Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Глутаматергическая система в ЦНС 11
1.2. Роль глутаматергической системы в патогенезе заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией. Фармакология препаратов с глутаматергическим механизмом действия 18
1.3. Линия мышей с генетически детерминированным ускоренным старением SAM (Senescence-accelerated mouse) 36
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Изучение влияния веществ на обучение 42
2.1.1. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания (УРПИ) 42
2.1.2. Методика амнезии условной реакции активного избегания (УРАИ), в условиях модели челночной камеры 43
2.2. Изучение антиамнестических свойств веществ 44
2.2.1. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванная максимальным электрошоком (МЭШ) 44
2.2.2. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванная скополамином 45
2.2.3. Методика амнезии условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванная МК-801 45
2.3. Исследование анксиолитических и чанксиогенных свойств веществ 45
2.3.1. Методика приподнятого крестообразного лабирин га (ПКЛ) 45
2.4. Оценка ориентировочно-исследовательское поведения и двигательной активности , 46
2.4.1. Методика открытого поля 46
2.4.2. Тест «Opto-Varimex» 46
2.4.3. Тест «залезание на сетку» 46
2.5. Исследование влияния веществ на неврологический статус животных 47
2.5.1. Исследование неврологического дефицита по шкале Stroke-index McGrow. 47
2.5.2. Исследование нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня 47
2.5.3. Оценка мнорелаксации в тесте подтягивание на горизонтальной перекладине 47
2.6. Изучение антидепрессивных свойств веществ 48
2.6.1. Методика вынужденного плавания по Порсолту 48
2.7. Изучение нейропротективных свойств веществ 48
2.7.1. Моделирование интрацеребральной постгравматической гематомы (геморрагического инсульта) 48
2.7.2. Методика моделирования холинергического дефицита у крыс 49
2.8. Определение содержания моноаминов и аминокислот в мозге животных 50
Глава 3. Изучение, нейропротективных свойств веществ на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) 52
3.1. Исследование влияния препаратов на неврологический дефицит и гибель крыс с ГИ 53
3.2. Изучение влияние препаратов на поведение крыс с ГИ на ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле 56
3.3. Изучение влияние препаратов на поведение крыс с ГИ в приподнятом крестообразном лабиринте 60
3.4. Изучение влияние препаратов на обучение и память животных с ГИ 64
Глава 4. Изучение нейропротективных свойств препаратов на экспериментальной модели болезни Альцгеймера, в условиях дефицита холинергической системы, вызванного длительным введением скополамина 69
4.1. Влияние веществ на поведение крыс в ПКЛ 70
4.2. Влияние веществ на обучение УРПИ крыс с холинергическим дефицитом 75
4.3. Влияние веществ на обучение УРАИ крыс с холинергическим дефицитом 75
Глава 5. Эффект нооглютила, мемантина, димебона на поведение и память мышей линии SAMP 10 (Senescence-accelerated mouse prone) с генетически детерминированным ускоренным старением 79
5.1. Изучение поведения и состояния различных возрастных групп мышей линии SAMP 10 (Senescence-accelerated mouse prone) 80
5.1.1. Изучение неврологического статуса мышей с ускоренным типом старения (SAMP 10) 80
5.1.2. Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности мышей SAMP 10 81
5.1.3. Изучение уровня тревожности мышей с ускоренным типом старения (SAMP 10)вПКЛ 84
5.1.4. Изучение депрессивноподобного поведения мышей SAMP 10 в тесте вынужденного плавания (по Порсолту) 86
5.1.5. Изучение обучения мышей с ускоренным типом старения (SAMP 10) условной реакции пассивного избегания (УРПИ) 87
5.2. Изучение влияния нооглютила, мемантина, димебона на поведение и память мышей линии SAM 90
5.2.1. Изучение влияния нооглютила, мемантина, димебона на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность мышей линии SAMP10 90
5.2.2. Изучение влияния нооглютила, мемантина, димебона на поведение SAMP10 в ПКЛ 96
5.2.3. Влияние нооглютила, мемантина, димебона на депрессивноподобное поведение мышей на модели вынужденного плавания ( по Порсолту) 100
5.2.4. Изучение антиамнестической активности нооглютила, мемантина, димебона на модели обучения условной реакции пассивного избегания 101
5.3. Изучение влияния нооглютила на содержание и оборот моноаминов и аминокислот в структурах мозга мышей линии SAMP10 105
