Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Серотонинергические механизмы регуляции мозгового кровообращения 9
1.2. Агонисты и антагонисты серотониновых рецепторов при лечении мигрени 19
ГЛАВА 2. Методы исследования 36
2.1. Методы оценки мозгового кровообращения 36
2.1.1. Регистрация мозгового кровотока с помощью ультразвукового флоуметра 36
2.1.2. Оценка состояния микроциркуляции с помощью лазерного допплеровского флоуметра 38
2.2. Моделирование спазмов сосудов мозга с помощью серотонина 39
2.3. Метод микроионофореза 39
2.4. Методика изучения антиагрегационных свойств препаратов 40
2.5. Изучение острой токсичности 41
ГЛАВА 3. Исследование связи между структурой и антисеротониновой цереброваскулярной активностью производных тропана 42
3.1. Изучение влияния серотонина на мозговое кровообращение 42
3.2. Поиск антагонистов серотонина среди производных тропана 46
ГЛАВА 4. Сравнительное изучение цереброваскулярных эффектов агонистов серотонина: соединени ЛК-769 и суматриптана
4.1. Соединение ЛК-769 58
4.2. Суматриптан 62
ГЛАВА 5. Изучение влияния тропоксина и фрагментов его молекулы на неирональную активность головного мозга
5.1. Изучение влияния тропоксина на неирональную активность головного мозга 67
5.2. Изменения нейрональной активности головного мозга под влиянием тропана и триметокибензойной кислоты 71
ГЛАВА 6. Влияние антагониста серотониновых рецепторов и противо-мигреневого препарата-тропоксина на агрегацию тромбоцитов
Заключение 83
Выводы 94
Литература 95
- Агонисты и антагонисты серотониновых рецепторов при лечении мигрени
- Регистрация мозгового кровотока с помощью ультразвукового флоуметра
- Поиск антагонистов серотонина среди производных тропана
- Изменения нейрональной активности головного мозга под влиянием тропана и триметокибензойной кислоты
Введение к работе
Актуальность темы. Изыскание и изучение фармакологических средств для лечения больных мигренью является одной из приоритетных проблем современной медицины, так как мигрень относится к одному из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний. В развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. Мигренью страдают 18% женщин, 6% мужчин 4 % детей (Stewart W.F. et al., 1994; Rasmussen B.K., 1994; Вейн А.М.и соавт., 1995; Silberstein S.D. et al., 1998; Яхно H.H. и соавт., 2001; Амелин А.В. и соавт., 2001; Черняк З.В. и соавт., 2003). Показано, что лица трудоспособного возраста - 35-40 лет мигренью болеют чаще. Исследования последних лет выявили тенденцию к увеличению числа больных мигренью (Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001; Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Яхно Н.Н., Штульман Д.Р., 2003).
Важная роль генетического фактора в возникновении мигрени получила подтверждение в многочисленных молекулярно-биологических и клинических исследованиях. Поэтому мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997; Амелин А.В. и соавт., 2001). Многочисленные исследования посвящены изучению мигрени и имеется значительный прогресс в понимании патогенеза этого заболевания, однако, многие аспекты этого страдания остаются невыясненными (Pietrobon D., Stressing J. 2003). Установлено, что в патогенезе этого заболевания существенную роль играет нейромедиатор - серотонин (Chugani D.C. et al., 1999). Серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов (Прусинский А., 1979;). В настоящее время обсуждаются следующие
5 гипотезы формирования приступа мигрени. Сосудистую гипотезу развития приступа мигрени, которая не потеряла актуальность и в настоящее время, предложили Wolff H.G. и сотрудники (1963), по мнению которых для приступа мигрени характерно первоначальное повышение тонуса мозговых сосудов с последующим его понижением. Нейрогенную гипотезу, основанную на корреляции изменений мозгового кровообращения с распространяющейся кортикальной депрессией Leao, предложили Olesen J. В. и соавторы (1981). Наконец, согласно тригеминоваскулярной гипотезе, предложенной Moskowitz М.А. (1984), система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени. Следовательно, несмотря на различия в представлениях о формировании приступа мигрени, большинство исследователей указывают на существенную роль серотонина и сосудов мозга в патогенезе этого заболевания. Вызывает сомнение лишь вопрос о первичном или вторичном значении сосудов мозга в реализации приступа мигрени.
