Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Система «награды» головного мозга 13
1.2 Подкрепляющий эффект кокаина: нейробиология и нейрофармакология 17
1.3 Половые различия в злоупотреблении кокаином 19
1.3.1 Данные клинических исследований 19
1.3.2 Данные экспериментальных работ 21
1.4 Роль женских половых гормонов в жизнедеятельности организма... 25
1.4.1 Синтез эстрогенов 26
1.4.2 Метаболизм эстрогенов 28
1.5 Эффекты эстрогенов в центральной нервной системе 29
1.5.1 Внутриклеточные рецепторы эстрогенов 31
1.5.2 Мембранные рецепторы эстрогенов 33
1.5.3 Геномный механизм действия эстрогенов 34
1.5.4 Негеномынй механизм действия эстрогенов 36
1.5.5 Влияние эстрогенов на дофаминэргическую систему мозга 37
1.6 Половые различия в фармакокинетике кокаина 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1 Экспериментальные животные и условия их содержания 43
2.2 Вещества 43
2.3 Цитологический метод определения стадии эстрального цикла у самок крыс и мышей 44
2.4 Хирургические манипуляции 45
2.4.1 Овариоэктомия у самок крыс 45
2.4.2 Овариоэктомия самок мышей 46
2.4.3 Внутримозговая имплантация электродов у крыс 46
2.5 Выработка реакции внутривенного самовведения у мышей 47
2.6 Процедура внутримозговои самостимуляции системы «награды» 48
2.7 Оценка двигательной активности в беговом колесе, как модель подкрепляемого поведения 50
2.8 Оценка двигательной активности в экспериментальных боксах для автоматической регистрации локомоторной активности (актометре), как модель неподкрепляемого поведения 51
2.9 Измерение уровня эстрадиола в плазме крови 51
2.10 Измерение уровня экспрессии генов в тромбоцитах крови самок крыс 52
2.11 Методы статистической обработки результатов 55
ГЛАВА 3. Изменение порогов реакции самостимуляции мозга самками крыс в разные фазы эстрального цикла, а также под влиянием эстрадиола и его сочетания с кокаином 56
3.1 Пороги самостимуляции в разные фазы эстрального цикла 56
3.2 Изменение порога реакции самостимуляции под влиянием эстрадиола 58
3.3 Влияние кокаина на реакцию самостимуляции у овариоэктомированных крыс после введения эстрадиола 60
3.4 Обсуждение результатов 63
ГЛАВА 4. Влияние эстрального цикла и эстрадиола на двигательную активность, обладающую и не обладающую собственными подкрепляющими свойствами, у самок крыс 72
4.1 Влияние эстрального цикла на двигательную активность, обладающую собственными подкрепляющими свойствами (бег в
колесе) 72
4.2 Влияние овариоэктомии на обучение бегу в колесе 73
4.3 Влияние овариоэктомии на активность самок, обучившихся бегу в колесе 74
4.4 Влияние эстрадиола на активность овариэктомированных самок крыс в беговом колесе 76
4.5 Влияние эстрального цикла крыс на двигательную активность в актометре 77
4.6 Влияние эстрадиола на двигательную активность овариэктомированных крыс в актометре 78
4.7 Обсуждение результатов 79
ГЛАВА 5. Влияние овариэктомии и эстрадиола на первично-подкрепляющий эффект кокаина 84
5.1 Влияние эстрадиола на инициацию внутривенного самовведения кокаина у мышей 84
5.2 Влияние селективных агонистов а- и в- эстрогеновых рецепторов на внутривенное самовведение кокаина у мышей 87
5.3 Обсуждение результатов 89
ГЛАВА 6. Измерение концентраций эстрадиола в плазме крови у самок крыс 93
6.1 Результаты 93
6.2 Обсуждение результатов 94
ГЛАВА 7. Исследование экспрессии генов эстрогеновых рецепторов и транспортеров моноаминов 96
7.1 Экспрессия гена альфа-эстрадиолового рецептора у интактных иовариоэктомированных самок крыс с различными режимами введения эстрадиола 97
7.2 Экспрессия гена бета-эстрадиолового рецептора у интактных и овариоэктомированных самок крыс с различными режимами введения эстрадиола 98
7.3 Экспрессия гена серотонинового транспортера у интактных и овариоэктомированных самок крыс с различными режимами введения эстрадиола 99
7.4 Экспрессия гена дофаминового транспортера у интактных и овариоэктомированных самок крыс с различными режимами введения эстрадиола 100
7.3 Обсуждение результатов 101
Заключение 107
Выводы 115
Научно-практические рекомендации 116
Список литературы 117
- Подкрепляющий эффект кокаина: нейробиология и нейрофармакология
- Цитологический метод определения стадии эстрального цикла у самок крыс и мышей
- Оценка двигательной активности в экспериментальных боксах для автоматической регистрации локомоторной активности (актометре), как модель неподкрепляемого поведения
- Влияние овариоэктомии на активность самок, обучившихся бегу в колесе
Введение к работе
За последнее десятилетие накоплен большой экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий о существовании половых различий в эффектах психоактивных веществ (ПАВ), в частности психостимуляторов. Показано, что женщины реагируют на эффекты психостимуляторов иначе, чем мужчины и оказываются более восприимчивы к наркогенному потенциалу этих веществ (Van Etten and Anthony, 1999). Следует отметить, что исследования, посвященные этой проблеме, появились сравнительно недавно. Ранее женщин редко включали в психофармакологические исследования, по причине возможного влияния менструального цикла на изучаемые эффекты (Yonkers and Harrison, 1993).