5.3.1. Изучение влияния нооглютила на содержание и оборот моноаминов в структурах головного мозга мышей линии SAMP10 106
Глава 6. Изучение участия глутаматергической системы в механизме антиамнестического действия препаратов 111
6.1. Изучение антиамнестической активности нооглютила, мемантина, димебона, на моделях амнезии УРПИ, вызванных скополамином 111
6.2. Изучение антиамнестической активности нооглютила, мемантина. димебона, на модели амнезии УРПИ, вызванной максимальным электрошоком (МЭШ) 114
6.3. Влияние нооглютила, мемантина и димебона на поведение крыс в условиях модели амнезии УРПИ, вызванной МК-801. 114
6.4. Влияние антагониста АМРА рецепторов DNQX на антиамнестические свойства нооглютила, мемантина и димебона на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ 120
Глава 7. Поиск соединений с антиамнестической активностью среди производных адамантана 126
7.1. Изучение антиамнестических свойств производных 1-аминоадамантана 127
7.2. Изучение антиамнестических свойств производных 2-аминоадамантана 129
7.3. Изучение антиамнестических свойств производных 1- оксиадамантана 131
Заключение 133
Выводы 144
Список литературы 146
- Роль глутаматергической системы в патогенезе заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией. Фармакология препаратов с глутаматергическим механизмом действия
- Исследование анксиолитических и чанксиогенных свойств веществ
- Определение содержания моноаминов и аминокислот в мозге животных
- Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности мышей SAMP 10
Введение к работе
Болезни Альцгеймера (БА), Паркинсона (БП), различные деменции, инсульты, травмы головного мозга являются наиболее агрессивными и разрушающими для организма заболеваниями. Каждый год от этих болезней погибают или становятся нетрудоспособными миллионы людей в мире. В частности, в ряде стран Б А занимает одно из первых мест среди других болезней в качестве причины смерти. Инсульт занимает третье место среди болезней, вызывающих смерть пациентов, а травмы мозга являются наиболее частыми заболеваниями, приводящими к нетрудоспособности лиц в молодом возрасте.
Большинство нейродегеративных заболеваний (БА, БП, болезнь Гентингтона, ВИЧ, различные деменции, рассеянный склероз, эпилепсия, травматические, токсические, ишемические поражения мозга, в том числе инсульты и др), хотя и вызваны различными механизмами, в итоге приводят к общему финалу -повреждению нейрона и гиперстимуляции глутаматных рецепторов, особенно NMDA подтипа. В связи с этим, антагонисты NMDA рецептора рассматриваются как потенциальные средства лечения заболеваний, протекающих с нейродегенерацией (Chen, Lipton,2006). В настоящее время активно разрабатываются препараты для лечения когнитивных расстройств и нейродегенеративных процессов с глутаматергическим механизмом действия: мемантин, церестат, талампанел, Ro 25-6981, Ro 8-4304, ампалекс, LY 379268 (O'Neill MJ et al., 2004; Yurkewicz L. et al., 2005; Yitao Liu et al., 2007).
Мемантин является низкоафинным неконкурентным антагонистом NMDA подтипа глутаматных рецепторов. Для мемантина характерна высокая скорость диссоциации с открытым ионным каналом NMDA рецепторов, что выгодно отличает его и другие низкоаффинные блокаторы NMDA рецепторов от высокоаффинных: дизоцилпина, фенциклидина, которые имеют большие побочные эффекты и высокую токсичность (Danysz, Parsons, 2003; Chen, Lipton, 2006). Другим препаратом с глутаматергическим механизмом действия является димебон. Димебон первоначально, за счет блокирующего Ні-гнетаминовые рецепторы эффекта, предлагался как антигистаминный препарат. В настоящее время у димебона выявлены нейропротективные свойства, которые подтверждены клиническими испытаниями на больных с начальными стадиями БА (Dooly R.S.et al., 2008). Механизм нейропротективного эффекта этого препарата сочетает своііства
антагониста полиаминового сайта NMDA подтипа глутаматных рецепторов и модулятора АМРА рецепторов (Григорьев В.В., 2003; Brown R.E., 2001).
В ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН в течение ряда лет осуществляется поиск и изучение механизмов действия веществ с ноотропным и нейропротективным типом действия (Середенин СБ., Воронина Т.А, 2000; Воронина Т.А, 2007; Островская Р.У. и др., 2006; Гудашева Т.А. и др., 2006; Ковалев Г.И. и др.,2008). В частности, был создан препарат, нооглютил, который является модулятором АМРА подтипа глутаматных рецепторов (Воронина Т.А.,2000; Комиссаров В.И., 2001; Гарибова Т.Л. и др.,2003).
