Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
Общая характеристика анксиолитических средств 12
Характеристика бензодиазепинового анксиолитика феназепама . 21
Клинические данные о действии феназепама 31
Характеристика наночастиц 40
Полибутнлцианоакрилатные наночастицы (ПБЦА наночастицы) .43
Механизм транспорта полибутилцианоакрилатных наночастиц через ГЭБ 46
ПБЦА наночастицы - носители лекарственных веществ. 47
Заключение 52
Глава 2. Материалы и методы исследования 56
Препараты и вещества, используемые в исследовании 56
Получение экспериментальной лекарственной формы нанокапсулированного феназепама 57
1) Поверхностная сорбция Феназепама 57
2) Включение феназепама в матрикс ПБЦА наночастиц, 61
Методика определения возможности проникновения ПБЦА наночастиц через эндотелий кишечника 62
Фармакологические методы исследования 65
Животные 65
Методы изучения анксиолитического действия 66
Методика конфликтной ситуации 66
Методика приподнятого крестообразного лабиринта 68
Методы изучения противосудорожного действия 69
Тест антагонизма с коразолом 69
Методика первично-генерализованных судорог, вызванных бемегридом 70
Методика регистрации биоэлектрической активности головного мозга крыс в условиях свободного поведения 70
Методика изучения агрессивного поведения 72
Методика открытого поля для изучения седативного действия 73
Методика вращающегося стержня для изучения миорелаксантного действия 74
Методика изучения эффектов феназепама на наночастицах при использовании фармакологических анализаторов 75
Методы изучения толерантности и синдрома отмены после прекращения длительного введения феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц 77
Статистическая обработка 79
Результаты экспериментов 80
Глава 3. Синтез наночастиц и приготовление экспериментальных лекарственных форм 80
Получение нанокапсулированных форм феназепама 80
Выбор пути введения препарата 83
Глава 4. Сравнительное изучение фармакологических эффектов феназепама, сорбированного на ПБЦА наночастицах и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназепамом в субстанции 87
Изучение анксиолитического действия феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназепамом в субстанции в тесте конфликтной ситуации 87
Изучение седативного действия феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназепамом в субстанции в тесте открытого поля 92
Изучение миорелаксантного действия феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназепамом в субстанции 95
Заключение 97
Глава 5. Изучение спектра фармакологических эффектов феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц в сравнении с феназепамом в субстанции 99
Глава 6. Изучение влияния феназепама в субстанции и феназепама на наночастицах на спектр мощности ЭЭГ 123
Глава 7. Анализ механизма действия феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц при использовании анализаторов ГАМК-А рецептора 130
Глава 8. Изучение толерантности и синдрома отмены после хронического введения феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц и феназепама в субстанции 137
Выводы. 171
Список литературы
- Характеристика бензодиазепинового анксиолитика феназепама
- Получение экспериментальной лекарственной формы нанокапсулированного феназепама
- Методика изучения эффектов феназепама на наночастицах при использовании фармакологических анализаторов
- Изучение седативного действия феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназепамом в субстанции в тесте открытого поля
Введение к работе
Актуальность. В последние годы в связи с увеличением воздействия на человека стрессорных ситуаций резко возросло потребление анксиолитических средств, среди которых наибольшее распространение получили препараты бензодиазепиновой структуры, в том числе отечественный препарат феназепам, который применяется в лечебной практике уже более 25 лет (Воронина Т.А., 1978, 1982; Середенин СБ. и соавт., 1982, 2005). Однако, наличие побочных эффектов, которые выражаются в ухудшении моторных (седативное и миорелаксантное действие), и мнестических функций, риске возникновения лекарственной зависимости и синдрома отмены, значительно ограничивает использование феназепама в клинической и, особенно, амбулаторной практике. Уменьшить или устранить побочные эффекты феназепама, при сохранности основного анксиолитического эффекта, представляется возможным при изменении его доставки в организм с использованием наноносителей.
