Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1. Современные представления об этиологии и патогенезе болезни Паркинсона 11
1.1. Дисбаланс нейромедиаторов при болезни Паркинсона 11
1.2. Этиология болезни паркинсона 16
1.3. Роль свободных радикалов 21
1.3.1. Экспериментальная модель МФТП-индуцированного паркинсонизма 24
2. Современные подходы к лечению болезни Паркинсона 27
2.1. Антиоксиданты влечении болезни Паркинсона 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Животные 39
2.2. Вещества 39
2.3. Методы 39
2.3.1. Модель тремора, вызванного ареколином 40
2.3.2. Тест каталепсии у крыс, вызванной галоперидолом 40
2.3.3. Модель паркинсонического синдрома у мышей и крыс, вызванного системным введением МФТП 41
2.3.3.1. Модель паркинсонического синдрома у мышей C57BL/6 индуцированного введением нейротоксина МФТП 42
2.3.3.2. Модель паркинсонического синдрома у крыс, вызванного введением МФТП 43
2.3.4. Модель паркинсонического синдрома у крыс, вызванного внутримозговым введением 1-метил-4-фєнилпиридиния (МФП+) 45
2.3.5. Методика регистрации биоэлектрической активности головного мозга крыс с паркинсоническим синдромом вызванного введением МФТП 46
2.3.6. Методика определения содержания моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга крыс с паркинсоническим синдромом 47
2.3.7. Определение продуктов перекисного окисления липидов в гомогенатах мозга мышей C57BL/6 с паркинсоническим синдромом индуцированным введением МФТП 49
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Влияние мексидола и его комбинации с гимантаном на тремор, вызванный ареколином у белых аутбредных мышей 54
3.2. Изучение влияния мексидола на каталепсию у крыс 55
3.3. Изучение влияния мексидола на двигательные и вегетативные нарушения при ПС, вызванном введением МФТП мышам линии C57BL/6...57
3.4. Анализ эффектов мексидола при его однократном и субхроническом введении крысам с паркинсоническим синдромом, индуцированным введением МФІҐ в черную субстанцию головного мозга 62
3.5. Анализ биоэлектрической активности мозга крыс с паркинсоническим синдромом, индуцированным введением МФГҐ в черную субстанцию головного мозга 65
3.6. Изучение влияния мексидола на поведение и нейрохимические ; показатели - содержание моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга крыс с паркинсоническим синдромом, вызванным системным введением МФТП 71
3.7. Определение продуктов перекисного окисления липидов в гомогенатах мозга мышей с МФТП-индуцированным паркинсоническим синдромом 81
Заключение 84
Выводы 95
Список литературы 96
- Этиология болезни паркинсона
- Модель тремора, вызванного ареколином
- Модель паркинсонического синдрома у крыс, вызванного введением МФТП
- Изучение влияния мексидола на каталепсию у крыс
Введение к работе
Актуальность
Болезнь Паркинсона (БП) - дегенеративное мультифокальное и мультисистемное заболевание центральной нервной системы, проявляющееся двигательными, психическими и вегетативными расстройствами (Гусев и соавт., 2000; Доронин и соавт., 2003). Распространенность болезни Паркинсона в мире в среднем составляет 100
случаев на 100000 человек (Иллариошкин, 2006; Elbaz, Moisan, 2008; Elbaz,
Л Tranchant, 2007). Прогредиентное течение, недостаточная эффективность
терапии, а также тяжелая инвалидизация, наступающая у большинства
больных - все это превращает паркинсонизм в серьезную социальную
проблему (Федорова, Суслина и соавт., 2006; Яхно, Хатиашвили, 2002).