Согласно эпидемиологическим оценкам в США, зависимость к кокаину у женщин в течение первых 24 месяцев после первого употребления наркотика вырабатывается с вероятностью, большей в 3-4 раза по сравнению с мужчинами (O'Brien and Anthony, 2005), несмотря на то, что общее количество ежедневно потребляемого наркотика не различается между полами (Kosten, Kosten et al., 1996). У женщин с зависимостью от кокаина в большей степени по сравнению с мужчинами выражено поведение поиска наркотика при предъявлении стимулов, ассоциированных с употреблением кокаина (Robbins, Ehrman et al., 1999), а также отмечается наиболее тяжелая симптоматика в развитии амфетаминовой зависимости (Holdcraft and Iacono, 2004).
Показано, что выраженность поведенческих эффектов ПАВ зависит от стадии полового цикла, а также изменяется при введении экзогенных женских половых гормонов. Поэтому ведущая роль в возникновении наблюдаемых половых различий отводится половым гормонам, в основном эстрадиолу (Becker and Ни, 2008;Lynch, 2007). В ряде исследований показано, что субъективные эффекты кокаина более выражены у женщин в фолликулярную стадию цикла по сравнению с лютеалыюй, что коррелирует с уровнем
8 эндогенного эстрадиола (Evans, Haney et al., 2002;Lukas, Sholar et al., 1996;Sofiioglu, Dudish-Poulsen et al., 1999). Такая же зависимость наблюдается и при введении амфетамина (Justice and de Wit, 1999;Justice and de Wit, 2000;White, Justice et al.,"2002).
В экспериментальных исследованиях на животных также продемонстрировано влияние половых гормонов на поведенческие эффекты психостимуляторов. В ряде работ отмечается, что именно эстрадиол оказывает наибольшее влияние на выраженность этих эффектов. Так, эстрадиол увеличивает чувствительность овариоэктомированных самок крыс к кокаину в экспериментах по внутривенному самовведению наркотика (Lynch, 2007) и спосособствует развитию поведенческой сенситизации к психостимуляторам (Ни and Becker, 2003).
Показано, что выявленные половые различия в эффекте кокаина, а так же изменение его активности, связанное с введением эстрадиола, не могут быть объяснены возможным изменением его фармакокинетики в организме под действием стероидных гормонов (Bowman, Vaughan et al., 1999).
Основным субстратом действия ПАВ является система «награды» головного мозга (ГМ) (Wise, 2002). Можно предположить, что усиление эффектов кокаина при введении эстрадиола происходит на уровне дофаминергических проекций «системы награды» ГМ, о чем свидетельствует способность эстрадиола изменять нейротрансмиссию дофамина в ГМ (Becker and Ни, 2008). Однако, до сих это предположение так и не получило подтверждение в экспериментах по реакции электрической самостимуляции мозга, единственной методике, позволяющей непосредственно оценивать поведенческие эффекты исследуемых веществ на систему «награды». Более того, в последних работах, проведенных в этой области некоторыми авторами категорически опровергалась возможность индукции эстрадиолом поведенчески-значимых изменений в системе «награды» ГМ (Stratmann and Craft, 1997;Bless, McGinnis et al, 1997).
Механизмы, которые лежат в основе влияния эстрадиола на поведенческие эффекты психостимуляторов, до сих пор остаются невыясненными. Вместе с тем, понимание причин, ведущих к возникновению половых различий в эффектах ПАВ, важно для оптимизации стратегии профилактики и лечения аддиктивных расстройств. В данной работе был проведен экспериментальный анализ влияния эстрадиола на поведенческие эффекты кокаина с применением различных методических подходов.