Учитывая тот факт, что в механизме действия нооглютила, мемантина, димебона участвует глутаматергическая система, представляло интерес изучить в сравнительном аспекте эффекты препаратов на моделях нейродегенеративных состояний, установить с помощью анализаторов вовлеченность глутаматергической системы на уровне взаимодействия с NMDA и/или АМРА подтипами рецепторов в реализацию их антиамнестического эффекта и провести поиск веществ с антиамнестической активностью среди новых производных адамантана.
Цель исследования:
Изучить ноотропные и нейропротективные свойства препаратов с глутаматергическим механизмом действия: нооглютила, мемантина и димебона на моделях геморрагического инсульта, холинергического дефицита с когнитивной дисфункцией и у мышей с генетически детерминированным ускоренным старением SAMP 10, осуществить поиск соединений с антиамнестической активностью среди новых производных адамантана. Задачи исследования:
Исследовать активность препаратов в условиях нейродегенерации, вызванной интрацерсбральной посттравматической гематомой (ИПГ) - модели геморрагического инсульта (ГИ).
Изучить эффективность препаратов на модели холинергического дефицита с когнитивной дисфункцией, вызванного длительным введением скополамина.
Изучить действие веществ на поведение и состояние мышей с генетически детерминированным ускоренным старением SAMP 10.
Исследовать влияние нооглютила на биохимические сдвиги у мышей линии SAMP 10.
Исследовать механизм антиамнестического эффекта препаратов, используя фармакологические анализаторы глутаматергической системы.
6. Изучить зависимость химического строения и антиамнестической активности в ряду новых производных адамантана.
Научная новизна исследования. Установлено, что препараты с глутаматергическим механизмом действия нооглютил, мемантин и димебон обладают способностью корректировать поведение и состояние животных с ИПГ (модель геморрагического инсульта) и у крыс с холинергическим дефицитом, вызванным длительным введением скополамина. В частности показано, что препараты ослабляют неврологические нарушения и предупреждают гибель крыс после ИПГ, улучшают процессы обучения и памяти, ослабляют состояние тревоги и страха в условиях обеих моделей нейродегенеративных состояний. По выраженности эффектов на модели ИПГ препараты располагаются в следующем порядке: нооглютил > мемантин > димебон, а на модели холинергического дефицита — нооглютил > димебон = мемантин. Особенностью действия димебона является его значительно более выраженный анксиолитический эффект.
Установлено, что у мышей с генетически детерминированным ускоренным старением (senescence-accelerated mouse prone 10, SAMP10) начиная с 4-х месячного возраста и, особенно, у 9-16-ти месячных мышей наблюдаются нарушения ориентировочно-исследовательского поведения, процессов обучения и памяти, депрессивноподобное состояние, повышенный уровень тревоги и страха.
Впервые показана эффективность нооглютила, мемантина и димебона, как препаратов ослабляющих основные нарушения поведения и состояния мышей с генетически детерминированным ускоренным старением SAMP 10. По эффективности препараты располагаются в следующем порядке: нооглютил > димебон > мемантин.
Установлено, что в механизме реализации антиамнестического эффекта нооглютила в основном участвует АМРА подтип глутаматных рецепторов, а в механизме антиамнестического действия мемантина и димебона существенную роль играет взаимодействие с АМРА и NMDA подтипами.
Впервые исследованы антиамнестические свойства новых соединений производных адамантана (АДК-2, АДК-1015, АДК-(МА-І), АДК-1033, АДК-427, АДК-971, АДК-827) в сравнении с известными препаратами этой структуры мемантином, мидантаном и кемантаном. Установлено, что в ряду изученных соединений для проявления антиамнестических свойств существенное значение имеют заместители по первому положению адамантана. Научно-практическая ценность работы:
Полученные результаты об особенностях спектра ноотропной и нейропротективной активности нооглютила, мемантина и димебона, вовлеченности глутаматных рецепторов в механизм их действия будут способствовать расширению методологии поиска неиропротекторов среди веществ с глутаматергическим механизмом действия. Выявленные в исследовании антиамнестические свойства у новых производных адамантана открывают перспективу поиска новых препаратов с ноотропной и нейропротективной активностью среди 1- производных адамантана.
Апробации работы: Результаты работы были представлены на 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006 г.), III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007 г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 4 тезисов.
Объем и структура диссертации: Диссертация содержит введение, обзор литературы, раздел с описанием материалов и методов исследования, 5-ти глав результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 44 таблицы и 38 рисунков. Библиографический указатель включает 40 отечественных и 210 иностранных источников.