В соответствии с вышеизложенным патогенетически обоснованным лечением больных мигренью является применение лекарственных препаратов, воздействующих на серотониновые рецепторы - агонистов 5НТів/ш- и антагонистов 5НТ2-рецепторов. Однако указанные средства не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами. Поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является важнейшей задачей современной фармакологии и медицины. Учитывая важную роль мозгового кровообращения и серотонина в патогенезе приступа мигрени, при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо выявлять вещества, обладающие способностью воздействовать на серотониновые рецепторы сосудов мозга.
Ранее в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН был создан оригинальный антагонист серотониновых рецепторов - тропоксин, который,
блокируя 5НЇ2 - рецепторы, предупреждает развитие констрикторных реакций мозговых сосудов, вызванных серотонином. Тропоксин является одним из производных тропана, которые были синтезированы в отделе химии ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН ведущим научным сотрудником, канд. хим. наук Л.М.Косточкой. Поэтому мы считали целесообразным проводить изыскание новых противомигреневых препаратов среди производных тропана. В целях понимания патогенеза мигрени представляет интерес более подробно изучить механизм действия применяемых для лечении мигрени препаратов. Поэтому представлялось важным провести дальнейшее изучение механизмов противомигреневои активности препарата - тропоксин, а также изучить цереброваскулярную серотонинергическую активность известного противомигреневого препарата-суматриптан.
Цель исследования. Изыскание новых противомигреневых препаратов среди производных тропана и изучение механизма действия тропоксина и суматриптана.
Задачи исследования.
Проведение скрининга среди вновь синтезированных производных тропана и сравнительное изучение антисеротониновой цереброваскулярной активности соединения ЛК-728 и тропоксина.
Сравнительное изучение серотонинергической цереброваскулярной активности производного тропана - ЛК-769 в сравнении с суматриптаном.
Микроионофоретическое изучение механизма нейронального действия тропоксина и выяснение роли фрагментов молекулы препарата в реализации его антисеротониновой активности.
Изучение и сопоставление антиагрегационных свойств тропоксина и известного препарата - дипиридамол.
Научная новизна работы. Исследование связи между структурой и антисеротониновои цереброваскулярной активностью среди новых производных тропана позволило выявить как антагониста, так и агониста серотонина. Выявлены антисеротониновые цереброваскулярные свойства у соединения под шифром ЛК-728, которое более продолжительно по сравнению с тропоксином ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга и изменения артериального давления, вызванные серотонином.
Агонистические свойства выявлены у другого производного тропана -шифр ЛК-769, которое, напротив, усиливает реакции сосудов мозга в ответ на введение серотонина. Эффект этого соединения сопоставим с известным агонистом серотониновых рецепторов суматриптаном. Выявлена способность суматриптана и соединения ЛК-769 оказывать двухфазное влияние на мозговое кровообращение интактных животных - первоначально снижать уровень кровоснабжения мозга, а затем его увеличивать. Эта особенность суматриптана, по-видимому, также играет роль в механизме противомигреневого эффекта препарата.
С использованием техники микроионофореза установлено, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга. Исследование нейротропной активности отдельных фрагментов молекулы тропоксина показало, что для максимального проявления антисеротониновои и противомигреневои активности препарата необходимо сохранение конформации всей молекулы.
В опытах in vitro и ex vivo обнаружена антиагрегационная активность противомигреневого препарата - тропоксин, сопоставимая с эталонным антиагрегантом - дипиридамолом.