Настоящая работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Разработка эффективных методов и средств профилактики, диагностики и лечения наркологических заболеваний на основе медико-биологических, клинических и медико-социальных исследований» (тема: «Изыскание и изучение средств фармакотерапии наркотоксикоманий и алкоголизма в ряду веществ, влияющих на ионные каналы и неирональные рецепторы»).
Цель исследования.
Экспериментальное изучение эстроген-зависимых изменений функции мозговой системы «награды» и подкрепляющего эффекта кокаина.
Основные задачи исследования.
Оценить функцию системы «награды» по показателям реакции электрической само стимуляции мозга (РЭСМ) в разные периоды эстрального цикла, а также после введения эстрадиола овариэктомированным (ОВЭ) самкам крыс.
Исследовать различные виды двигательной активности, обладающие и не обладающие собственными подкрепляющими свойствами, в разные периоды эстрального цикла, а также после введения эстрадиола ОВЭ самкам крыс.
Изучить влияние эстрадиола на подкрепляющий эффект кокаина на модели инициации внутривенного самовведения (ВВС) данного ПАВ у ОВЭ самок мышей.
Сравнить роль эстрогеновых рецепторов аир подтипов (а-ЭР и (3-ЭР) в модулирующем влиянии эстрадиола на поведенческие эффекты кокаина.
Оценить влияние эстрадиола на экспрессию мРНК а-ЭР и Р-ЭР, дофаминового транспортера (ДАТ) и серотонинового транспортера (СЕРТ) в тромбоцитах периферической крови.
Научная новизна.
В работе впервые показано, что:
У ОВЭ самок крыс эстрадиол (5 мкг/животное, подкожно, 2 дня введения) вызывает медленно развивающееся повышение чувствительности системы «награды» со снижением порогов РЭСМ через двое суток после введения эстрадиола с максимумом на 4-ый день.
На фоне сенситизации системы «награды» эстрадиолом кокаин (5 мг/кг, внутрибрюшинно) вызывает быстро развивающееся дальнейшее снижение порога РЭСМ, причем взаимодействие двух веществ носит аддитивный характер.
Эстрадиол повышает специфическую двигательную активность, обладающую собственными подкрепляющими свойствами (модель «бег в колесе»), но не оказывает влияния на двигательную активность лишенную собственных подкрепляющих эффектов (перемещения в актометре).
Положительно-подкрепляющий эффект кокаина у ОВЭ самок мышей усиливается после предварительного введения эстрадиола, а также селективного агониста Р-ЭР DPN.
Предложена гипотеза о том, что пермиссивное влияние эстрогенов на подкрепляющий эффект кокаина реализуется на уровне системы «награды» ГМ преимущественно через р-ЭР посредством геномных механизмов.
Научно-практическое значение работы.
Теоретическое значение выполненной работы состоит в том, что ее результаты служат основой для понимания и дальнейшего углубленного изучения механизма половых отличий в подкрепляющих свойствах психостимуляторов и других ПАВ и разработке на этой основе оптимальных стратегий лечения и профилактики аддиктивных расстройств.
Практическое значение исследования состоит в том, что на основе данных о разделении функциональной роли а-ЭР и Р-ЭР в реализации подкрепляющего действия кокаина определено новое направление изыскания потенциальных терапевтических средств для лечения наркотоксикоманий.
Положения, выносимые на защиту.
Эстрогены сенсибилизируют систему «награды» мозга и усиливают «гедонический» эффект кокаина на модели электрической самостимуляции головного мозга.
Эстрогены усиливают первично-подкрепляющие свойства фармакологических (кокаин) и нефармакологических (двигательная активность, обладающая собственным подкрепляющим эффектом, «награждающие» свойства электрической стимуляции вентральной покрышки мозга) стимулов.
Усиление первично-подкрепляющих свойств кокаина эстрадиолом опосредуется р-эстрогеновыми рецепторами.
Пермиссивный эффект эстрадиола в отношении поведения, подкрепляемого фармакологическими и нефармакологическими стимулами, является отсроченным (на 48-72 часа) и не коррелирует с максимумом концентрации эстрадиола в плазме, что косвенно свидетельствует о геномной природе данного эффекта.
12 5. Эстроген-зависимость подкрепляющих и «гедонических» эффектов психоактивных веществ (на примере кокаина) является важной составляющей факторов риска аддиктивных расстройств, ассоциированных с полом.
Реализация результатов исследования.
Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы кафедры фармакологии и НИЦ СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на международной ежегодной конференции Европейского Общества Нейропсихофармакологии (Ницца, Франция, 2008), на П-м Международном Молодежном Медицинском Конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург, Россия, 2008), на NIDA International Forum 2008 (Пуэрто-Рико, Сан Хуан, 2008).
По результатам исследования опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 137 страницах и состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 17 таблицами и 19 рисунками.
Литературный указатель содержит ссылки на 225 научных публикаций.
Подкрепляющий эффект кокаина: нейробиология и нейрофармакология
Кокаин является сильным стимулятором центральной нервной системы (ЦНС), алкалоид которого впервые выделил из листьев Erythroxylon coca A.Nieman в 1859 году. В медицинских целях как средство местной анестезии и для лечения «меланхолии» кокаин начали применять после опубликования в 1879 г. знаменитой статьи В.К. фон Анрепа1. В 1884 году Фрейд описывал кокаин как стимулятор ЦНС и рекомендовал применять его для лечения различных недомоганий. Изначально считали, что это идеальное лекарство без побочных эффектов, но широкое использование кокаина в конце XIX начале XX веков выявило его токсические и аддиктивные свойства (Фридман, Флеминг и др., 1998). Кокаин повышает общую двигательную активность и возбудимость организма, вызывает чувство приподнятого настроения, эмоционального комфорта, эйфорию, и повышенную сексуальную рецептивность. Прием избыточных доз характеризуется тремором, судорогами и повышением температуры тела. Одновременно с поведенческим возбуждением повышается тонус симпатической нервной системы, сопровождающийся тахикардией, гипертензией, на фоне которых возможны возникновения миокардиальных инфарктов и цереброваскулярных геморрагии. По мере того, как эффекты наркотика утихают, больные начинают испытывать дисфорию, усталость, раздражительность и подавленность настроения, что может привести к повторному употреблению кокаина (World Health Organization, 2004). Механизм действия кокаина хорошо изучен. Он, как и другие родственные стимуляторы ЦНС, повышает уровни дофамина, норадреналина и серотонина в синаптической щели за счет связывания их переносчика и подавления переноса медиаторов из межклеточного пространства внутрь клетки (Piatt, Rowlett et al., 2002;Stitzer and Walsh, 1997).
Кокаин также блокирует фермент моноаминоксидазу, который катаболизирует дофамин и нарадреналин. В результате этого, после деполяризации нервных волокон внесинаптические концентрации дофамина и норадреналина остаются высокими, что приводит к длительной активации симпатической нервной системы. Это способствует развитию острых эффектов препарата, таких как повышение артериального давления, тахикардия, периферическая вазоконстрикция, гипергликемия, стимуляция мозговой деятельности, повышение основного обмена и другие. Хроническое применение кокаина изменяет чувствительность сигнальных механизмов трансдукции дофамина. Это может привести к развитию толерантности и синдрома отмены, и, в конечном итоге, являться причиной острых поведенческих и психологических эффектов кокаина (Катцунг, 2008). Кокаин обладает мощным аддитивным потенциалом, что хорошо воспроизводится в экспериментальных условиях. Было показано, что животные постоянно нажимают на педаль для получения вещества, причем крысы предпочитают кокаин пище и воде, продолжая нажимать на педаль до получения летальной дозы (McBride, Murphy et al., 1999). При применении кокаина совместно с нсфармакологическими стимулами возможно выработать условный рефлекс, причем со временем условный раздражитель вызывает такую же реакцию, как и введение препарата (Shippenberg, LeFevour et al., 1998). Одним из факторов, влияющих на характер злоупотребления кокаином, является пол (Griffin, Weiss et al., 1989). Согласно эпидемиологическим оценкам в США, у женщин с вероятностью большей в 3-4 раза по сравнению с мужчинами вырабатывается зависимость к кокаину в течение первых 24 месяцев после первого употребления наркотика (O Brien and Anthony, 2005;Van Etten and Anthony, 1999), хотя общее количество ежедневно потребляемого наркотика не различается между полами (Kosten, Kosten et al., 1996).
У женщин быстрее вырабатывается зависимость также и к ряду других ПАВ: алкоголю, никотину, каннабиноидам, кофеину, опиатам, фенциклидину, седативным препаратам (Westermeyer and Boedicker, 2000). У женщин, со сформированной зависимостью к ПАВ, в большей степени по сравнению с мужчинами запускается поведение поиска наркотика при предъявлении стимулов, ассоциированных с употреблением наркотика (Robbins, Ehrman et al., 1999), а также отмечается наиболее тяжелая симптоматика в развитии зависимости (Holdcraft and Iacono, 2004). Для женщин также характерна более высокая степень рецидивирования в результате стрессов или депрессии (Rubin, Stout et al., 1996). Основная роль в возникновении различий отводится половым гормонам.