- ю-
Роль глутаматергической системы в патогенезе заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией. Фармакология препаратов с глутаматергическим механизмом действия
В настоящее время есть целый ряд доказательств участия глутаматергической системы в патогенезе целого ряда заболеваний. Глутаматергическая нсиротокисность может реализовываться через все подтипы ионотропных рецепторов и метаботропные рецепторы группы I. Вклад каждого из этих подтипов в нейротоксичность глутамата зависит от рассматриваемой группы нейронов и множества других обстоятельств. Подразумевается наличие трех различных механизмов токсического действия глутамата. Первый: экзогенный глутамат и родственные соединения, действующие на рецепторы глутамата, поступают в организм с пищей и оказывают повреждающее воздействие. Второй - учасше эндогенного глутамата, выделяющегося из нейронов и участвующего в острых нейродегенеративных процессах, связанных с ишемией или травматическим повреждением мозга. Третий механизм: активация рецепторов глутамата может быть причиной клеточной гибели в хронических нейродегенеративных заболеваниях: боковой амиотрофический склероз, болезни Гентингтона, Паркинсона и Альцгеймера. Установлены последовательные стадии развития эксайтотоксичности (от англ. "excitotoxicity" - токсичность, развивающаяся при возбуждении). Феномен эксайтотоксичности учавствует в патогенезе острых и хронических нейродегенеративных расстройств (Chui D.W., 1995). В частности, процесс «острой» эксайтотоксической нейродегенерации имеет место при церебральной ишемии, инсульте, острой черепно-мозговой травме. Нейродегенерация, происходящая по механизму так называемой медленной («метаболической») эксайтотоксичности, развивается при нормальном содержании кальция, но в условиях снижения энергитического состояния клетки, а роль пускового фактора в этом случае играет нарушение АТФ производящей функции митохондрий. Следствием этого процесса является снижение активности АТФ -зависимых ферментов, и в частности, Ґ/К+-АТФаз, которые выполняют функцию поддерживания мембранного потенциала клетки.
Нарушение этой функции даже при нормальной концентрации и активности возбуждающих амикислот влечет за собой медленную деполяризацию клетки, что приводит к снятию магниевого блока у NMDA-рецепторов. Вслед за этим ионы кальция массированно проникают в нейроны, чем запускают каскад внутриклеточных нейродегенеративных реакций. Предположительно именно по такому механизму происходит гибель нейронов при болезни Альцгеймера (БА) и других медленно развивающихся нейродегенеративных процессах (Rotham S.M., et al., 1987). Известна роль глутаматергической системы в механизме повреждений мозга различного происхождения, таких как инсульты мозга, черепно-мозговые травмы (ЧМТ), хронические нейродегенеративные нарушения, деменции, СПИД и другие (McCulloch, 1992; Koroshetz, 1996; Brauner-Osborne, 2000). Ряд исследований, проведенных в последнее время, убедительно показывают, что антагнисты NMDA рецепторов всех подтипов демонстрируют нейропротективный эффект на различных экспериментальных моделях локальной и глобальной ишемии в опытах на животных. На моделях глобальной и локальной ишемий выявлен нейропротективный эффект канальных блокаторов (МК-801, мемантин), и анатагонистов полиамин-связывающего участка (ифенпродила и элипродила). Traxoprodil — антагонист NMDA второго поколения, воздействующий на рецепторы, которые содержат субъединицу NR2B, был исследован в клинических условиях в качестве эффективного лекарственного средства у пациентов с тяжелой ЧМТ (Yurkewicz L., et al., 2005). В клинических условиях, у больных с инсультом были исследованы неконкурентный блокатор каналов - аптиганель (Bleakman, 1998), конкурентный антагонист глутаматных рецепторов - сельфотель (Tarnawa, 1989), конкурентный антагонист глицинового сайта - АСЕА-1021 (О Нага, 1993) и эфенпродил - аналог элипродила (Wilding, 1995). Хотя, эти блокаторы глутаматных рецепторов защищают от эксайтотоксичности у них были выявлены нежелательные побочные эффекты, такие как индукция психотомиметических эффектов, респираторные депрессии, сердечно-сосудистые нарушения. Клинические испытания сельфотеля (Tarnawa, 1989), элипродила (Wilding, 1995) и СР-101606 (Bennett, 1995) показали меньшую выраженность побочных эффектов. В ходе клинических испытаний АСЕА-1021 - антагониста глицинового сайта (О Нага, 1993) были выявлены эффекты в виде почечной токсичности. Многие конкурентные антагонисты АМРА/КА рецепторов NBQX (Wong, 1986) и YM90K (Wong, 1986) продемонстрировали снижение зоны инфаркта у грызунов на модели глобальной и фокальной ишемии (Gill, 1992; Gill, 1994) Сходные результаты показал неконкурентный антагонист АМРА рецепторов GYKI-52466 (Monahan, 1990), который оказался активным на моделях обоих типов ишемии. Некоторыми фармацевтическими компаниями разрабатывав і ся следующее поколение антагонисты АМРА рецепторов, вещества растворимые в воде. Например, показано, что новые растворимые антагонисты АМРА рецепторов YM-872 и SPD-502 (Isaacson, 1991) проявляют нейропротективный эффект у животных на моделях локальной и глобальной ишемии (Takahashi, 1998; Nielsen, 1999; Sager, 1999). Введение фосфономитильной группы в хиноксалинедионовый скелет способствовало лучшей растворимости в воде антагониста АМРА рецепторов ZK-200775 (Zorumski, 1993), что привело к достоверному увеличению времени терапевтического окна (до 4 часов) нейропротекции после окклюзии среднемозговой артерии у крыс (Turski, 1998).