Научно-практическая значимость работы. Обнаруженная в работе способность соединений ЛК-728 и ЛК-769 оказывать выраженное влияние на серотонинергическую систему регуляции мозгового кровообращения
8 указывает на целесообразность проведения их расширенного доклинического изучения. Установленная в результате исследований взаимосвязь между структурой и цереброваскулярной серотонинергической активностью среди производных тропана свидетельствует о целесообразности проведения дальнейших исследований в этом ряду соединений с целью создания новых препаратов с противомигреневой активностью.
Выявленная в работе зависимость антисеротониновой активности тропоксина от всей конформации молекулы препарата и способность тропоксина оказывать выраженное антиагрегационное действие расширяют наши представления о свойствах противомигреневого эффекта препарата. Обнаруженные в результате исследования особенности цереброваскулярного эффекта агониста серотониновых рецепторов - суматриптана, позволяют по-новому рассматривать механизм эффективности агониста 5НТтлз-рецепторов при лечении приступа мигрени.
Агонисты и антагонисты серотониновых рецепторов при лечении мигрени
Мигрень наиболее распространенная форма головной боли, которая известна человеку с давних времен и до настоящего времени продолжает оставаться одной из актуальных проблем современной фармакологии и медицины. Мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. (Lipton R.B. and Stewart W.F., 1997). Соотношение мужчин и женщин 1:2,5 или 2:4 (Вейн A.M. и соавт., 1995; Rasmussen В.К., 1994; Stewart W.F., Lipton R.B.,1994). Наиболее часто страдают мигренью лица в возрасте от 25 до 45 лет (68%), больные старше 55 лет и моложе 25 лет составляют 22% и 10% соответственно. По данным центра Национального здоровья США с 1981 по 1989 годы количество больных, страдающих мигренью, выросло до 60% (Stewart W.F., Lipton R.B. ,1994).
Согласно современной классификации рассматриваются две формы мигрени: мигрень с аурой и без ауры. Около 85% случаев заболевания приходится на простую мигрень или мигрень без ауры, которая характеризуется сильной односторонней пульсирующей головной болью, длящейся 4-72 часа и усиливающейся при физических нагрузках. Мигрень без ауры сопровождается комплексом периодически возникающих симптомов - головокружением, тошнотой и рвотой, звуко- и светобоязнью. Мигрень с аурой или «классическая» мигрень характеризуется различными индивидуальными сенсорными проявлениями - слуховыми, обонятельными, вкусовыми, эпигастральными и т.д., возникающими у больного непосредственно перед приступом. Приступу мигрени может предшествовать развитие кратковременной неврологической симптоматики, не превышающей часа, включая скотому, фотопсию - субъективное ощущение света, разноцветные вспышки, обусловленные раздражением зрительного анализатора (Карамышева Е.И., Горьков В.А., 2001).
Несмотря на значительный прогресс в изучении патогенеза приступа мигрени, генез приступа мигрени окончательно не установлен и многие аспекты этой проблемы остаются невыясненными (Pietrobon D., Stressing J. 2003). Мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Колосова О.А., Осипова В.В., 1991; Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997). В настоящее время установлено, что одну из существенных ролей в генезе этого заболевания играет нейромедиатор -серотонин. Важно отметить, что серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов (Прусинский А., 1979). Показано, что уровень серотонина в плазме в начале головной боли снижается, но в межприступный период соответствует норме. Уровень метаболита серотонина - 5-оксииндолуксусной кислоты во время приступа увеличивается, а затем также возвращается к норме. Исследования показали, что резерпин, который истощает содержание серотонина, может у больных мигренью спровоцировать приступ мигрени. Этот эффект резерпина существенно ослабляется при применении агонистов серотонина. Таким образом, лекарственные препараты, которые взаимодействуют с серотониновыми рецепторами, могут влиять на частоту и интенсивность приступов мигрени (Goadsby P.J, 1997).