В основе патофизиологии основных двигательных нарушений - тремора,
ригидности, олигокинезии - при паркинсонизме лежит первичное поражение
дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции и других
пигментсодержащих ядер ствола (Bonuccelli, Dotto, 2006; Nussbaum, Ellis,
2003), что приводит к снижению уровня дофамина (ДА) в стриатуме (Carvey
et al., 2006; Huot et al., 2007). Дефицит ДА индуцирует гиперактивацию
стриатных холинергических нейронов и, как следствие этого, образование
генератора патологически усиленного возбуждения, который формирует
патологическую детерминанту и патологическую систему
паркинсонического синдрома (Крыжановский, 1980; 1997). Несмотря на
многочисленные исследования, причины дисфункции пигментсодержащих
ДА нейронов, и, в конце концов, их гибели, имеющие основное значение при
идиопатической болезни Паркинсона, остаются неизвестными. Наиболее
вероятным представляется взаимодействие между генетическими и
средовыми факторами (Sherer et al., 2002J. К основным патогенетическим
механизмам БП относят активацию глутаматных NMDA рецепторов (Sherer
et al., 2002), приводящую к нарушению дыхательной функции митохондрий и
энергетическому дефициту (Bonuccelli, Dotto, 2006; Jin et al., 2006; Keeney et al., 2006;^ШсЬагё5оп et al., 2007;CSdiapjra5_2^06)^)преждевременный апоптоз,
воспалительные иммунные реакции (Andersen, 2004; Esposito et al., 2007;
і V з '
Huang et al., 2003; Jenner, Olanow, 2006; Shapira, 2005). В соответствии с
современной концепцией патогенеза БП разработаны стратегия и основные
принципы терапии этого заболевания (Иванова-Смоленская и соавт., 2007;
Крыжановский и соавт., 2002; Маньковский, Карабаиь, 1998; Шток,
Федорова, 1997; Яхно и соавт., 1995; Shapira et al., 2006; Soderstrom et al.,
2006).
Основным наиболее эффективным методом лечения болезни Паркинсоиа
остается заместительная терапия с применением предшественника дофамина
- L-3,4- дигидроксифенилаланина (L-ДОФА). Однако данная терапия
является симптоматической, не направлена на устранение главной причины
заболевания и при длительном применении приводит к развитию моторных
флюктуации и тяжелых побочных эффектов (Kulkantrakorn et al., 2006; Ogawa
\ et al., 2005). Кроме того, в клинике используются агонисты ДА рецепторов, \
,\V ингибиторы ферментов деградации ДА - моноаминооксидаз (МАО) и
/^ V* катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ), а также препараты адамаитанового
ряда, которые способствуют высвобождению дофамина из пресинаптических
^"лчз" терминалей, тормозят обратный захват дофамина, блокируют NMDA-
глутаматные рецепторы (Гусев и соавт., 2000; Левин, 2004). Отличительными особенностями адамантанов являются малая токсичность, редкие побочные эффекты, практически отсутствие противопоказаний (Гусев и соавт., 2000).
Многофакторный характер патогенеза БП обусловливает необходимость комплексной патогенетической терапии, принцип которой заключается в сочетанном воздействии на различные звенья нейропатологического синдрома (Крыжановский, 1997; 2002; Poewe, 2006). Достижение этой цели возможно при использовании препаратов, имеющих многокомпонентный механизм действия. К таким препаратам относится новое производное 2-аминоадамантана гимантан, имеющий свойства блокатора глутаматиых
рецепторов NMDA-подтипа, ингибитора МАО-В, проявляющий дофаминпозитивный эффект и умеренное антирадикалыюе и
иммуномодулирующее действие. (Вальдман, 2001). В эксперименте доказаны Ucc0^
*&'*> его преимущества перед широко используемым в практике амантадином
(мидантаном). В клиническом исследовании показана перспективность
применения гимантана для лечения ригидных и дрожательных форм
паркинсонизма ранних стадий и определены перспективы дальнейшего
изучения его эффективности, в частности в комплексной терапии БП
(Вал-ьдман-и-0автт7-1-999г2ОО47"Неробкова-и-еоавт-^^ООО^Катунина и соавт.
2008).
Другим подходом, не исключающим первый, является совместное
применение нескольких препаратов, воздействующих на разные звенья
патогенетического процесса. Наиболее широкое распространение получило
включение в комплексную терапию БП антиоксидантов. Мексидол (2-этил-6-
метил-3-оксипиридин сукцинат) является антиоксидантом, обладающим
нейропротекторными свойствами. Мексидол ингибирует процессы
перекисного окисления липидов (ПОЛ), повышает содержание полярных
фракций липидов в мембране, уменьшает вязкость липидного слоя,
увеличивает текучесть мембраны, повышает активность аитиоксидантпых
ферментов, в частности, супероксиддисмутазы (Дюмаев и соавт., 1995),
активизирует энергосинтезирующие функции митохондрий и улучшает
энергетический обмен в клетках (Лукьянова, 2000), модулирует рецепторные
комплексы мембран мозга, усиливая их способность к связыванию
(Воронина и соавт., 2002;(Середенин и соавт., 1987/. Мексидол повышает резистентность организма к воздействию повреждающих факторов и оказывает церебропротекторное действие (Симонова, Роловк-ин—Камттпш, 2006).