Компанией "Eli Lilly разработаны селективный модуляторы АМРА-рецепторов, LY392098 и модулятор АМРА- и NMDA-рецепторов LY404187 (Baumbarger PJ, et al., 2001). Механизм действия и эффективность LY404187, как аллостерического модулятора АМРА-рецепторов, позволяет полагать, что это соединение имеет перспективы использования в качестве средства терапии при шизофрении, так как усиливает синаптическую активность (LTP), уменьшенную при этом заболевании. Кроме того, в поведенческих экспериментах LY404187 демонстрирует антидепрессантную активность (Quirk JC, et al., 2002). Дальнейшее исследование этого соединения на моделях развития нейротоксичности у грызунов, индуцированное введением 6-OHDA или МРТР в черную субстанцию выявило его нейропротективный эффект. Обнаруженный нейротрофический механизм и способность увеличивать экспрессию GAP-43 в стриатуме позволило авторам рекомендовать его как противопаркинсонический препарат (O Neill MJ, et al., 2004). Еще один представитель этого класса (biarylpropylsulfonamides) позитивный модулятор АМРА рецепторов (GluRl-4 подтипов) LY503430, в настоящее время рассматривается как перспективное соединение в лечении болезни Паркинсона. Соединение LY503430 предупреждало развитие нейротоксичности у крыс, индуцированное введением 6-OHDA в черную субстанцию или в стриатум, так же как и нейротоксичность у мышей, индуцированную ивведением МРТР в черную субстанцию. Кроме того, LY503430 увеличивает выработку нейротрофического фактора BDNF в черной субстанции и экспрессию GAP-43 в стриатуме, что позволяет рассматривать его как потенциальное средство от болезни Паркинсона (O Neill MJ, et al., 2004). Ряд работ свидетельствуют о ключевой роли mGluRsi рецепторов в патологических механизмах, ответственных за постинсультную гибель нейронов. (Nicoletti, 1996). Селективные антагонисты mGluRi - AIDA (Ebert, 1994) и (s)-CBPG (Ebert, 1996) достоверно снижают гибель клеток in vivo после глобальной ишемии
Исследование анксиолитических и чанксиогенных свойств веществ
В качестве другого амнезирующего воздействия за 15 минут до обучения УРПИ вводили конкурентный блокатор NMDA-рецепторов МК-801 в дозах от 0,1 мг/кг до 0,25 мг/кг, затем проводили процедуру обучения УРПИ и через 24 часа воспроизводили рефлекс по схеме, описанной в пункте 2.1.1. а) В опытах на крысах был использован ПКЛ и методика оценки поведения животных согласно Pellow и соавт. (1985). Лабиринт представляет собой перекрещенные полоски размером 50x10 см. два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 40 см. Лабиринт приподнят от иола на 50 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 10x10 см. Крыс помещали на центральную площадку хвостом к открытому рукаву. Регистрировалось время, проведенное животными в открытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 мин. В качестве критерия анксиолитического действия использовали показатель времени проведенного в открытых рукавах установки. Число пересечений центральной платформы (общее число заходов в темный и светлый рукава лабиринта) использовали для оценки влияния соединений на двигательную активность крыс. б) Вариант методики для мышей.
