болевых синдромов, связанных с периферическим воспалением и данные исследований на добровольцах. Феномен «wind-up» у интактных животных продемонстрирован только после стимуляции С-волокон (Schouenborg, Sjolund, 1983), а у животных с периферическим воспалением развивается и при стимуляции Ар-волокон (Weng et al., 1998).

«Формалиновая» модель хронических болевых синдромов воспалительного происхождения

Крысам в вибриссную подушку вводили 50 микролитров 5% раствора формалина. Контрольной группе крыс вместо формалина в вибриссную площадку вводили физиологический раствор. Каждую крысу тестировали только один раз. Сторону инъекции (правая и левая) чередовали. Сразу после инъекции формалина крысу помещали в прямоугольную камеру для наблюдений (30x50x30 см), изготовленную из прозрачного органического стекла. Пол камеры был покрыт стружкой древесины. За задней стенкой камеры было установлено зеркало для того, чтобы постоянно контролировать поведение животного. Поведение животных в течение 60 минут после инъекции формалина записывали на видеопленку. Одновременно с видеозаписью, которую осуществляли для контроля результатов экспериментов, поведение животного оценивал один из пяти независимых наблюдателей, незнакомых с фармакологическим воздействием на животное. Регистрировали следующие элементы поведения: касания зоны инъекции (груминг), атаксию, стереотипные движения головы. Данные заносили в компьютер с использованием программы Noldus Observer (версия 3.0). Груминг зоны инъекции формалина считается наиболее очевидным поведенческим ответом на болевую стимуляции этой зоны (Tjolsen et al., 1992).

За 30 мин до введения формалина животным (N=8) внутрибрюшинно вводили раствор исследуемого антагониста NMDA-рецепторов. Были протестированы следующие вещества и их дозы: дизоцилпин (0,03, 0,1, 0,3 мг/кг), D-CPPene (0,3, 1,0, 3,0, 5,6 мг/кг), мемантин (1, 3, 10 мг/кг), нерамексан (1, 3, 10 мг/кг), MRZ 2/600 (5, 10, 20 мг/кг), MRZ 2/601 (5, 10, 20 мг/кг), MRZ 2/615 (2,5, 5, 10, 20 мг/кг), MRZ 2/623 (2,5, 5, 10, 20 мг/кг), MRZ 2/632 (2,5, 5, 10, 20 мг/кг), MRZ 2/633 (2,5, 5, 10, 20 мг/кг), MRZ 2/640 (1, 3, 10, 30 мг/кг) или физиологический раствор (N=20 для всех веществ, кроме D-CPPene - N=8; MRZ 2/600 и MRZ 2/60 - N=24).

Предварительный анализ данных, проведенный с помощью программой Noldus Observer, позволял представить данные в виде частот и длительностей (в секундах) каждого поведенческого элемента суммарно за каждые две минуты 60-минутного теста. В дальнейшем эти данные обобщали за 6-ти минутные интервалы. Шестиминутные интервалы были выбраны на основании предыдущих работ, в которых были показаны две фазы груминга, вызванного формалином. Первая фаза длится в течение первых 6 минут, а вторая начинается через 12 минут после инъекции формалина и длится около 50 минут (Eisenberg et al., 1993). Для удобства анализа оценивали суммарные показатели: общую длительность груминга, количество серий груминга в первую и вторую фазу.

Второй метод анализа был построен на альтернативном учете данных. Сравнивали количество животных с подавлением поведенческой реакции на введение формалина в раннюю и позднюю фазы, а также количество животных с признаками токсических эффектов антагонистов NMDA-рецепторов (атаксия и стереотипные движения головы). На этом методе анализа был построен и расчет среднеэффективных доз (см. ниже).

Хирургические манипуляции осуществляли по Brennan et al., (1996). Крыс вводили в наркоз путем ингаляции фторотана. Для проведения хирургического наркоза использовали фторотан в концентрации 2 объемных процента. Острым скальпелем осуществляли разрез (приблизительно 1 см в длину) кожи и мягких тканей в области плантарной поверхности таким образом, чтобы не повредить лапные подушечки на плантарной поверхности. Кровотечение останавливали путем механического сдавления тканей. Вторую лапу оставляли интактной.