В последние годы для целенаправленной транспортной доставки лекарственных веществ в мозг используется способ сорбирования и включения веществ в наночастицы, представляющие собой коллоидные системы, состоящие из полимерного матрикса (Чехонин В.П. и соавт., 2009; Alyautdin et al., 2001; Kreuter, 2001; Lockman et al., 2002; Olivier, 2005). К числу таких наночастиц относятся полибутилцианоакрилатные наночастицы (ПБЦА-наночастицы), покрытые сурфактантами (полисорбатом-80), которые были созданы и изучены на кафедре фармацевтической технологии в университете И.В. Гёте (Франкфурт-на-Майне) и на кафедре фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Alyautdin et al.,1997, 2001; Kreuter, 1994, 2001). С целью предотвращения захвата ПБЦА наночастиц, содержащих препарат, клетками ретикуло-эндотелиальной системы, наночастицы покрываются сурфактантом, что увеличивает (до 20 раз) концентрацию веществ в сосудах головного мозга (Kreuter, 2001; Ramge et al., 2000).
ПБЦА наночастицы используются у животных и человека в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг таких лекарственных препаратов, как лоперамид (Alyautdin et al., 1997) тубокурарин (Alyautdin et al.,1998), ванкамицин, ампициллин (Kreuter, 1994), мет-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2000), лей-энкефалин (Ramge, Kreuter, 2001) и доксорубицин (Gelperina et al.,2003), который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США и Европе (Mansoor, 2007; материалы сайта www.biospace.com и http://www.bioalliancepharma.com; Bender., 2008).
Показано, что при введении веществ в ПБЦА наночастицы повышается их биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия, а также снижаются побочные эффекты и токсичность.
Целью исследования явилось сравнительное изучение основных и побочных эффектов феназепама, сорбированного и включенного в полибутилцианоакрилатные (ПБЦА) наночастицы, покрытые сурфактантом (полисорбатом-80), и феназепама в субстанции.
Задачи исследования.
1. Синтезировать ПБЦА наночастицы и ПБЦА наночастицы с феназепамом, определить размер ПБЦА-наночастиц методом фотонной корреляционной спектроскопии с использованием наносайзера Coulter N4MD (Великобритания) и провести количественное определение сорбированного и включенного феназепама в матрикс ПБЦА-наночастиц.
2. Провести сравнительное изучение анксиолитического, седативного и миорелаксантного эффектов феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц, феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции и выбрать нанокапсулированный феназепам для дальнейшего изучения.
3. Изучить возможность проникновения ПБЦА-наночастиц с включенным в матрикс родамином В через эндотелий кишечника при энтеральном введении методом иммунофлюоресцентной микроскопии.
4. Изучить основные (анксиолитический, противосудорожный, антиагрессивный) и побочные (седативный, миорелаксантный) эффекты феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом, в сравнении с феназепамом в субстанции.
5. Изучить влияние феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, в сравнении с феназепамом в субстанции на спектр мощности ЭЭГ в различных отделах мозга крыс.
6. Исследовать влияние анализаторов ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса (флумазенила и бикукуллина) на анксиолитический эффект феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом в сравнении с феназепамом в субстанции.
7. Исследовать возможность развития толерантности при длительном (21 день) применении феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, покрытых сурфактантом, в сравнении с феназепамом в субстанции и изучить синдром отмены после прекращения длительного введения веществ.