В опытах на беспородных мышах и мышах линии SAMP10 была использована модифицированная методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) (Lister, 1987). Лабиринт представляет собой перекрещенные полоски размером 5 х 45 см. два противоположных отсека имеют вертикальные стенки высотой 30 см. Лабиринт приподнят о г пола на 30 см. В месте перекрестка плоскостей находится центральная платформа 5x5 см. Животное помещали на центральную площадку хвостом к открытому рукаву. Регистрировалось время, проведенное животными в открытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава. Общее время наблюдения для каждого животного составляло 5 мин. В качестве критерия анксиолитического действия использовали показатель времени проведенного в открытых рукавах установки. Число пересечений центральной платформы (общее число заходов в темный и светлый рукава лабиринта) использовали для оценки влияния соединений на двигательную активность мышей. Каждая группа состояла из 8-13 мышей. Исследования проводили на самцах нелинейных белых крыс (весом 180-220г.), самцах нелинейных белых мышей (весом 18-22г.) и линейных самцах мышей SAMP 10. Ориентировочно - исследовательское поведение животных оценивали в условиях методики открытого поля. Установка открытое поле для крыс представляет собой камеру размером 60x60 см.. с прозрачной крышкой. Пол камеры разделен равномерно линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 4 см. В процессе 2-х минутного пребывания крысы в открытом поле регистрировали число вставаний на задние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из квадрата в квадрат (горизонтальная двигательная активность), число заглядывают в отверстия. Суммировались все три показателя ориентировочно — исследовательского поведения в открытом поле за 3 минуты. Исследуемое вещество вводили за 20 минут до регистрации двигательной активности. Двигательную активность беспородных мышей и мышей линии SAMP 10 определяли при помощи многоканального регистратора "Opto-Varimex" (Columbus Instrument).
Животные помещались в группе по 6 животных в экспериментальную камеру типа «открытого поля» на 10 минут. Регистрация двигательной активности осуществлялась автоматически каждую минуту. Исследуемое вещество вводили животным за 30 минут до начала регистрации двигательной активности. Для анализа депримирующего действия соединений использовался тест залезания на сетку в опытах на мышах. Регистрировали количество животных, поднявшихся в течение 5 минут по проволочной сетке, натянутой под углом 60 в верхний затемненный отсек камеры. В опыте были использованы белые мыши самцы беспородные весом 20-24 г и линейные мыши самцы SAMP 10 весом 25-35г. 2.5. Исследование влияния веществ на неврологический статус животных. Исследования проводили на самцах нелинейных белых крыс (весом 180-220г.). самцах нелинейных белых мышей (весом 18-22г.) и линейных самцах мышей SAMP 10. McGrow. Неврологический дефицит у животных определяли по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганушкиной 0- Тяжесть состояния определялась по сумме соответствующих баллов. Отмечалось количество животных с легкой симптоматикой до 2,5 баллов по шкале Stroke-index (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения) и тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (от 3 до 10 баллов) - парезы конечностей, паралич нижних конечностей, боковое положение. вращающегося стержня. В опыте были использованы беспородные крысы - самцы, весом 180-220 г, беспородные мыши самцы, весом 18-24 г. и линейные мыши SAMP 10. Для оценки нарушения координации движений у животных был использован тест вращающегося стержня. На горизонтальный стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 об./мин., помещали крыс. Неспособность животных удерживать равновесие на стержне в течение 2-х минут рассматривали как проявление нарушения координации движений (Dunham, Miya, 1957; Т.А.Воронина и соавт., 1982).