В литературе обсуждаются различные гипотезы формирования приступа мигрени. По данным одних авторов приступ мигрени сопровождается повышением тонуса мозговых сосудов с последующим их расслаблением (Wolff H.G., 1963). Olesen J. В. и соавторы (1981) придерживаются нейрогенной гипотезы, согласно которой наблюдаемые во время приступа изменения мозгового кровообращения коррелируют с распространяющейся кортикальной депрессией Leao. В последние годы широко обсуждается значение тройничного нерва в механизмах формирования головной боли при мигрени. Согласно представлениям Moskowitz М.А. (1984) во время приступа мигрени важную роль играет система тройничного нерва, которая участвует в реализации взаимодействия между центральной нервной системой и сосудами головного мозга. Эта гипотеза получила название тригеминоваскулярной. Согласно этой гипотезе боль при мигрени обусловлена нейрогенным асептическим воспалением, а эффективность многих противомигреневых препаратов связана с их способностью предупреждать или подавлять нейрогенное воспаление в твердой мозговой оболочке. Нейрогенное асептическое воспаление возникает в результате активации периваскулярных афферентных терминалей тройничного нерва, следствием которого является деполяризация нервных окончаний и выделение из них мощных вазодилятаторов (пептид, связанный с геном кальцитонина - CGRP, субстанция Р, нейрокинин А и вазоинтестинальный пептид-VIP), которые расширяют сосуды, увеличивают проницаемость сосудистой стенки, пропотевание белков плазмы, форменных элементов крови, вызывают отек сосудистой стенки и прилегающих участков твердой мозговой оболочки, дегрануляцию тучных клеток, агрегацию тромбоцитов, что все вместе вызывает боль, которая иррадиирует в лобно-глазнично-височную область и локализуется в правой или левой половине головы. Эти представления явились основанием для разработки модели асептического нейрогенного воспаления твердой мозговой оболочки и выявления на пресинаптических окончаниях тройничного нерва 5НТш-рецепторов (Goadsby P.J. et al., 2002; Potrebic S. et al., 2003).
Следует подчеркнуть, что, несмотря на различия в представлениях о формировании приступа мигрени, сторонники различных гипотез признают, что серотонин и цереброваскулярный компонент являются существенными факторами в этом процессе. Лекарственные препараты, применяемые для лечения мигрени, делятся на две группы: препараты для профилактического лечения мигрени и средства, купирующие приступ мигрени. Фармакотерапия острого приступа мигрени должна включать лекарственные средства с клинически доказанной специфичностью, эффективностью и безопасностью и начинаться как можно быстрее, чтобы обеспечить: прерывание приступа, снятие головной боли и профилактику рецидивов.
Для лечения больных мигренью используются лекарственные препараты, относящиеся к различным группам фармакологических веществ: адреноблокаторы, антидепрессанты, блокаторы кальциевых каналов, противосудорожные, ненаркотические анальгетики и другие. Среди них особое место занимают препараты, воздействующие на серотониновые рецепторы - агонисты 5НТШ/о- и антагонисты 5НТ2в/с-рецепторов.
В соответствии с задачами настоящего исследования обзор литературы посвящен лекарственным препаратов, воздействующим на серотониновые рецепторы.
Регистрация мозгового кровотока с помощью ультразвукового флоуметра
Моделирование серотонинового спазма сосудов мозга заключалось в изучении констрикторных реакций, вызываемых серотонином при внутривенном введении исследуемым животным. Ранее в лаборатории фармакологии цереброваскулярных расстройств при изучении влияния серотонина на сосуды мозга in vivo была подобрана доза моноамина, которая вызывает уменьшение мозгового кровотока и снижение уровня артериального давления и составляет 20 мкг/кг массы животного. Эта доза была использована в настоящем исследовании.
С помощью метода микроионофореза, который проводили совместно с ведущим научн. сотр. С.Н.Кожечкиным, исследовали влияние противомигреневого препарата тропоксина и основных компонентов его молекулы тропана и 3,4,5 - триметоксибензоата (ТМБ), а также антагонистов серотониновых рецепторов: метисергида, кетансерина, ципрогептадина на чувствительность к серотонину постсинаптической мембраны нейронов сенсомоторной коры большого мозга крыс.