Хирургические манипуляции осуществляли по Bennett и Xie (1988). Крыс наркотизировали путем однократного внутрибрюшинного введения нембутала (60 мг/кг) или путем ингаляционного наркоза фторотаном. Делали по одному кожному надрезу по наружной поверхности каждого бедра параллельно бедренной кости приблизительно 1,5 см в длину. Ствол седалищного нерва выделяли с двух сторон путем тупого препарирования m. biceps femoris (Гамбарян, Дукельская, 1955). Одну сторону в дальнейшем обозначали как «ложнооперированную», другую сторону как «перевязанную». Сторону, на которой накладывали лигатуры, чередовали таким образом, что у половины животных в каждой экспериментальной группе «перевязанной» лапой была левая, в то время как у второй половины животных эта сторона была «ложнооперированной». На «перевязанной» стороне проксимально к трифуркации седалищного нерва на него накладывали 4 лигатуры на расстоянии около 1 мм друг от друга. Лигатуры из стерильного шелкового хирургического волокна (шелк 4-0) оставляли слабо затянутыми. Кожные раны ушивали 2-3 шелковыми швами. После операции животных помещали в теплое помещение на 3-4 часа. 2.4.3. Модель онкологической боли (метод Медхёрста)

Хирургические манипуляции осуществляли по Medhurst et al., (2002). Крыс наркотизировали путем ингаляционного наркоза фторотаном. Делали по одному кожному надрезу по внутренней поверхности голени параллельно берцовой кости приблизительно 1,5 см в длину. Берцовую кость выделяли с одной стороны путем тупого препарирования мышц и удаления надкостницы. При помощи иглы для инъекций (0,6 мм в диаметре) производили отверстие в берцовой кости приблизительно на 5 мм ниже коленного сустава. Кровотечение останавливали гемостатической губкой. В кость микрошприцом вводили 1 микролитр культуры клеток саркомы Плисса. Иглу вводили под углом к кости, чтобы предотвратить обратное вытекание введенной культуры. Образовавшееся отверстие в кости закрывали специальным воском (Bonewax, Ethicon, США). Ткани укладывали на прежнее место. Кожу ушивали скрепками (F.S.T., США).

Влияние антагонистов NMDA-рецепторного комплекса на II фазу болевого поведения, вызванного введением формалина

До проведения экспериментов с комбинированием препаратов для каждого препарата были рассчитаны дозы, который вызывали подавление тактильной аллодинии на 30 %. Полученные результаты сведены в таблице 3.17.

Для дальнейших экспериментов использовали одинаковые по эффективности дозы мемантина и клофелина (или нерамексана и клофелина), которые были определены на основании рассчитанных значений ЭДзо- Исследованные комбинации препаратов также вызывали дозозависимое подавление проявлений тактильной аллодинии (рис. 3.20 и 3.21).

Экспериментальные и расчетные значения доз комбинаций мемантина и нерамексана с клофелином, вызывавших подавление тактильной аллодинии на 30%, приведены в таблице 3.17. На рисунке 3.24 представлен анализ аддитивности использованных комбинаций препаратов.

Экспериментальные данные, которые находятся за пределами теоретически рассчитанной изоболограммы, указывают на отсутствие синергичного взаимодействия. О синергизме свидетельствуют данные, которые расположены ниже теоретически рассчитанной изоболограммы.

Для групп животных, получавших мемантин или нерамексан в комбинации с клофелином, не было выявлено никакого статистически существенного различия между экспериментально определенным уровнем доз, вызывавших аналитический эффект, и теоретически определенным значением (Таблица 3.18).

Дополнительный анализ взаимодействия исследуемых веществ в комбинации, состоявшей из клофелина в фиксированной аналгетической дозе (ЭДзо) и антагонистов NMDA-рецепторов в дозах, использовавшихся при оценке влияния на тактильную аллодинию, показал, что комбинированное введение оказывало больший аналитический эффект, чем введение только мемантина (сдвиг кривой «доза-эффект» влево) (рис. 3.21).

Доза клофелина (0,032 мг/кг), которая была исследована в этом эксперименте, обладала собственным аналгетическим, хотя и недостоверным эффектом (рис. 3.21). Статистический анализ подтвердил, что влияние мемантина и нерамексана на аналгетические способности клофелина не носило дозозависимый характер (F (5,47) = 0,5 и F (5,47) = 0,4, соответственно).

Оценка эффектов клофелина и мемантина при комбинированном введении показала достоверное аналгетическое взаимодействие препаратов (F (1,83) = 6,4,/? 0,05).

Односторонняя перевязка седалищного нерва приводила к развитию тактильной аллодинии на оперированной лапе. К моменту начала тестов с веществами средняя разность порогов на «перевязанной» и «ложнооперированной» сторонах составила 20-21 г.

Морфин дозозависимо подавлял проявления тактильной аллодинии (рис. 3.22). Полученные данные были использованы для расчета дозы, вызывавшей 30 % подавление тактильной аллодинии (ЭД3о), и последующей оценки синергизма комбинации препаратов при использовании в фиксированных дозах. Расчетное значение ЭДзо для морфина составило 3,34±0,96 мг/кг.