Определение содержания моноаминов и аминокислот в мозге животных
Биохимические опыты были проведены на самцах мышей линии SAMP 10 массой тела 30-36 г, содержавшихся до начала исследований в условиях лабораторного вивария при 12-ти часовом световом (с 8 до 20 часов) режиме со свободным доступом к воде и к стандартному корму по 10 особей в клетке. Исследования выполнены в периоды март-апрель со временем проведения опытов с 1000 до 1400 часов. Нооглютил в дозе 5 мг/кг водили внутрибрюшинно в течение 5 дней. Последняя инъекция была сделана за 30 минут до начала эксперимента. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга животных (фронтальная кора, гипоталамус, стриатум, гиппокамп) проводили методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией Животное декапетировалось. На льду извлекались структуры мозга, которые сразу же после извлечения подвергались замораживанию жидким азотом и взвешиванию. Выделенные структуры мозга размельчали в ручном гомогенизаторе в 20 объемах 0,1 н НСЮ4 с добавлением в качестве внутреннего стандарта диоксибензиламина (ДОБА) в количестве 0.5 нмоль/мл. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость в количестве 20 мкл филырата наносили на аналитическую колонку Ultrasphera С is, методом прямой инъекции. НА (норадреналин), ДОФУК (3,4 диоксифенилуксусная кислота), ДА (дофамин), ГВК (гомованилиновая кислота), 5-ОИУК (5-оксииндолуксусная кислота) и 5-ОТ (серогонин, 5-окситриптамин) разделяли на термостатируемой при 25С колонке с использованием в качестве подвижной фазы 0,1 М цитратно-фосфатного буфера, содержащего 0.3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 9% ацетонитрила (рН 3,0). Определение моноаминов и их метаболитов осуществляли на стеклоуглеродном электроде при потенциале +0,85 В против Ag/AgCl электрода сравнения. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,7 мл/мин (И.И.Мирошниченко, 1988; В.С.Кудрин и соавт., 1988). Определение содержание аминокислот (Glu - глутамат, Asp - аспартат. Таи - таурин, Gly - глицин, GABA - гамма-аминомасляная кислота) проводили методом ВЭЖХ/ФД на хроматографе Agilent 1100, США) с аналитической колонкой HYPERSIL ODS, 4,6 х 250 мм, 5 мкм (длина волны возбуждения - 230 нм, длина волны испускания - 392 нм). Целью настоящего раздела явилось сравнительное изучение нейропротективных свойств нооглютила, мемантнна и димебона на модели ннтрацеребральной посттравматической гематомы (ИПГ), геморрагического инсульта (ГИ). Для моделирования ннтрацеребральной посттравматической гематомы, геморрагического инсульта у крыс наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б) проводили трепанацию черепа и осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы (координаты Н=4 мм, L=3.0 мм, А=1,5 мм от брегмы) по атласу G. Paxinos с последующим введением в место повреждения крови, взятой из-под языка.
Ложнооперированным животным под наркозом проводилось скальпирование и трепанация черепа. Все вещества вводили внутрибрюшшшо (в/б). Первая инъекция исследуемых веществ была сделана через 3 — 3,5 часа после операции. Нооглютил, мемантин и димебон вводили в течение 3 дней однократно. Через 24 часа регистрировалась гибель животных, неврологический дефицит, ориентировочно - исследовательское поведение в открытом поле, уровень тревоги в ПКЛ, степень изменения когнитивных функций в методике обучения УРПИ. Динамику развития нарушений, вызванных гюеттравматической гематомой и влияние исследуемых веществ на поведение и состояние крыс наблюдали в течение 14 суток после операции с регистрацией показателей поведения на 1-, 3-, 7- и 14-е сутки после операции. Неврологический дефицит у животных определяли по шкале Stroke-index McGrow в модификации (И.В. Ганнушкина, 1977). Отмечали количество крыс с легкой симптоматикой (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения) и с тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (парезы и параличи 1-4 конечностей). Животные были разделены на несколько групп (по 20 крыс в каждой): ложнооперированные животные (I группа); группа животных с ГИ (II группа); крысы с ГИ, получавшие нооглютил 10 мг/кг/3 дня (III группа); крысы с ГИ, получавшие мемантин 1 мг/кг/3 дня (IV группа);, крысы с ГИ, получавшие димебон 0,1 мг/кг/3 дня (V группа). При изучении динамики неврологического дефицита у всех групп крыс с ГИ показано, что на 1-е сутки после операции у 70-75% животных отмечались неврологические нарушения различной степени тяжести. К 3-м суткам этот показатель для контрольных групп с ГИ снизился незначительно, при этом количество животных с нарушениями тяжелой степени, проявляющимися в виде парезов и параличей конечностей, составило до 37%. К 14-ым суткам почти все животные с тяжелыми проявлениями неврологического дефицита погибли, а у половины из оставшихся в живых крыс (50%) отмечалась легкая неврологическая симптоматика (табл. 3.1.1). Нооглютил в дозе 10 мг/кг почти полностью предотвращал развитие тяжелых неврологических нарушений и значительно уменьшал легкие (табл. З.1.1.). В группе животных ГИ+Мемантин начиная с 3 - го дня после операции не отмечалось крыс с тяжелой неврологической симптоматикой и сократилось до 20% количество крыс с легкими неврологическими нарушениями. Димебон незначительно снижал процент животных с легкой и тяжелой симптоматикой (табл. 3.1.1.) в течение всего времени наблюдения.