Эксперименты проведены на 15 беспородных крысах - самцах, массой 180 - 240 г и 4-х кроликах-самцах массой 3-4 кг.. Под галотановым наркозом производили трепанацию черепа с обнажением всей дорзальной поверхности коры головного мозга. Для предотвращения высыхания ткани, поддержания ее нормальной температуры и лучшей фиксации поверхностных слоев заливали мозг сверху теплым 5% агар-агаром. Затем животных переводили на искусственное дыхание на фоне миорелаксации диплацином (20 мг/кг внутрибрюшинно). Места фиксации черепа в стереотаксическом приборе инфильтрировали анестетиком длительного действия пролонкаином. 7-ствольные стеклянные микроэлектроды подводили с помощью микроманипулятора к нейронам сенсомоторной коры головного мозга III-Y слоев. Точка отведения соответствовала максимально вызванному потенциалу, генерируемомоу в коре при электрическом раздражении седалищного нерва. Через центральный ствол 7 - канального стеклянного микроэлектрода, заполненный ЗМ раствором NaCl, отводили внеклеточно спонтанные потенциалы действия (ПД) нейронов сенсомоторной коры (III -IV слоев), 5 стволов использовали для электрофоретического подведения веществ, и один ствол - для компенсации токовых артефактов. Применяли водные растворы веществ в эквимолярных концентрациях 0,03М, рН=4,5. Заполнение стволов микроэлектрода растворами осуществляли с помощью методов капиллярности или диффузии. Диаметр кончика многоствольного микроэлектрода составлял 4-8 мкм (Кожечкин С.Н., 1975). Изгоняющие токи были положительной полярности и силой от 0 до 150 нА (1-10"9А). В опытах с блокаторами серотониновых рецепторов использовали апплицирующий ток фиксированной величины 50 нА. Задерживающие токи в каждом канале равнялись 15 нА. Для компенсации изгоняющих токов и предотвращения токовых артефактов через один из стволов микропипетки пропускали ток, равный сумме изгоняющих токов, но противоположной полярности.
ПД нейронов после цифро-аналогового преобразования регистрировали с помощью самописца КСП-4М. Оценивали изменение частоты ПД в процентах относительно фоновой (контрольной) частоты с помощью аналогового частотомера. Достоверность результатов оценивали по t - критерию Стьюдента.
Для микроионофоретического подведения химических агентов к мембране отдельных клеток использовали водные растворы следующих веществ: серотонина (0,3 М, рН 4,5), тропоксина (0,03 М, рН 4,5), тропана (0,03 М, рН 4,5), Na- 3,4,5 - триметоксибензоата (0,03 М, рН 4,5).
Эксперименты по изучению влияния тропоксина на агрегационную активность тромбоцитов in vitro были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории патологии и фармакологии гемостаза (зав. профессор В.А.Макаров) Гематологического научного центра РАМН ст.научн.сотр. Т.М.Васильевой и вед.научн.сотр. Г.Н.Петрухиной на венозной крови здоровых доноров (п=20), которую получали путем пункции кубитальной вены и стабилизировали 3,8%-ым раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами.
В экспериментах по изучению влияния тропоксина на агрегацию тромбоцитов ex vivo использовали кроликов обоего пола массой 3,0-4,0 кг (п=4), которым болюсно внутривенно вводили данный препарат в дозе 10 мг/кг веса. Агрегацию тромбоцитов исследовали на агрегометре фирмы "Biola" (Россия) по методу Born G. (1962). С этой целью в кювету прибора помещали 300 мкл исследуемой богатой тромбоцитами плазмы. Исследуемое вещество добавляли в кювету агрегометра, инкубировали в течение 5-ти минут при 37С и затем индуцировали процесс тромбоцитарной агрегации. В качестве проагрегантов в работе использовали АДФ (Boehringer Mannheim, Австрия) в конечной концентрации 1x10"5 М и адреналин (Reanal, Венгрия) в конечной концентрации 2,5x1 О 6 М. Оптическим контролем служил такой же объем плазмы, не содержащей тромбоцитов. О степени агрегации судили по максимальной величине падения оптической плотности после окончания реакции (Атах) по сравнению с исходной величиной. В ряде экспериментов измеряли скорость агрегации тромбоцитов, которую определяли как максимальный наклон агрегационной кривой.