В недавно опубликованных обзорах Terner and de Wit (2006) и Evans S.M. (2007) проведен тщательный анализ исследований, в которых оценивалось влияние стадии менструального цикла на субъективные и поведенческие эффекты ПАВ. В большинстве исследований не было отмечено существенного влияния стадии менструального цикла на поведенческие и физиологические эффекты алкоголя, кофеина, бензодиазепинов, марихуаны или опиоидов; гораздо большее влияние менструальный цикл имеет на эффекты никотина и психостимуляторов (амфетамина и кокаина) (Terner and de Wit, 2006). Так, в ряде работ отмечается, что синдром отмены никотина выражен сильнее в лютеальную фазу цикла (на фоне увеличивающегося уровня прогестерона и относительно низкого уровня эстрадиола) по сравнению с фолликулярной стадией (на фоне градуально увеличивающегося уровня эстрадиола и минимального уровня прогестерона) (Carpenter, Upadhyaya et al., 2006). В большинстве исследований показано, что субъективные эффекты амфетамина более выражены у женщин в фолликулярную стадию цикла по сравнению с лютеальной стадией (Justice and de Wit, 1999;Justice and de Wit, 2000;White, Justice et al., 2002). Точно такие же корреляции наблюдаются и для кокаина, независимо от способа его введения (Evans, Haney et al., 2002;Lukas, Sholar et al., 1996;Sofuoglu, Dudish-Poulsen et al., 1999). Тем не менее, убедительно продемонстрировать преимущественное влияние эстрогенов на эффекты психостимуляторов в клинических экспериментах с введением экзогенного эстрадиола оказалось невозможным (Justice and de Wit, 2000), а ряд исследователей склоняются к мысли, что не столько само присутствие эстрогенов в фолликулярную стадию цикла, сколько отсутствие гестагенов может усиливать субъективные эффекты психостимуляторов (Terner and de Wit, 2006). Так, введение экзогенного прогестерона в фолликулярную фазу цикла,
Цитологический метод определения стадии эстрального цикла у самок крыс и мышей
Для определения стадии астрального цикла после проведения экспериментальных сессий у самок крыс брали влагалищные мазки. Мазки окрашивали метиленовым синим и затем с помощью микроскопа анализировали их клеточный состав. Стадию цикла определяли по пропорции клеток того или иного типа (рис 2.1). Стадия проэструса характеризуется преобладанием в составе влагалищного мазка клеток с хорошо различимыми ядрами, в эструсе наблюдается большое количество ороговевших безъядерных клеток, стадия метэструса (или диэструс 1) характеризуется преобладанием лейкоцитов и наличием небольшого количества клеток с ядрами и ороговевших клеток, в диэструсе (или диэструс 2) в составе влагалищного мазка присутствуют лейкоциты (Freeman, 1988). В эксперимент отбирали самок, у которых наблюдали стабильный четырехдневный эстральный цикл. Операцию проводили с использованием ингаляционного наркоза галотаном. Для удаления яичников производили парные дорсальные разрезы (1 см), после чего накладывали тугие лигатуры на фаллопиевы трубы и кровеносный сосуд под яичником. Яичники удаляли с прилегающей жировой тканью. Разрезы зашивали и обрабатывали антисептическими средствами. После операции животных содержали в индивидуальных клетках в течение 3-х недель (время, необходимое, для максимального снижения уровня циркулирующих гормонов). Для предотвращения послеоперационных болей и инфицирования крысы получали инъекции анальгина (100 мг/кг) с гентамицином (8 мг/кг) в течение трех дней после операции. Отсутствие эстрального цикла у самок подтверждали анализом влагалищных мазков в течение 4-х дней до начала эксперимента. Животных наркотизировали путем внутрибрюшинного введения кетамина (2,5% раствор, 0,1 мл на животное) и ксилозина (0,5% раствор, 0,05 мл на животное). Овариоэктомию осуществляли через два дорсальных разреза (0,5 см). Разрезы зашивали и обрабатывали антисептическими средствами.