Мексидол обладает способностью потенцировать действие некоторые противопаркинсонических и анксиолитических веществ, уменьшает их
м» Со О в Г.
побочные эффекты (Воронина, Омириввт-Дюмаев, 2001). Мексидоіиобладает
' способностью Потенцировать действие некоторых
А анксиоли
противопаркинсонических йу анксиолитических веществ, уменьшает их побочные эффекты (Воронина и^соавт, 2С}01). На экспериментальной модели паркинсонизма показана способность мексидола ослаблять активацию процесса ПОЛ, при совместном применении повышать эффективность леводопы (Кучеряну, 2001), предотвращать повреждение и гибель нигростриатных дофаминергических нейронов. (Катунина, 2005; 2006). В клинике отмечено достоверное снижение тремора покоя при применении мексидола в терапии БП, протекающего в мягкой форме и на начальных стадиях заболевания (Катунина и соавт., 2006).
В настоящее время мексидол в инъекционной лекарственной форме широко используется в неврологической практике при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения, в остром и отдаленном периодах черепно-мозговой травмы, при постгипоксических состояниях, расстройствах памяти и интоксикации. Однако, несмотря на все имеющиеся предпосылки, комплексного экспериментального изучения мексидола на моделях паркинсонизма не проведено, что препятствует широкому применению препарата в клинике при лечении БП.
Цель исследования - оценка моторных, нейрохимических и электрофизиологических эффектов мексидола в ампулированной лекарственной форме и его комбинации с гимантаном на экспериментальных моделях паркинсонического синдрома.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние мексидола и его комбинации с гимантаном на
двигательные и вегетативные нарушения у мышей и крыс с
паркинсоническим синдромом (ПС).
2. Провести анализ противопаркинсонической активности мексидола и его
комбинации с гимантаном в сравнении с леводопой, мидантаном,
гимантаном на экспериментальных моделях ПС.
3. Провести электрофизиологический анализ действия мексидола на модели
ПС, вызванного введением нейротоксина МФП+ в черную субстанцию мозга
крыс.
Изучить влияние мексидола на уровень нейромедиаторов (дофамина, норадреналина, серотонина) и их метаболитов в структурах головного мозга при МФТП-вызванном ПС у крыс.
Изучить антиоксидантную активность мексидола и его комбинации с гимантаном в условиях модели ПС индуцированного введением МФТП мышам C57BL/6.
Научная новизна. В комплексном исследовании установлено, что мексидол в ампулированной лекарственной форме ослабляет моторные и вегетативные проявления экспериментального ПС, вызванного МФТП и МФП+. Мексидол при субхроническом введении предотвращает вызываемое МФТП снижение уровня ДА, серотонина (5-ОТ) и их метаболитов - ДОФУК и 5-ОИУК в гиппокампе крыс. Мексидол нормализует биоэлектрическую активность мозга на модели ПС, вызванного интранигральным введением МФП+ у крыс, что выражается в снижении числа и длительности пароксизмальных разрядов, нормализации характеристик ЭЭГ.
Впервые доказана возможность повышения эффектов гимантана при сочетании с мексидолом на модели ареколинового тремора и при МФТП-индуцированном ПС. Впервые установлено взаимное потенцирование антиоксидантной активности при комбинации мексидола с гимантаном, что проявлялось в снижении содержания малонового диальдегида в мозге мышей с МФТП-индуцированным ПС.
Научно-практическое значение. Полученные результаты существенно расширяют имеющиеся представления о нейрохимических и электрофизиологических механизмах действия мексидола. Результаты исследований показали способность мексидола ослаблять основные симптомы ПС: олигонезию, тремор и ригидность, и усиливать эффекты противопаркинсонического препарата гимантана, что подтверждает целесообразность использования мексидола в ампулированной лекарственной форме в сочетанной терапии при лечении болезни Паркинсона Личный вклад.