Поиск антагонистов серотонина среди производных тропана
Согласно нейрональной гипотезе патогенеза мигрени, серотонин, выделяющийся из пресинаптических терминалий в периваскулярные пространства коры головного мозга, может вызывать спазм сосудов мягкой мозговой оболочки, а также капилляров мозга (Lauritzen М. et al., 1982; Lance J.W., 1988). Предполагают, что центральная серотонинергическая регуляция кровотока в церебральных сосудах обусловлена активацией нейронов ядер шва среднего мозга (Martin G.R., 1994, 1997). Общепризнано, что серотониновые рецепторы играют большую роль в механизмах боли -основного симптома мигрени. Кора головного мозга является последним пунктом ноцицептивных нервных путей, ответственных за субъективное ощущение боли. Известно, что серотониновые рецепторы имеются не только на периферии, но и в ЦНС, в частности, на мембранах нейронов коры головного мозга (Paros A. et al.,1985). Показано, что периферическая васкулярная серотониновая рецепция подобна таковой в неокортексе, что делает последний удобным объектом для изучения механизма действия антисеротониновых лекартсвенных препаратов. Подведение биологически-активных веществ к отдельным нервным клеткам и волокнам стенок капилляров с одновременным отведением их активности является адекватным способом оценки нейрональной активности, тогда как, введение химических агентов в ток крови может вызывать отраженные, непрямые эффекты на нервную систему сосудов мозга, опосредуемые внешними экстраваскулярными структурами, в том числе и ЦНС.
Учитывая вышесказанное, с использованием техники микроионофореза было изучено влияние тропоксина, метисергида, кетансерина, ципрогептадина на нейрональную активность головного мозга после воздействия серотонина. В опытах с антагонистами 5НТ-рецепторов серотонин подводили ко всем нейронам с помощью фиксированного тока силой 50 нА (1x10"9 А). Всего изучено 50 нейронов.
Обнаружено, что при подведении 5НТ с помощью микроионофоретического тока силой 1-100 нА активность 19 нейронов увеличивалась и 17-ти нейронов уменьшалась. Частота 14 нейронов не изменялась.
Тропоксин оказывал слабое угнетающее действие, уменьшая частоту ПД 38 нейронов и не влияя на таковую 12 нейронов. Угнетение активности наблюдалось лишь при использовании больших изгоняющих токов (50-100 нА). При токе 100 нА максимальный тормозный эффект составлял всего лишь 32%. При подведении тропоксина (1-100 нА) на фоне депрессии нейрональной активности, вызванной 5НТ, последняя не претерпевала выраженных изменений практически у всех нейронов. Возбуждающие нейрональные ответы на 5НТ (5 Он А) уменьшались при подведении тропоксина у 15 из 19 исследованных нейронов. Полное угнетение 5НТ-ответов отмечено у 10 нейронов при сравнительно небольших токах для тропоксина (30-60 нА), когда собственный тормозный эффект у тропоксина или отсутствовал, или был чрезвычайно мал. Типичный пример изменения 5НТ-ответов возбуждающего типа под влиянием тропоксина и классических антагонистов 5НТ приведен на рисунке 9.
Метисергид, как и тропоксин, обладая малым депрессирущим эффектом на нейрональную активность, не изменял тормозные ответы на 5НТ, угнетая при этом возбуждающие 5НТ-ответы примерно с той же фармакодинамикой, как и тропоксин. При малых аплицирующих токах ( 20 нА) действие метисергида несколько сильнее, чем тропоксина, а при больших токах, наоборот, более выражен эффект тропоксина. Так как кривые пересекаются, то можно считать, что различия в эффектах метисергида и тропоксина недостоверны.