Научная новизна. Впервые феназепам сорбирован на поверхности и включен в матрицу полибутилцианоакрилатных наночастиц (ПБЦА- наночастиц), покрытых полисорбатом-80 и показано, что феназепам, включенный в матрикс наночастиц, покрытых полисорбатом-80, обладает более высокой анксиолитической активностью и имеет более высокий процент включения в наночастицы (65%), чем феназепам, сорбированный на наночастицах (43,7%). Показано, что размеры ПБЦА наночастиц составляют 230-250 нм, а с включенным в матрицу феназепамом - 350-370 нм. При энтеральном введении ПБЦА наночастицы не проникают через эндотелий кишечника. При парентеральном введении феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в дозах 0,1-2,5 мг/кг (внб) оказывает выраженное анксиолитическое, антиагрессивное, противосудорожное действие и не уступает по активности и глубине эффекта феназепаму в субстанции. Показано, что анксиолитическое действие нанокапсулированного феназепама ослабляется флумазенилом и бикукуллином, что свидетельствует о вовлечении бензодиазепиновых и ГАМК-А рецепторов в реализацию этого эффекта. В противоположность феназепаму в субстанции, феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в терапевтических дозах (0,1-2 мг/кг) не оказывает миорелаксантного действия и не обладает седативным эффектом, но в высокой дозе (5 мг/кг) эти проявления действия наблюдаются у 70% животных, хотя в значительно меньшей степени, чем у феназепама в субстанции. Установлено, что феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, усиливает спектр мощности ЭЭГ в диапазонах тета-2, бета-1 и бета-2 частот. Эффект нанокапсулированного феназепама на ЭЭГ в наибольшей степени выражен в гиппокампе и наступает быстрее, чем эффект феназепама в субстанции. При длительном введении феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц (1 мг/кг), также как и при введении феназепама в субстанции, не развивается толерантности по анксиолитическому и антиагрессивному эффектам. Нанокапсулированный феназепам, после прекращения его длительного введения, не вызывает проявлений синдрома отмены, характерных для феназепама в субстанции.
Научно-практическая значимость. Полученные данные о том, что феназепам, включенный в матрикс ПБЦА-наночастиц, покрытых сурфактантом, при парентеральном введении сохраняет высокую анксиолитическую, антиагрессивную и противосудорожную активность, но при этом резко снижаются его побочные эффекты, связанные с моторными функциями (седативный и миорелаксантный), а также данные об отсутствии проявлений синдрома отмены после прекращения длительного введения вещества являются основанием для продолжения исследований по разработке новых лекарственных форм психотропных препаратов, в том числе феназепама, с использованием нанотехнологических подходов и, в частности, ПБЦА наночастиц.
Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные лекарственные формы нанокапсулированного феназепама и проведено их фармакологическое изучение, обработаны результаты, сформулированы выводы.
Апробация работы: Результаты работы были доложены на межлабораторных конференциях ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), Международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech» (Москва, 2008).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в перечень, рекомендованных ВАК РФ и 4 тезиса.
Объем и структура диссертации: Диссертация содержит введение, обзор литературы, раздел с описанием материалов и методов исследования, 5-ти глав результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 194 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 66 рисунков. Библиографический указатель включает 124 отечественных и 100 иностранных источников.
Характеристика бензодиазепинового анксиолитика феназепама
Феназепам является отечественным препаратом, который уже более 25 лет широко применяется в лечебной практике как анксиолитическое, седативное, снотворное и противосудорожное средство (Богатский и соавт., 1975; Закусов и соавт., 1978; Воронина, 1978, 1979; Воронина и соавт.,1982; Воронина, Середенин , 2000, 2005).
Поведенческие модели создания у животных состояния беспокойства и страха с использованием наказующего раздражителя, подавляющего проявления условного или безусловного поведения, являются наиболее широко используемыми методиками при оценке транквилизаторов с момента их появления и обязательно используются и при оценке анксиолитических, антистрессорных веществ нового поколения (Вихляев, Клыгуль, 1967, 1977, 1978; Клыгуль, Вихляев, 1978; Воронина и соавт.,1982; 1994; Воронина, Середенин , 2000, 2005; File,1995; Sanger et al.,1991; Triet, 1985; File, 1995; Stein etal., 1973).