автором самостоятельно выполнены эксперименты по оценке поведения животных на различных моделях, проведена обработка полученных результатов. Нейрохимические и нейрофизиологические исследования проведены при активном участии автора
Апробация диссертации. Материалы диссертации представлены на XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии и фармакологии» (Ялта-Гурзуф, 2005), на XIV и XV Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (2006, 2007), на научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в научных журналах, один из которых входит в перечень рекомендованных ВАК, и 5 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах и содержит: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающий 67 отечественных и 167 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 17 рисунками.
Этиология болезни паркинсона
Причины развития болезни Паркинсона до сих пор не ясны. Однако, совокупность генетической предрасположенности и неблагоприятного влияния средовых факторов рассматривается большинством исследователей как наиболее вероятные причины развития болезни. / Влияние определенных наследственных факторов па заболеваемость паркинсонизмом в настоящее время не доказано, но отдельные факты позволяют предполагать их значимость в предрасположенности к заболеванию. В 1997 году была идентифицирована мутация в гене, кодирующая белок синуклеин (Polymeropoulos, 1997). Мутация наследуется по аутосомно-доминантому типу у членов итальянских и греческих семей, страдающих наследственной формой паркинсонизма. Для возникновения болезни было достаточно одной мутантной копии гена (полученной от отца или матери). В этом же году выяснилось, что синуклеин относится к категории белков, способных к образованию кластеров - телец Леви. В опытах на дрозофилах, нематодах и мышах было показано, что мутантный синуклеин образуется в нейронах черной субстанции в больших количествах, вследствие чего происходит их дегенерация и возникают двигательные расстройства. Идентификация антисмысловой мутации в гене альфа-синуклеина в 4-х независимых семьях с болезнью Паркинсона позволила предположить, что, по крайней мере, часть случаев семейного паркинсонизма является результатом изменений белка, который нарушает нормальный процесс деградации белков и ведет к появлению патологических включений и запуску процессов нейрональной смерти (Goldberg, 2000; Nussbaum, 1997; Shapira, 1997). Установлено, что ассоциированные с заболеванием точковые мутации синуклеина и факторы внешней среды, в частности полиамины, могут воздействовать на С-терминаль альфа-синуклеииа, что приводит к дестабилизации мономера и изменению структуры белка. Механизм развития нейродегенерации вслед за конформационными изменениями альфа-синуклеина пока окончательно не установлен. Предполагается, что олигомеры альфа-синуклеина могут образовывать поры во внутриклеточных мембранах, что влечет увеличение проницаемости для катионов. Далее могут запускаться механизмы дисфункции митохондрий, оксидативного стресса, нарушений синаптической передачи (Cookson, van der Brug, 2008; Schulz, 2007). Японскими учеными был идентифицирован еще один ген - он копирует белок паркин, мутация в котором приводит к наследственному паркинсонизму, но другого типа (Mizuno, 1998). Такая мутация обычно встречается у людей, заболевших в возрасте до 40 лет. В молекуле паркина имеются несколько доменов, характерных и для многих других белков. Особый интерес представляют так называемые RING - домены. Содержащие их белки участвуют в расщеплении других белков.
Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют предположить, что гибель нейронов при данной форме паркинсонизма происходит вследствие нарушения убиквитилирования - составного компонента системы удаления аномальных белков. В норме паркин присоединяет убиквитин к неправильно упакованным белкам. Без этого белок не получает «черную метку» и не разрушается. Было обнаружено, также, что белок под названием BAG5, присутствующий в тельцах Леви, может связываться с паркином и блокировать его работу, результатом чего служит гибель дофаминергических нейронов. Идентифицирован еще целый ряд других геновv имеющих отношение к паркинсонизму. Была обнаружена мутация в гене DJ-1 у членов нескольких голландских и итальянских семей. Как и мутация в гене паркина, она отвечает за возникновение аутосомно-рецессивной формы болезни Паркинсона. Выявлена также мутация в гене UCHL1 у больных, страдающих наследственной формой паркинсонизма (Bonifati, 2003). При наличии в семье больного БП риск возникновения заболевания у членов этой семьи возрастает в 10-20 раз. Но далеко не у всех больных удается проследить наследственный фактор. Генетический дефект, или возможно разные генетические дефекты при БП не следуют классическим законам рецессивного или доминатного наследования и не относятся к одному определенному локусу. Генетическая предрасположенность, возможно, увеличивает чувствительность нигро-стриариой системы к влиянию возраста и патологических факторов внешней среды. Пропаркинсонические свойства обнаружены у многих экзогенных токсинов. В настоящее время на