Кетансерин, обладая более сильным угнетающим действием на спонтанную активность корковых нейронов, вызывал также более выраженное, чем метисергидд и тропоксин подавление 5НТ ответов возбуждающего типа.
Эффект ципрогептадина как на спонтанную активность нейронов, так и на 5НТ-ответы возбуждающего типа был много слабее, чем у трех вышеуказанных агентов. Лишь при его подведении с помощью микроионофоретических токов более 20 нА можно было обнаружить подавление 5НТ-ответов, составляющее при максимально используемом токе (100 нА) не более 50%.
Таким образом, тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга. Из всех исследованных блокаторов 5НТ-рецепторов тропоксин наиболее близок к метисергиду. Известно, что метисергид эффективно блокирует реакции сосудов головного мозга на серотонин и является одним из противомигреневых препаратов (Прусинский, 1979; Шток, 1988; Ганьшина Т.С., 2004). Далее представляло интерес выяснить, с какой частью молекулы тропоксина связан вышеуказанный эффект. С помощью метода микроионофлреза были исследованы фрагменты молекулы тропоксина: тропановый бицикл и ароматическая часть: 3-метоксибензойная кислота (натриевая соль), на 5НТ-ответы 38 нейронов сенсоомоторной коры головного мозга крысы. Соединения были синтезированные ведущим научным сотрудником Л.М.Косточкой в отделе органического синтеза ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН.
С помощью метода микроионофореза было исследовано 38 нейронов сенсомоторной коры большого мозга беспородных крыс.
Серотонин по-разному влиял на активность нейронов: увеличивал частоту потенциалов действия (ПД) у 14 нейронов, уменьшал у 13 и не изменял у 11. Величина возбуждения и торможения нейронов под влиянием серотонина была значительной. При максимальном микроионофоретическом токе 100 нА увеличение частоты ПД у 10 нейронов из 14 составляло 150 -300%; уменьшение частоты ПД у 5 из 13 нейронов было полным (100%).
При подведении тропоксина к мембране нейронов сенсомоторной коры с помощью микроионофоретического тока силой 1 - 100 нА частота ПД большинства клеток уменьшалась (25 из 38 нейронов). Активность остальных нейронов (13) не изменялась. Тормозящее действие тропоксина было слабым: 25 - 35% от исходной активности при максимальном токе 100 нА.
Изменения нейрональной активности головного мозга под влиянием тропана и триметокибензойной кислоты
Известно, что серотонин является не только основным патогенетическим звеном в развитии приступа мигрени, но и мощным естественным проагрегантом. Поэтому способность противомигреневых средств ингибировать агрегационную способность тромбоцитов является важной составляющей эффективности этих средств.
Серотонин оказывает влияние на агрегацию тромбоцитов, связываясь со специфическими 5-НТ2 рецепторами (Bhatnagar A. et al., 2004). Взаимодействие серотонина с 5-НТ2 рецепторами приводит к активации фосфолипазы С, генерации диацилглицерина и инозит- 1,4,5-трифосфата, синтезу тромбоксана Аг (Li B.Y. et al.,1998). В результате этих реакций происходит изменение формы тромбоцитов, реакция высвобождения и обратимая агрегация (Li B.Y. et al.,1998). Несмотря на то, что серотонин является слабым активатором тромбоцитов, он усиливает агрегацию, индуцированную АДФ (Tran Н., Anand S.S.,2004), тромбином (Heemskerk J.W. et al.,1994), коллагеном (Awabdy D.et al.,2003), адреналином (Shah B.H. et al.,2001), арахидоновой кислотой (Seed S.A. et al.,2003), ФАТ и другими агонистами (Vanags D.M. et al.,1998). Установлено, что в синергетические механизмы вовлекается комплекс сигнальных молекул, включая фосфолипазы Аг и С, ионы кальция, циклооксигеназу и МАР-киназу (Tran Н., Anand S.S.,2004).