Исследование ориентировочно-исследовательского поведения и двигательной активности мышей SAMP 10
Изучение поведения мышей в тесте «залезание на сетку» показало, что в сравнении с беспородными мышами у животных линии SAMP 10 всех исследуемых возрастных групп отмечались нарушения поведения, регистрируемые по увеличению количества животных, не поднявшихся на сетку. Вместе с тем, у мышей 3-11 мес. эти нарушения были незначительны, в то время как в группе 16-ти месячных мышей количество не поднявшихся на сетку животных увеличилось в 2,3 раза (Р 0,05) по сравнению с 3-х месячными животными и составило 85 % (табл. 5.1.2.1.). Изучение поведения мышей с ускоренным типом старения (SAMP 10) в открытом поле показало, что в сравнении с 3-х месячными беспородными животными у мышей того же возраста линии SAMP10 не наблюдалось изменения ориентировочно-исследовательской активности в отрытом иоле. У SAMP10 8-ми месячного возраста ослабление ориентировочно-исследовательского поведения можно определить только по уменьшению суммарных показателей двигательной активности. У 9-ти, 10-ти 12-ти и, особенно, у 16-ти месячных мышей отмечались изменения по всем показателям поведения: Это выражалось в статистически достоверном уменьшении обследований отверстий, уменьшении горизонтальной и вертикальной двигательной активности (табл. 5.1.2.2.). Статистически достоверно уменьшалась и общая двигательная активность (суммарные показатели). Стьюдента). Исследования двигательной активности группы мышей линии SAMP 10 проводилось в установке Опто-Варимекс. Показано, что уровень двигательной активности у мышей в 3-х месячном возрасте составлял 23031 движений за 10-ти минутный интервал. У 12-ти месячных животных этот показатель снижался до 21295 движений, а у 16-ти месячных - до 18210 движений (рис. 5.1.2.2.). Изучение угашения ориентировочно-исследовательской активности, так называемого негативного обучения или привыкания, когда у животных ослабевает реакция на новизну и постепенно уменьшается двигательная активность показало, что у мышей линии SAMP 10 в возрасте 12-ти, и особенно, 16-ти месяцев к 10-й минуте наблюдения регистрируется замедление угашения двигательной активности. Это свидетельствует о том, что у мышей SAMP 10 развивается дефицит ассоциативного обучения (рис. 5.1.2.3.) совершенных мышами за определенный отрезок времени, в абсолоютных показателях. 160 140 120 100 60 20 SAMP10(3 мес.) -SAMP10 (12 мес.) SAMP10 (16 мес.) При регистрации поведения животных в условиях методики ПКЛ показано, что у беспородных мышей и мышей линии SAMP10 не наблюдалось различий поведения в ПКЛ.
Вместе с тем, начиная с 8-ми месячного возраста, у всех возрастных групп мышей (8, 9, 12 и 16 мес.) наблюдалось значительное (Р 0,05) уменьшение основного показателя поведения - времени, проведенном животными в открытых рукавах лабиринта. Значительно уменьшалось число заходов в светлые рукава лабиринта и общее количество посещений открытых и закрытых рукавов (табл. 5.1.3.1.). При этом в десятки раз увеличилось латентное время рефлекса захода в один из рукавов. Подобное поведение животных в условиях ПКЛ свидетельствует о значительно более высоком уровне тревожности у мышей в 8-ми, 9-ти, 11 -ти, 12-, 16-ти месячного возраста в сравнении с 3-х месячными животными (рис. 5.1.2.1.). Хотя, следует отметить, что, по-видимому, на анксиогенный эффект накладывается общая заторможенность у мышей SAMP 10, которая выявлена в открытом поле. # вынужденного плавания (по Порсолту) При исследовании поведения мышей в тесте вынужденного плавания (по Порсолту) было показано, что время иммобилизации у беспородных животных в 3-х месячном возрасте составляет 120,5 секунд за 6 минут наблюдения, а у мышей SAMP 10 того же возраста этот показатель лишь незначительно превышен и составляет 159,18 секунд (табл. 5.1.4.1.). С увеличением возраста мышей SAMP 10 статистически достоверно повышается время пребывания животных в «застывшей» позе, и к 16-ти месячному возрасту этот показатель достигает 230,23 секунд (Р 0,05) (рис. 5.1.4.1.). Это свидетельствует о развитии депрессивноподобного поведения у мышей SAMP 10.
Похожие диссертации на Изучение ноотропной и нейропротективной активности веществ, воздействующих на глутаматергическую систему