Конфликтная ситуация создается столкновением стрессорного наказующего раздражителя, с одной стороны и потребностями животного - с другой. Именно конфликтные ситуации наиболее часто приводят к стрессу. Принцип используемых методик состоит в том, что наказующий фактор (например, болевое раздражение), подавляет привычное для животного поведение, в результате чего создается ситуация невозможности осуществления необходимой мотивации, рассогласование желаемого и действительности, что подкрепляется страхом получения болевого раздражения. Эффект анксиолитиков заключается в преодолении страха перед наказующим фактором и в восстановлении значимого для животного поведения, что выражается в увеличении числа наказуемых ответов, например, взятий воды, несмотря на получение при этом болевых раздражений. Наиболее известной и широко применяемой методикой конфликтной ситуации, является модель в варианте Vogel (Vogel et al., 1971), создаваемая у крыс путем подавления болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса при потреблении ими воды из поилки. Методика конфликтной ситуации, созданная в НИИ фармакологии РАМН, широко использовалась для изучения действия анксиолитических веществ в эксперименте, при поиске феназепама среди новых химических соединений (Вихляев, Клыгуль, 1967, 1968; Воронина, 1979; Клыгуль,1968, Воронина и соавт., 1993, Воронина, Середенин, 2005).
Установлено, что феназепам оказывает отчетливое анксиолитическое, антистрессорное действие на поведение животных в конфликтной ситуации. Под влиянием препарата наблюдается статистически достоверное повышение наказуемых взятий воды. Животные продолжают попытки взятия воды, несмотря на получение при этом болевых раздражений. Достоверный анксиолитический эффект наблюдается при использовании феназепама в широком диапазоне доз - от 0,05 до 10 мг/кг. Анксиолитический эффект феназепама в условиях конфликтной ситуации выявляется как при внутрибрюшинном введении, так и при введении внутрь (интрагастрально). Однако, при внутрибрюшинном введении анксиолитический эффект феназепама выражен в большей степени, чем при введении внутрь (Вихляев, Воронина, 1978; Воронина и соавт. 1982, 1993). В диапазоне доз от 0,05 до 1 мг/кг анксиолитический эффект феназепама в условиях используемой модели, проявляется в чистом виде и не сопровождается седативным и миорелаксантным действием. При дальнейшем увеличении доз на анксиолитическое действие наслаивается седативный и затем миорелаксантный эффекты, что выражается в уменьшении двигательной активности крыс и в нарушении у них координации движений. По влиянию на поведение крыс в конфликтной ситуации феназепам обладает сходной активностью с лоразепамом и превосходит по активности диазепам, медазепам, гидазепам и мексидол (Воронина, 1979).
Эмоциональный стресс в конфликтной ситуации вызывает у контрольных животных нарушение показателей сердечно-сосудистой системы, что выражается по средним показателям в учащении ритма сердечных сокращений и свидетельствует о том, что большинство животных реагирует на стрессорную ситуацию тахикардией. Феназепам в дозе 1 мг/кг (внутрибрюшинно) устраняет тахикардию и увеличивает процент животных с нормальным колебанием ритма сердечных сокращений до 65% (контроль при стрессе 10%), а также вызывает нормализацию дыхания у 70% крыс. Существенно и статистически достоверно под влиянием феназепама снижается число дефекаций и уринаций, что свидетельствует о нормализующем влиянии препарата на вегетативные показатели проявления стресса. Аналогичное действие на сердечно-сосудистые, вегетативные показатели и дыхание оказывает в условиях конфликтной ситуации диазепам в дозе 2 мг/кг. Таким образом, феназепам и диазепам, наряду с устранением моторных нарушений, наблюдаемых в стрессорных условиях конфликтной ситуации, вызывает нормализацию вегетативных, сердечно-сосудистых сдвигов и дыхания (Вихляев, Клыгуль, 1968, 1973).