В терапии мигрени широко применяются блокаторы 5НТг-рецепторов -метисергид и пизотифен. Установлено, что данные препараты обладают антиагрегационными свойствами. Так, инкубирование тромбоцитов с метисергидом приводило к ингибированию агрегации, индуцированной арахидоновой кислотой, и реакции высвобождения (Li B.Y. et al., 1998). Пизотифен также как и метисергид уменьшал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека, стимулированную серотонином (Hladovec J., 1986). Активность пизотифена была показана не только in vitro, но и in vivo. У пациентов, получавших пизотифен в течение двух месяцев, отмечалось снижение спонтанной агрегации тромбоцитов (Mazal S., RachmilewitzE.A.,1980).
Представляло интерес изучить влияния противомигреневого препарата и антагониста 5-НТ2-рецепторов - тропоксина - на агрегационную активность тромбоцитов.
Данная работа состояла из двух этапов. В первой части работы изучали влияние тропоксина на параметры агрегации in vitro. Во второй серии экспериментов проводилось исследование влияния тропоксина на агрегацию тромбоцитов ex vivo и его сравнение с антиагрегационным эффектом препаратов, часто применяющихся в клинической практике для ингибирования тромбоцитарного взаимодействия. В качестве препарата сравнения использовался дипиридамол («Берлин-Хеми», Германия).
В экспериментах по изучению влияния тропоксина на агрегацию тромбоцитов ex vivo использовали кроликов обоего пола массой 3,0-4,0 кг (п=4), которым болюсно внутривенно вводили данный препарат в дозе 10 мг/кг веса. Для инъекции тропоксин предварительно растворяли в 5 мл физиологического раствора. Образцы крови для оценки тромбоцитарной активности забирали из краевой вены уха животного методом свободного падения капель. Кровь брали до введения вещества (контрольный опыт) и через 15, 45, 75 и 90 минут, после введения. Стабилизацию крови и приготовление образцов бедной и богатой тромбоцитами плазмы, а также измерение тромбоцитарной агрегации проводили с применением тех же методик, что и при работе с кровью доноров.
Статистический анализ полученных данных проводили в соответствии с общепринятыми методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В первой части работы было исследовано влияние тропоксина на функциональное состояние тромбоцитов человека in vitro. Полученные результаты представлены в таблицах 15 и 16.
Инкубирование богатой тромбоцитами плазмы вместе с тропоксином в течение 5 мин при 37С приводило к достоверному снижению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов in vitro во всем диапазоне изученных концентраций. При этом заметное ингибирование агрегации наблюдалось только при высоких концентрациях тропоксина. В более низких концентрациях (0,01-0,1 мг/мл) исследованный препарат уменьшал активность тромбоцитов в 1,3 раза. Следует отметить, что антиагрегационное действие тропоксина практически не изменялось при снижении его концентрации от 2 до 0,01 мг/мл (табл. 15).
В случае агрегации, индуцированной адреналином, тропоксин оказывал антиагрегационный эффект в концентрациях 2-7 мг/мл (табл. 15), однако его эффект был более выражен по сравнению с АДФ-индуцированной агрегацией. В то же время скорость агрегации достоверно уменьшалась и при применении тропоксина в концентрациях менее 2 мг/мл (табл. 16).
В результате экспериментов было показано, что тропоксин достоверно ингибировал агрегацию, индуцированную АДФ и адреналином, in vitro. Известно, что под влиянием проагрегантов происходит активация тромбоцитов, в ходе которой развивается экзоцитоз множества соединений, стимулирующих агрегационный процесс. В том числе из плотных тромбоцитарных гранул высвобождается серотонин, который затем связывается со 5-НТг-рецепторами и, таким образом, стимулирует активность тромбоцитов. Вероятно, что, тропоксин, являясь антагонистом 5НТ2-рецепторов (Ганышша Т.С., 2004), блокирует их взаимодействие с серотонином, и снижает способность тромбоцитов к агрегации. Существование у тропоксина механизма, сопряженного с влиянием на реакцию высвобождения, подтверждается также и уменьшением скорости агрегации, индуцированной адреналином, при инкубировании богатой тромбоцитами плазмы с этим препаратом.