первом месте стоит внутривенное введение суррогатных наркотиков. Один из таких наркотиков мепередин часто содержит примесь побочного продукта своего синтеза сокращенно обозначаемый МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,б-тетрагидропиридии), который остается пока единственным известным химическим веществом, способным избирательно разрушать дофаминергические нейроны в черной субстанции в эксперименте на лабораторных животных и вызывать неврологические появления паркинсонизма (Langston, 1983). Давно известен марганцевый паркинсонизм у рабочих, занятых на марганцевых производствах. Кроме того, известно токсическое действие железа и алюминия (Mena et al., 1969). Нейротоксическим эффектом обладают моно- и дисульфид углерода, цианиды, гербициды, пестициды, продукты ртутной и кобальтовой промышленности, пиридиновые производные органических растворителей. Реализация патогенного пропаркинсонического действия эндо- и экзогенных токсинов, в частности отходов промышленного производства, а также
Модель тремора, вызванного ареколином
Галоперидол является типичным нейролептиком - производным бутирофенона. Действие его наступает быстро и продолжается длительное время. Механизм действия галоперидола связывают с блокадой ДА рецепторов, центральным а-адреноблокирующим действием и нарушением процесса обратного нейроналыюго захвата и депонирования адреналина. Наиболее частым побочным эффектом галоперидола являются экстрапирамидные расстройства. Исследования проводили на 60 самцах аутбредных белых крыс массой 250-280 г. В каждой группе было по 10 животных. Каталепсию вызывали внутрибрюшинным введением галоперидола в дозе 1 мг/кг за 60 минут до начала наблюдения. Препараты сравнения (мидантан 20 мг/кг и левадопа 100 мг/кг), гимантан 10 мг/кг и мексидол (100 и 200 мг/кг) вводили внутримышечно через 40 минут после введения галоперидола, т.е. за 20 минут до тестирования. Антагонизм с галоперидолом оценивали в градуированной и альтернативной форме по способности исследуемых веществ уменьшать время каталептогенного состояния крыс и процент животных с каталепсией в группе. Изучение корригирующего действия мексидола на каталептогениый эффект галоперидола проводили по методу Morpurgo (Воронина, -Вшіьдмап, Неробкова, 2005). Оценку глубины каталепсии, т.е. способности животного на протяжении некоторого времени удерживать искусственно приданную позу, проводили через 60, 120, 180 мин и 6 часов после введения галоперидола. Животное усаживали на задние лапки так, чтобы, опираясь передней лапкой на ступеньку (тест «лестница»), крыса держала бы другую лапку без опоры. Если крыса сохраняла эту позу в течение 10 сек при высоте ступени 3 см, засчитывали 1 балл, при высоте ступени 10 см - 2 балла. Поочередно помещали правую и левую лапу на нижнюю, затем на верхнюю ступени. Таким образом, максимальное развитие каталепсии у одного животного оценивалось в 6 баллов. Попытки усадить животное в нужную позу продолжали не более 1 мин.
Степень каталепсии оценивали в баллах по группе. Данная модель является наиболее адекватной моделью ПС, поскольку МФТП вызывает избирательное повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции и двигательные расстройства, характерные для БП: акинезию, ригидность, тремор, гипомимию, феномен застывания (Атаджанов, 1989; Araki, et al, 2001; Gerlach et al, 1991; Heikkila, Sonsala, 1991; Kopin, Markey, 1988; Przedborski et al, 2001; Smith et al., 1997; Tipton, Singer, 1993; Watanabe et al, 2005; Wu et al, 2002). МФТП — нейротоксин, который при ферментативном участии МАО-В в астроцитах преобразуется в токсичный положительный ион 1-метил-4-фенилпиридин (МФІҐ), который с помощью дофаминового транспортера захватывается ДА нейронами. МФГҐ" накапливается в митохондриях, вызывает повреждение и последующую гибель нейронов, блокируя активность фермента дыхательной цепи NADH-дегидрогеназы (ингибирование комплекса-I дыхательной митохондриалыюй цепи) (Chiba, et al., 1984; Mytilineou et al., 1997; Saporito et al., 1992; Tipton et al., 1993; Watanabe et al, 2005). Этот эффект наиболее выражен у приматов (Forno et al., 1993; Jenner, 2003; Langston et al., 1984), у мышей некоторых линий, особенно С57В1/6 (Kopin and Markey, 1988; Heikkila et al., 1989; Przedborski et al., 2000). Доказана специфичность возникающих под действием нейротоксина изменений в нигростриатуме и у крыс, однако крысы менее чувствительны к МФТП (Przedborski et al., 2001). Исследование мексидола в сравнении с препаратами сравнения на основные экстрапирамидные нарушения, вызванные однократным внутрибрюшинным введением МФТП (30 мг/кг), проводили на 100 самцах мышей линии C57BL/6. Мексидол (100 и 200 мг/кг) вводили за 24 часа, гимантан (10 мг/кг), мидантан (20 мг/кг) и леводопа (100 мг/кг) вводились внутримышечно за 30 минут до введения нейротоксина. Оценку эффективности веществ проводили сразу после введения МФТП. Регистрировали олигокинезию (уменьшение двигательной активности животных) и ригидность (скованность, мышечная напряженность, застывание животных). Олигокинезию оценивали по изменению двигательной активности в актометре «Ugo Basile» (Италия).