Период восстановление после операции продолжался 3 недели. Животных содержали в клетках по 12 особей. Животных наркотизировали путем внутрибрюшинного введения кетамина (5% раствор, 90 мг/кг) и ксилозина (2% раствор, 10 мг/кг). Глубину наркоза определяли по подошвенному и роговичному рефлексам. На затылочной и теменной областях головы сбривали шерсть и удаляли лоскут кожи размером 1 1 см, обнажая поверхность черепной коробки. Голову животного фиксировали в стереотаксической установке. С обнаженных черепных костей удаляли фасции и надкостницу и ввинчивали 3 крепежных винта из нержавеющей стали. Место введения электрода определяли относительно точки пересечения фронтопариетального и сагиттального швов (брегма) в соответствие с атласом стереотаксических координат (Paxinos and Watson, 1986). После того, как электрод устанавливали в точку введения (координаты вентральной тегментальной области относительно брегмы: саггитальная ось -4.8 мм, горизонтальная ось 0.8 мм справа или слева от саггитального шва, вертикальная ось 8.2 мм вглубь от поверхности черепа), в черепе крысы просверливали отверстие и электрод медленно погружали на заданную глубину. Операцию завершали покрытием обнаженной поверхности черепа зубным цементом, в котором надежно крепили электрод. После высыхания на слой цемента наносили стоматологическую пластмассу, формируя «шапочку». На поверхности оставляли лишь пластиковую резьбу электрода для навинчивания в дальнейшем провода от электростимулятора.
После высыхания пластмассы крысу освобождали от фиксации в стереотаксической установке и помещали в отдельную клетку на крупные опилки в теплое место. В послеоперационном периоде животное осматривали дважды в день. Для предотвращения послеоперационных болей делали инъекции анальгина (100 мг/кг) в течение двух дней; для профилактики послеоперационных осложнений вводили антибиотики (гентамицин, 8 мг/кг, 3 дня). Экспериментальные процедуры начинали спустя 7 дней после операции. По окончании эксперимента животных умерщвляли, извлекали у них головной мозг и фиксировали в парафине. Точность локализации электрода в вентральной покрышке определяли путем исследования срезов, полученных на микротоме .
Оценка двигательной активности в экспериментальных боксах для автоматической регистрации локомоторной активности (актометре), как модель неподкрепляемого поведения
Локомоторную активность изучали в пяти прозрачных пластиковых боксах (36 25 33 см), помещенных в звуко- и светоизоляционный контейнер. Искусственное освещение внутри контейнера составляло 30 люкс, кроме того, создавался постоянный нейтральный шум с помощью работающего вентилятора. Каждый бокс был оснащен инфракрасными датчиками, регистрирующими движения крысы. 3 датчика для регистрации горизонтальной активности были расположены на высоте 3 см от пола. 8 датчиков служили для регистрации вертикальной активности (вставание на задние лапы) и были расположены на высоте 13 см от пола. Животных тестировали ежедневно, длительность сессии составляла 30 мин. Данные регистрировались с помощью компьютера, оснащенного интерфейсом MED-PC. Горизонтальную активность животных рассчитывали в виде амбуляций (количество пересеченных животным квадратов, на которые была поделена площадь бокса горизонтальными датчиками). Считалось, что животное переместилось из одного квадрата в другой, если оно пересекло 2 луча от разных датчиков. Вертикальную активность рассчитывали как общее количество пересеченных лучей от датчиков вертикальной активности. Кровь для анализа (1 мл) забирали путем отрезания кончика хвоста под кратковременным фторотановым наркозом. Хранение материала осуществляли при температуре -20С. Содержание эстрадиола в сыворотке крови определяли с помощью гормональных тест-наборов для твердофазного иммуноферментного анализа in vitro у человека (Хема-Медика, Италия-Россия) согласно прилагаемой инструкции, но с предварительной раститровкой всех наборов и подбором оптимального стандарта разведения для каждого набора. Подсчет результатов производился автоматически с помощью многоканального плашечного спектрофотометра АИФ-Ц-01С (Россия) при длине волны 450 нм.