Анксиолитическое действие феназепама в условиях внешнего торможения лабиринтного рефлекса. Действие феназепама на поведение крыс при эмоциональном стрессе, создаваемом внешним торможением питьевых условных рефлексов, изучали с использованием методики Т образного лабиринта. Включение светового раздражителя перед выполнением 3-го рефлекса контрольными животными с выработанным навыком приводило к резкому торможению стабильной условной реакции и характеризовалось значительным увеличением (почти в пять раз) латентного времени пробежки по лабиринту. Феназепам в дозах 0,1 - 1,0 мг/кг вызывал уменьшение проявлений внешнего торможения, что выражалось в уменьшении латентного времени выполнения рефлексов и числа совершаемых ошибок (Вихляев, Клыгуль, 1967, 1977).
Получение экспериментальной лекарственной формы нанокапсулированного феназепама
В исследовании использовали мономер бутилцианоакрилата полученный из Института Фармацевтических Технологий Универсрітета им РІ.В Гете, факультета химии, биохимии и фармации (Institute for Pharmaceutical Technology Johann Wolfgang Goethe-University, Германия). Наночастицы готовили на кафедре фармакологии фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова методом , кислотной полимеризации в среде содержащей декстран 70000 (Seca med 60000, Henkel) в качестве стабилизатора (декстран 70000 в 0,1М растворе соляной кислоты). Бутилцианакрилат ("Sichel-Werke" Германия) добавляли по каплям в раствор до получения 1% суспензии. Для равномерной полимеризации полученную композицию перемешивали с помощью магнитной мешалки при скорости 500 об/мин в течение 4 ч. Образовавшуюся суспензию нейтрализовали с помощью 0ДМ раствора гидроксида натрия и фильтровали через стеклянный фильтр (размер пор 10 мкм) для удаления -крупных агломератов. Для облегчения последующего ресуспендирования наночастиц добавляли 1% раствор глюкозы.
Размер частиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K) при следующих рабочих параметрах прибора: угол светорассеяния 90 градусов, температура 25 градусов, вязкость среды 0,01 пуаз, показатель преломления среды 1,333. Для экспериментов были использованы наночастицы размером 230-250 нм. Полученную суспензию лиофилизировали посредством вакуумной низкотемпературной сушилки (Lyovac, GT 2, "Leybold AG", Германия). Технологическая схема получения наночастиц представлена на (рис. № 6).
Мономербути л ци а ноа кри л ат Перемешивание в течение 4 часов до получения однородной суспензии 1 Нейтрализация 0,1М NaOH 1 Фильтрация 1 Добавление 1% раствора глюкозы 1 Определение размера частиц Получение лиофилизированного порошка ПБЦА -наночастиц Рис. 6. Схема синтеза ПБЦА - наночастиц.2. Сорбция феназепама на поверхности ПБЦА наночастиц.Для сорбции готовили раствор феназепама по следующей методике: точную навеску феназепама т=0,1г и 2,5г твина-80 помешали в колбу, добавляли 5 мл 96% этилового спирта и 5 мл дистиллированной воды, встряхивали до полного растворения.К 1,8 мг лиофилизированных наночастиц добавляли 0,8 мл 0,9% раствора NaCl, перемешивали в течение 5 минут. К полученной композиции прибавляли 1 мл приготовленного раствора феназепама и перемешивали магнитной мешалкой в течение 5 минут. Полученную суспензию инкубировали в течение 3 часов при температуре 5-8С. Для отделения наночастиц с сорбированным феназепамом от супернатанта проводили центрифугирование со скоростью 128000g в течение 60 минут.
Процента включения феназепама в наночастицы проводили по разработанной нами методике: супернатапт отделяли от наночастиц, отфильтровывали, получали прозрачный раствор, желтоватого цвета. 1 мл полученного раствора помещали в мерную колбу на 10 мл, добавляли 1 мл этилового спирта и доводили объем раствора водой до метки, перемешивали. В две мерные колбы вместимостью 10 мл помещали по 5 мл полученного раствора. В одну колбу прибавляли 1 мл 1М раствора кислоты хлористоводородной, затем доводили объем раствора водой до метки, перемешивали. В другую колбу прибавляли 1 мл ацетатного буферного раствора, доводили объем раствора водой до метки, перемешивали.