С этой целью мышей помещали в камеру с электродным полом, перемещения по которому фиксируются счетчиком. Учитывали среднюю величину перемещений за 3 минуты для каждой группы животных. Для определения ригидности мышц туловища использовался симптом «горбатости», для которого характерно укорочение расстояния от шеи до хвоста животного. Регистрировали число мышей в группе, у которых отмечался этот вид нарушений. Кроме того, оценку ригидности у мышей проводили по изменению длины шага. Каждое животное помещали в пенал с маркировочной лентой, предварительно окрасив лапки специальным красителем. Определяли расстояние между следами от передних и задних лапок, оставшимися на ленте.
Модель паркинсонического синдрома у крыс, вызванного введением МФТП
Мышечный тонус задних лап крыс определяют по сопротивлению пассивной флексии в голеностопном суставе. Для количественной оценки ригидности мышц туловища использовали симптом "горбатости", выраженность которого зависит от мышечной ригидности и определяется по укорочению расстояния от шеи до основания хвоста за счет сгорбленности животного. Ригидность у крыс оценивали по балльной системе: 0 -отсутствие ригидности, 1-укорочение расстояния от шеи до основания хвоста менее, чем на 3 см, 2 - более, чем на 3 см. Регистрация двигательной активности. При ПС, вызываемом нейротоксином, наблюдается не только уменьшение количества движений, но и нарушение их качественной структуры. Понятие "олигокинезия" включает уменьшение количества и качества локомоторной активности животных. Животных тестировали в открытом поле, регистрируя в течение 5 мин число горизонтальных движений, вертикальных движений (стойки), поисковой активности (заглядывание в отверстия), груминг. Также степень олигокинезии оценивали по изменению двигательной активности крыс в актометре «Ugo Basile» (Италия). Индивидуально каждое животное помещали в камеру с электродным полом, перемещения по которому фиксируются счетчиком. Учитывали среднею величину перемещений животных в группе за 2 минуты. Регистрация тремора. Тремор оценивали по выраженности в баллах и по продолжительности, регистрируя время начала и окончания. По локализации и амплитуде тремор выражают в баллах: 0 - отсутствие, 1 - локальный мелкоамплитудный тремор головы, передних лап или хвоста, 2 - локальный среднеамплитудный тремор, 3 - генерализованный мелко- или среднеамплитудный тремор всего тела. Токсический эффект МФТП на нейроны черной субстанции обусловлен его конечным продуктом окисления - МФГҐ", который обладает высоким сродством к ДА нейронам.