Взятие периферической крови и выделение фракции тромбоцитов Взятие периферической крови проводили между 11 и 13 ч дня из хвостовой вены на фоне кратковременного наркоза фторотаном. Кровь в количестве 1 мл собирали в пробирки объемом 2 мл, содержащие по 100 мкл антикоагулянта (0,1 М водный раствор ЭДТА). После взятия образец перемешивали путем переворачивания и хранили при комнатной температуре до начала фракционирования (до 1,5 ч). Образец периферической крови подвергали первичному осаждению в центрифуге Eppendorf Mini-Spin (Германия) при 1200 об./мин. (15С) в течение 6 мин. Верхнюю фракцию плазмы, содержащую тромбоциты, переносили в другую пробирку, не касаясь интерфазного слоя, содержащего лейкоциты. К осадку крови добавляли по 0,5 мл стерильного физиологического раствора (рН 6-7) производства фирмы Braun (Германия) и перемешивали образец путем переворачивания. Затем пробы подвергали дополнительному осаждению при 1200 об./мин. в течение 4 мин. Супернатанты объединяли с предыдущими аликвотами тромбоцитов и центрифугировали при 6000 об./мин. в течение 5 мин. Супернатанты тщательно отбирали и отбрасывали, а осадки ресуспендировали в 0,6 мл раствора ТЕ (Трис-ЭДТА) и центрифугировали при 6000 об./мин. в течение 4 мин. К полученным осадкам после удаления супернатанта добавляли по 0,1 мл раствора ТЕ, ресуспендировали на вортексе и добавляли по 400 мкл прогретого до 30С лизирующего раствора, содержащего гуанидин-тиоцианат. Хранение лизатов осуществляли при -20С. Выделение нуклеиновых кислот и обратная транскрипция РНК Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью сорбентного метода, с применением набора реагентов «Рибосорб» производства фирмы «Амплисенс». При этом во все пробы вносили сорбент на основе силикагеля из набора «Рибосорб» и инкубировали при комнатной температуре с периодическим встряхиванием в течение 10 мин. Затем проводили двукратную отмывку сорбента путем ресуспендирования в 500 мл отмывочного раствора (буфер низкой ионной силы, содержащий 50% этанола) и центрифугирования при 6000 об./мин в течение 30 с в центрифуге MiniSpin (Германия).
Затем осадки отмывали однократно путем центрифугирования в ацетоне (500 мкл), высушивали полученные осадки сорбента при 55оС 5-10 мин. и ресуспендировали в бидистиллированной воде, обработанной ДЭПК (ингибитором РНКаз). Полученные препараты нуклеиновых кислот были достаточно чистыми по данным спектрофотометрии. Обратная транскрипция РНК проводилась с помощью коммерческого набора «Реверта L-100» производства фирмы «Интерлабсервис» (Москва), содержащего рандомные гексамерные праймеры, смесь нуклеотидов, а также обратную транскриптазу из вируса мышиной лейкемии. Приготовление смесей для ОТ и инкубация при 37С в течение 30 мин. осуществлялись в соответствии с инструкцией от производителя. Полученные препараты комплементарной ДНК (кДНК) служили для оценки генной экспрессии. Оценка содержания специфических мРНК в клетках Экспрессию генов определяли по содержанию копий кДНК с помощью геноспецифической ПЦР.
Специфические праймеры для ПЦР имели следующие последовательности: 5HTTrat-ef 5 ttt cct cct gtc cgt cat tg 3 5HTTrat-er 5 atg ttg tec tgg gcg aag tag 3 , длина ампликона = 392 n.o. (Zhou, Koldzic-Zivanovic et al., 2002) ERa-rat-ef 5 аса ttc ctt cct tec gtc 3 ERa-rat-er 5 tgg ate tgg tgc aac aag 3 Длина ампликона= 214 n.o. (Zhou, Koldzic-Zivanovic et al., 2002) ERb-rat-ef 5 gca gaa cct caa aag agt cc 3 ERb-rat-er 5 aac gec gta atg ata ccc 3 Длина ампликона = 191 n.o. (Zhou, Koldzic-Zivanovic et al., 2002) DATrat-ef 5 tgc tgg tea ttg ttc tgc tc 3 DATrat-er 5 ate cac аса gat gec tea ca 3 Длина ампликона = 202 n.o. (Spangler, Goddard et al., 2003) GPD-rat-ef: 5 tec cat tct tec ace ttt ga 3 GPD-rat-er: 5 tgt gag gga gat get cag tg 3 Длина ампликона = 253 n.o. (Spangler, Goddard et al., 2003) Использованные праймеры перекрывали, как минимум 2 экзона, что позволяло дифференцировать продукты ПЦР для РНК и ДНК (в случае примесей ДНК). Олигонуклеотиды заказывали в фирме «Синтол» (Москва) в лиофилизированной форме и разводили перед употреблением до концентрации 15-30 пмоль в 1мкл. Постановку ПЦР проводили отдельно для каждого гена в идентичных условиях. Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5х ПЦР-буфер (Амплисенс, Москва); смесь дезоксинуклеотидов (MBI Fermentas, Каунас, Литва), специфические праймеры (от 0.05 до 0.3 цМ) производства «Синтол» (Москва), ДНКaq полимеразу («ДНК-Технология, Москва», 1,0 ферм.ед. в пробе) и аликвот кДНК (2,5 мкл в пробе), в общем объеме 20 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе ICycler (Bio-Rad, США). Режим ПЦР был
Влияние овариоэктомии на активность самок, обучившихся бегу в колесе
Овариоэктомия значимо снижала активность животных в беговом колесе (рис 4.3 а, однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями F(l,14)=r6,3; Р 0,05). Следует отметить, что сам факт хирургического вмешательства не влиял на активность животных, так как сравнение активности интактных и ложнооперированных крыс в беговом колесе не выявило различий в активности животных (тестирование проводили в течение 1 часа, ежедневно) (рис. 4.3 б, F(l,9)=0,84; Р=0,38). Экспериментальная процедура. Интактных самок помещали в экспериментальные камеры на три недели, где они в течение 24 часов имели свободный доступ к колесу.