К раствору феназепама (76,7 мг) в хлористом метилене (2,27 г) добавили 180 мкл бутилцианоакрплата. Для достижения полного растворения бутилцианоакрилата использовали шейкер (Vortex) и ультразвуковую баню. Полученный раствор количественно переносили в водную фазу (36,8 мг безводной лимонной кислоты; 2,35 г полоксамера 188; 20,65 г (мл) воды) и подвергали ультразвуковой гомогенизации (в течение 1 минуты, 70 Вт). Суспензию перемешивали на магнитной мешалке в течение 3 часов для удаления органического растворителя и полимеризации мономера, после чего фильтровали через бумажный фильтр «белая лента» и лиофилизовали.
Размер частиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K) при следующих рабочих параметрах прибора: угол светорассеяния 90 градусов, температура 25 градусов, вязкость среды 0,01 пуаз, показатель преломления среды 1,333. Полученную суспензию лиофилизировали посредством вакуумной низкотемпературной сушилки (Lyovac, GT 2, "Leybold AG", Германия).
Родамин В — вещество гидрофильного характера, в связи с чем не проникает через эндотелий кишечника и, соответственно, не обнаруживается ни во внутренних органах, ни в головном мозге. Если при введении Родамина В в матрикс наночастиц флуоресценция наблюдается в эндотелии кишечника, печени и головном мозге, это позволит сделать вывод о том, что ПБЦА наночастицы всасываются в желудочно-кишечном тракте.
Методика включения Родамина В е матрикс ПБЦА наночастиц Наночастицы получали методом кислотной полимеризации по следующей методике: к 10 мл 1% раствора декстрана с молекулярной массой 70 кДа в 0.01н хлористоводородной кислоте по каплям при постоянном перемешивании добавляли бутилцианокрилат (100 мкл). Через 30 минут после начала полимеризации добавляли водный раствор родамина В таким образом, чтобы его концентрация в полимеризационной среде составила 6 мг/мл. Полимеризацию проводили в течение 4 часов, после чего суспензию нейтрализовали ОЛн гидроксидом натрия, затем фильтровали через бумажный фильтр и лиофилизовали, используя в качестве криопротектора 3% маннит.
Парафиновый блок прочно фиксируют в объектодержателе микроатома и подводят к ножу. Подачу объектодержателя осуществляют при помощи кремальеры. Нож и блок сближают и приступают к выравниваю верхней поверхности блока путем срезания толстых срезов, для чего пользуются концом ножа. Подачу объекта ведут с помощью микровинта. После того как поверхность блока будет выровнена и обнажится ткань кусочка, переходят к получению срезов желаемой толщины, что определяется соответствующей установкой микрометрического винта. Нож передвигают с таким расчетом, чтобы резать его средней частью. Полученные срезы аккуратно снимают с лезвия и переносятся в термостат с водой (25С). Затем, срез помещали на предметное стекло, которое затем помещают в термостат на 2 часа при температуре 37-40С.
Методика изучения эффектов феназепама на наночастицах при использовании фармакологических анализаторов
С целью выяснения вопроса о возможном вовлечении ГАМК-БД рецепторного комплекса в реализацию анксиолитического действия феназепама на наночастицах были использованы анализаторы флумазенил и бикукуллин. Флумазенил - этил 8-фтор-5,6-дигидро-5-метил-6-оксо-4Н имидазо[ 1,5-а-1,4]бензодиазепин-3-карбоксилат является конкурентным блокатором специфических бензодиазепиновых рецепторов и устраняет все центральные эффекты бензодиазепиновых транквилизаторов: анксиолитический, снотворный, седативный и миорелаксантный, а таюке способствует восстановлению дыхания и сознания при передозировке бензодиазепинов (Savic at al). Исследования проводили в опытах на крысах в тесте конфликтной ситуации.