Морфин эффективно подавляет проявления болевого поведения при нейропатических болевых синдромах (Ossipov et al., 1995). Также показано, что морфин является эффективным аналгетиком у ряда больных с нейропатическими болевыми синдромами (Rowbotham et al., 1991; Portenoy et al., 1990).

Степень аналгезии, вызываемой введением морфина, зависит от взаимодействия спинальных и супраспинальных участков, где расположены опиатные рецепторы и, как следствие, от способа введения морфина - интратекально, внутрижелудочково или системно (Bian et al., 1999).

Также показано, что аналитические способности морфина более выражены в отношении температурной гипералгезии по сравнению с механической (Wegert et al., 1997). Показана эффективность морфина при системном введении на различных моделях нейропатической боли у крыс (Bian et al., 1995).

Результаты настоящей работы подтверждают аналитические способности клофелина и морфина при системном введении. Диапазон использованных доз в экспериментальной работе соответствовал уровню доз, необходимому для проявления фармакологического действия. Так, клофелин в дозе 0,05 мг/кг предотвращает развитие признаков нейротоксического повреждения (Farber et al., 1995). Экспериментальные данные указывают на эффективность морфина в дозе 5 мг/кг (Mitchell et al., 1998).

Опыты с введением мемантина а нерамексана совместно с морфином До проведения экспериментов с комбинациями для каждого препарата в отдельности были рассчитаны индивидуальные значения ЭД3о- Полученные результаты приведены в таблице 3.19.

Для дальнейших экспериментов использовали одинаковые по эффективности дозы (мемантин : морфин или нерамексан : морфин), которые были определены на основании рассчитанных ЭДзо- Комбинации препаратов также вызывали дозозависимое подавление проявлений тактильной аллодинии (рис. 3.23).

Для группы животных, получавших комбинации мемантин + морфин и нерамексан + морфин, было показано статистически существенное различие между экспериментальным и теоретическим значением доз комбинируемых препаратов, вызывавших снижение тактильной аллодинии на 30 % (Таблица 3.19).

На рисунке 3.24 представлен анализ эффектов сочетанного введения препаратов. Использованные вещества (морфин и клофелин) оказывали неполное подавление проявлений тактильной аллодинии. Поэтому для расчета эквиэффективных доз использовали значения доз, вызывавших 30 % подавление тактильной аллодинии. Несмотря на то, что в большинстве выполненных работ для оценки взаимодействия препаратов используются значения ЭД5о, использование других уровней считается также допустимым (Tallarida et al., 1997).

При интратекальном введении блокатор NMDA-рецепторов МК-801 оказывал простое аддитивное взаимодействие с морфином (Yamamoto, Yaksh, 1992). Интратекальное введение морфина не оказывало аналгетического эффекта на модели перевязки седалищного нерва у крыс, однако введение МК-801 позволяло достигнуть аналгетического эффекта при использовании данной комбинации (Nichols et al., 1997). Подобное сочетание также оказывало только простой аддитивный эффект при аналогичном введении на модели Беннета и Сие (Pertovaara, Wei, 2003).

Похожие диссертации на Роль глутаматергической системы в процессах острой и хронической боли [Электронный ресурс]

Исследование роли дофаминергических систем мозга в механизмах формирования наркотической зависимости у экспериментальных животных и модулирующего влияния субстанции Р и ее аналогов на процессы аддикциНиколаев Сергей Владимирович

Изучение роли серотонинергической системы в механизмах аффективного поведения крыс разного возраста при экспериментальной патологии щитовидной железыМасалова Ольга Олеговна

Роль нейрогуморальных систем в действии добутамина на ионорегулирующую функцию почекЧуб Светлана Владимировна

Регуляция устойчивости организма к геморрагической гипотензии производными 2,7-нафтиридина. Роль гипофиз-надпочечниковой системыАтаян, Тамара Карапетовна

Роль холинергической и иммунной системы в регуляции воспаления при анафилактическом и эндотоксическом шокеВладыкин Александр Львович

Нейрофармакологическое изучение механизмов взаимодействия типичных и атипичных нейролептиков с ингибиторами каналов кальцияГулиева Севиндж Тофиг кызы

Фармакологический анализ участия системы простагландинов в процессах адаптации (срочной) к гипоксииМуратов, Жанибек Кудайбекович

Влияние петлевых диуретиков на процессы перекисногоокисления липидов и антиоксидантные системы приэкспериментальной острой почечной недостаточностиКулагин, Олег Львович

Нарушения в системе крови у больных раком молочной железы в процессе лечения по схеме CAF и возможность их фармакологической коррекцииХричкова, Татьяна Юрьевна

Нарушения в системе крови у больных раком молочной железы в процессе лечения по схеме доксорубицин/доцетаксел и возможность их фармакологической коррекцииШаталова Василиса Андреевна