После периода обучения самок овариэктомировали. В течение трехнедельного восстановительного периода животных содержали в изолированных домашних клетках. Во время тестирования ОВЭ самок ежедневно помещали в экспериментальные камеры на 1 час. После четырех дней габитуации самок разделяли на 2 группы по 10 животных в каждой, с таким условием, чтобы средняя беговая активность за предыдущие 4 дня в группах была одинаковой. На 5-й и 6-й дни тестирования одна группа самок получала инъекцию эстрадиола (подкожно, 5 мкг/животное в объеме 0,1 мл), вторая (контрольная) — растворитель эстрадиола кунжутное масло (подкожно, в объеме 0,1 мл) за два часа до тестирования. Одночасовую активность животных в беговом колесе продолжали анализировать в течение 10 дней после первой инъекции эстрадиола. Результаты. Исходная активность крыс, получающих эстрадиол или его растворитель не различалась (рис. 4.4, день 0, F(l,18)=0,38; Р=0,54). Данные, полученные после инъекций эстрадиола или масла, анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями. Эстрадиол оказал значимое влияние на активность животных (рис. 4.4, F( 1,18)=6,1; Р 0,05), причем активность увеличивалась достоверно начиная с четвертого дня после первой инъекции эстрадиола (рис. 4.4). Рис. 4.4. Влияние эстрадиола на активность ОВЭ самок крыс в беговом колесе. Данные представлены как среднее количество оборотов колеса за 1 ч (M±m), N=8. Животные получали две последовательные (день 1 и день 2) инъекции эстрадиола (5 мкг на животное; 0,1 мл) или его растворителя (0,1 мл) за два часа до теста.
Активность измеряли ежедневно в течение 10 дней. - р 0,05 (post hoc t-тест) - достоверные отличия группы, получившей инъекции эстрадиола от группы, получившей инъекции растворителя. Задачей настоящего раздела работы было оценить влияние овариэктомии и эстрадиола на общую двигательную активность животных в сравнении со специфической активностью, обладающей собственными подкрепляющими свойствами (бег в колесе). Экспериментальная процедура. Было использовано 31 животное. Самок крыс приучали к экспериментальным боксам в течение 2-х дней. Тестирование проводили на третий день. На этот момент в стадии проэструса находилось 9 животных, в стадии эструса 5, в стадии метеструса 8, а в стадии диэструса 9. Детали методики измерения горизонтальной и вертикальной двигательной активности представлены в главе 2.8. Результаты. Результаты представлены на рис. 4.5. Дисперсионный анализ не выявил различий между стадиями эстрального цикла (F(3,28) = 0.634; Р=0.599 для горизонтальной активности; F(3,28) = 0.062; Р=0.979 для вертикальной активности). Использовали 14 ОВЭ животных для группы эстрадиола и 16 для группы растворителя. Перед введением веществ животных приучали к экспериментальным боксам в течение 5-ти дней. По исходному уровню активности крыс разделяли на 2 группы. Далее, в течение 2-х дней животным делали подкожные инъекции эстрадиола или его растворителя за 2 часа до экспериментальной сессии. После этого тестирование продолжали еще в течение 4-х дней. Результаты. Данные обрабатывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями. Влияния фактора введения эстрадиола обнаружено не было (F(l, 28)=1,109, Р=0,301 для горизонтальной активности; F( 1,28)= 1,422; Р=0,243 для вертикальной активности, Рис. 4.6). Двигательная активность, обладающая собственными подкрепляющими свойствами (бег в колесе). Существует большое количество работ, доказывающих, что бег в колесе обладает собственными подкрепляющими свойствами, по-видимому,
Похожие диссертации на Экспериментальное изучение экстроген-зависимых изменений функции системы "награды" головного мозга и подкрепляющего эффекта кокаина