Введение МФГҐ непосредственно в черную субстанцию (ЧС) вызывает у крыс выраженную дегенерацию ДА нейронов ЧС, снижение стриатного ДА и двигательные нарушения, характерные для ПС (Boada et al, 2000). Опыты проводили на белых аутбредных крысах-самцах 9-10-месячного возраста массой 350-450 г., поскольку ПС формируется лучше у «старых» крыс (Атаджанов, 1989, Voronina et al., 1990). Операции проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/м). Ыейротоксин МФГҐ вводили однократно билатерально в компактную зону ЧС по координатам стереотаксического атласа (Bures et al, 1960) с помощью микрошприца Гамильтона (10 мкг МФГҐ в 2 мкл физиологического раствора). Животным контрольной группы вводили соответствующую концентрацию йодистого натрия в 2 мкл физ. раствора, так как 1-метил-4-фенилпиридин используется в виде йодита. Одновременно в мозг крысы по координатам стереотаксического атласа вживляли билатерально электроды в сенсомоторную область коры (СМК), ЧС и хвостатые ядра (ХЯ). Индифферентный электрод вживляли в носовую кость черепа. Корковые электроды изготавливались из нихромовой проволоки диаметром 120 микрон, в лаковой изоляции. Кончик электрода защищался. Концы электродов припаивались к посеребренным штырькам, которые крепились на поверхности черепа крысы зубным висфат-цементом и заливались стоматологической пластмассой протакрилом. Опыты проводились на крысах с хронически вживленными электродами в экранированной камере в условиях свободного поведения животных. Регистрации биоэлектрической активности мозга крыс проводилась на 21 канальном компьютерном электроэнцефалографе «Нейро-КМ», с установленными фильтрами на 40 Гц и постоянной времени 0,03. При визуальном анализе оценивалось изменение нормальных компонентов ЭЭГ, а также наличие патологических форм активности (пароксизмальная активность, ирритативные знаки, замедление активности).
Первый сеанс регистрации ЭЭГ проводился через 24 часа после интрапигральпого введения нейротоксина на фоне развернувшихся экстрапирамидных нарушений. При изучении влияния мексидола регистрация ЭЭГ производилась до инъекции препарата и через 60 минут после его введения (на 1 и 7 сутки после операции с интранигральным ведением МФГҐ"). Мексидол вводили через 24 часа после интранигрального введения нейротоксина, а затем ежедневно в течение 6 дней (Рис. 1). Компьютерный анализ ЭЭГ осуществлялся с помощью программы «BRAINSYS» (Митрофанов, 2007) программный комплекс которой включает следующие функции: ввод в компьютер многоканальной ЭЭГ и ее визуальное редактирование; фильтрацию, выделение артефактов и их устранение из анализируемого отрезка ЭЭГ; спектральный и когерентный анализ ЭЭГ и статистическую обработку полученных результатов.
В эксперименте использовали 50 крыс-самцов линии Wistar по 10 животных в группе: Мексидол вводили субхронически в течение 7 дней в дозе 150 мг/кг внутрибрюшинно. На 7 день опыта вводили МФТП (30 мг/кг однократно внутрибрюшинно) и в течение 90 минут оценивали степень локомоторных и вегетативных изменений у крыс под действием нейротоксина согласно методикам изложенным выше. Декапитацию животных проводили через 90 мин после введения МФТП. Структуры головного мозга - фронтальная кора (Фк), гиппокамп (Гпк), гипоталамус (Гпт), стриатум (Ст) и прилежащее ядро (ПЯ) - извлекали на льду и замораживали в жидком азоте. Затем выделенные структуры размельчали в гомогенизаторе «стекло-тефлон» при +ЮС при скорости вращения пестика 3000 об/мин. В качестве среды выделения использовали 0,1 II ЫС104 с добавлением 500 пикомоль/мл внутреннего стандарта диоксибензиламина. Прилежащее ядро гомогенизировали в 40 объемах, а остальные структуры мозга - в 20 объемах среды выделения Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант использовался в дальнейшем для определения моноаминов и их метаболитов. Содержание моноаминов и их метаболитов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (ВAS, West Lafayette, США) с инжектором «Rheodyne 7125» с петлей на 20 мкл для нанесения образцов (Кудрин, Мирошниченко, Раевский, 1988). Изучаемые вещества разделяли на обращённо-фазной колонке (Ci8 3x150 мм, 5 мкм, PI-ffiNOMENEX», США). Маточные стандарты готовили ежемесячно в 0,1 Н НСЮ4 в концентрации 500 пикомоль/мл с добавлением 0,2 мМ метабисульфита натрия в качестве консерванта. Рабочие стандарты приготовляли из маточных растворов ежедневно. Все использовавшиеся для анализа реактивы были высокой степени чистоты: ОСЧ или analytical grade. Для калибровки хроматографа использовались смеси рабочих стандартов определяемых веществ в соотношении 500 пикомоль/мл. Величины концентрации катехоламинов (КА) в опытных образцах рассчитывали, исходя из отношений высот пиков в стандартной смеси и в образце, по