Для доказательства того, что феназепам ПБЦА наночастицах, действует через бензодиазепиновые рецепторы, исследовали комбинированное применение феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и флумазенила. Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц вводили группе животных (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг). Затем, с 15-минутым интервалом этим же крысам вводили флумазенил (внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг) и через 15 минут оценивали анксиолитическое действие, регистрируя количество наказуемых взятий воды. Крыс разбивали на группы по 10 особей: 1 группа - контрольная (животным этой группы вводили физиологический раствор NaCl с 0,1 мл 0,1% Твин-80). 2 группа - феназепам в субстанции, в дозе 1 мг/кг (приготовление раствора: 1 мг феназепама + 0,1 мл 0,1% Твин-80 + 2 мл физиологического раствора NaCl). 3 группа - феназепам в субстанции, в дозе 1 мг/кг + флумазенил 10 мг/кг 4 группа - феназепам, включенный в матрикс на ПБЦА наночастиц, в дозе 1 мг/кг. 5 группа - феназепам, включенный в матрикс на ПБЦА наночастиц, в дозе 1 мг/кг + флумазенил 10 мг/кг. Препараты вводили внутрибрюшинно, за 30 минут до эксперимента. Флумазенил вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг за 15 мин до эксперимента.
Для доказательства того, что феназепам, сорбированный на ПБЦА наночастицах или включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, действует через бензодиазепиновые рецепторы, при активации которых изменяется конформация ГАМКА рецепторов и повышается сродство ГАМКА рецепторов к ГАМК, вводили антагонист ГАМКА рецепторов бикукуллин.
Бикукуллин - алкалоид, выделяемый из растения Dicentra cucullaria, является антагонистом ГАМКА рецепторов и снижает центральные эффекты бензодиазепиновых анксиолитиков. Если после введения бикукуллина действие препарата полностью устраняется, это свидетельствует о том, что препарат действует за счет активации ГАМКА рецепторов. Феназепам, включенный в матрикс ПБЦА наночастиц вводили группе животных (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг), затем сразу же вводили бикукуллин (внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг). Через 30 минут оценивали различие анксиолитического действия (по количеству наказуемых взятий воды, по методике конфликтной ситуации) между этой группой животных и контрольными группами.
С целью изучения возможного развития толерантности и синдрома отмены были выполнены исследования с длительным (21 день) введением феназепама на ПБЦА наночастицах, или феназепама в субстанции при использовании методологии, разработанной ранее (Гарибова Т.Л., 1993).
Схема проведения эксперимента представлена на рисунке. Исследования проводили в опытах на мышах. Сначала у животных регистрировали эффекты после однократного (через 30 минут) введения веществ. Для оценки проявлений толерантности вещества вводили в течение 21 дня (один раз в день). Регистрацию эффектов проводили через 40 минут после последнего 21-го введения. Для изучения проявления синдрома отмены введение препаратов прекращали и регистрацию эффектов осуществляли через 24 часа после 21 -дневного введения препарата. Вещества вводили внутрибрюшинно в 10-11 часов утра.
Препараты вводили внутрибрюшинно, за 30 минут до эксперимента в течение 21 дня. Для оценки синдрома отмены регистрацию эффектов осуществляли на 1 день введения и через 24 часа после отмены препарата при хроническом 21 -дневном введении.
После однократного введения, длительного введения и отмены длительного введения феназепама было изучено его анксиолитическое, антиагрессивное, седативное и миорелаксантное действие. Анксиолитическое действие оценивали с помощью метода приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ), седативное - с помощью метода «открытое поле», агрессивное поведение - в тесте «драки» на электродном полу по изменению порогов агрессивной реакции. Описание методов представлено выше.