Изучение влияния мексидола на каталепсию у крыс
Галоперидол в дозе 1 мг/кг (в/б) вызывал у крыс состояние каталепсии -сохранение искусственно приданной позы в течение длительного времени. У 100 % животных отмечалось наличие максимальной каталепсии (по 6-ти бальной оценочной шкале) в течение 180 минут (Табл. 2, 3). Через 6 часов после введения галоперидола выраженность каталепсии снижалась и выявлялась у 50% животных. Мексидол в дозе 200 мг/кг при введении одновременно с галоперидолом достоверно снижал каталептогенный эффект галоперидола. Так, через 60 минут после введения галоперидола отмечалось уменьшение каталепсии в 1,67 раза по сравнению с показателями животных, получавших только галоперидол. Достоверное снижение экстрапирамидиых нарушений под влиянием мексидола наблюдалось через 1, 2, 3 и 6 часов после введения галоперидола (Табл. 2). Мексидол в дозе 100 мг/кг в условиях данной модели был не эффективен. Влияние мексидола на выраженность каталепсии оценивалось и по уменьшению числа животных, у которых показатель каталепсии не достигал максимального значения - 6 баллов (Табл. 3). Так после введения мексидола в дозе 100 мг/кг процент животных с максимальной каталепсией (регистрация через 60 минут) снизился до 50% (Р 0,05). Введение мексидола в дозе 200 мг/кг усиливало антикаталептический эффект соединения, что нашло свое отражение в снижении количества животных с максимально выраженной каталепсией до 30%. Препараты сравнения леводопа, мидантан и, в особенности, гимантан оказали выраженное антикаталептическое действие (Табл. 3).
Мексидол (200 мг/кг) был близок по эффективности мидантану, но обладал меньшим эффектом, чем леводопа и гимантан (Табл. 2, 3). Динамическая оценка локомоторных и вегетативных функций животных на фоне МФТП (30 мг/кг однократно в/б) проводились сразу после введения нейротоксина. Показано, что через 3-5 минут после инъекции нейротоксина отчетливо проявлялись все виды экстрапирамидных расстройств, характерных для ПС: мелкоамплитудный тремор головы и всего тела, продолжительностью 15-20 минут; через 10 минут появлялась ретро-или латеропульсия; через 15-20 минут отмечалось появление ригидности, что выражалось в нарушения походки, напряжении передних и задних конечностей и появлении «горба». Также оценку ригидности проводили по изменению длины шага мыши (Рис. 3). Так, на фоне МФТП длина шага мыши уменьшилась на 58,3% по сравнению с группой интактного контроля, а под действием препаратов это нарушение было значительно меньше - на 26,3%, 37,86% и 17,46%, - в группах «Гимантан», «Мексидол» и «Мексидол+Гимантан», соответственно. Через 10-12 минут после введения нейротоксина проявление ригидности у животных фиксировалось в виде нарушения походки, напряжении передних и задних конечностей и появлении «горба». На фоне мексидола (100 мг/кг) ригидность исчезала у 40 %, а при удвоении дозы - у 50% животных.
Леводопа устраняла ригидность у 70% а мидантан - у 60% мышей (Рис. 4). Через 90 мин после введения МФТП у животных всех групп отмечалась высокая степень олигокинезии (Рис. 5). Мексидол (200 мг/кг) вызывал умеренное (на грани достоверности) повышение двигательной активности в «Открытом поле». При совместном введении мексидола (200 мг/кг) с гимантаном (10 мг/кг) на фоне МФТП выявлено достоверное повышение двигательной активности в 2,86 раз по сравнению с показателем в группе, получавшей только нейротоксин. Изучение влияния веществ на экстрапирамидные нарушения у мышей через 90 минут после введения МФТП выявило значительное снижение двигательной активности животных и в актометре (Рис. 6). Мексидол в дозе 100 мг/кг уменьшал степень олигокинезии в 2,36 раза по сравнению с группой мышей получавших только МФТП. С увеличением дозы мексидола до 200 мг/кг его эффективность увеличивалась, и уровень двигательной активности повышался в 3,22 раза по сравнению с группой МФТП (Рис. 6). Леводопа значительно снизила степень олигокинезии, а на фоне мидантана групповой показатель двигательной активности животных был сопоставим с данными интактного контроля.