Изучение седативного действия феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназепамом в субстанции в тесте открытого поля
Крыс разбивали на группы по 8-10 животных 1 группа - контрольная (NaCl с 0,1 мл 0,1% Твин-80); 2 группа - феназепам в субстанции, в дозе 1 мг/кг, 3 группа - феназепам, сорбированный на ПБЦА наночастицах в дозе 1 мг/кг. Препараты вводили внутрибрюшинно, за 30 минут до эксперимента. Контрольные животные при помещении их в открытое поле вели себя активно, о чем свидетельствовало количество пересеченных квадратов -горизонтальная активность (20,17 ± 2,14), количество вертикальных стоек -вертикальная активность (9,33 ± 1,03) и число обследованных отверстий (12,33 ±1,21). Под влиянием феназепама в субстанции наблюдалось снижение, по сравнению с контролем, числа пересеченных животными квадратов (в 1,8 раз), количества вертикальных стоек (в 1,94 раз) и количества обследованных отверстий (в 4,4 раз). Полученные данные свидетельствуют о выраженном седативном действии феназепама в субстанции. Феназепам. сорбированный на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепам включенный в матрикс ПБЦА наночастиц практически не вызывали снижения количества пересеченных квадратов, числа вертикальных стоек и количества обследованных отверстий. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что феназепам, сорбированный на поверхности ПБЦА-наночастицах и включенный в матрикс ПБЦА наночастиц не обладают седативным действием. В то время как, феназепам в субстанции в дозе 1 мг/кг, оказывая анксиолитическое действие, обладает выраженным седативным эффектом. Таблица 4 Влияние феназепама, сорбированного на ПБЦА наночастицах и включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, в сравнении с феназепамом в субстанции на поведение крыс в тесте открытого поля. Показатели поведения Контроль (NaCl) Феназепам,сорбированный наПБЦА - нано(1 мг/кг, внб) Феназепам,включенный вПБЦА - нано(1 мг/кг, внб) Феназепам всубстанции(1 мг/кг, внб) Число горизонтальных перемещений 20,17 ±2,14 18,33 ±2,71 19,07 ±3,11 10,8 ±2,05 Число вертикальных перемещений 9,33 ± 1,03 9,17 ±1,41 10,12± 1,58 4,8 ±1,47 Число обелсдованн ых отверстий 12,33 ± 1,21 12,17 ±1,6 14,19 ±2,6 2,8 ±2,17 - различие с контролем достоверно при р 0,05 - различие с контролем достоверно при р 0,05 Рис. 26. Влияние феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц, феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы, и феназепама в субстанции в тесте открытого поля в опытах на крысах в дозе 1 мг/кг на горизонтальную активность.
Изучение миорелаксантного действия феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц и феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы в сравнении с феназенамом в субстанции. Феназепам, сорбированный на ПБЦА-наночастицах и феназепам включенный в матрикс ПБЦА наночастиц, в дозе 1 мг/кг практически не оказывал миорелаксантного действия: количество животных, неспособных удержаться на вращающемся стержне составило 10% (1 из 10 крыс). Таблица 5 Влияние феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц, феназепама, включенного в ПБЦА наночастицы, и феназепама в субстанции на координацию движений крыс в тесте вращающегося стержня Вещество Контроль (NaCl) Феназепам,сорбированный наПБЦА - нано(1 мг/кг, внб) Феназепам,включенный в ПБЦА - нано (1 мг/кг, внб) Феназепам в субстанции (1 мг/кг, внб) % падений 0 10% 0 50% Латентныйпериод падений (с) 0 79,6 0 11,2 ±18,9 - различие с контролем достоверно при р 0,05 - различие с контролем достоверно при р 0,05 Рис. 29. Влияние феназепама, сорбированного на поверхности ПБЦА наночастиц, феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц, и феназепама в субстанции в тесте вращающегося стержня, на крысах в дозе 1 мг/кг на число падений с вращающегося стержня в течение 2 мин. Заключение Таким образом, полученные данные показали, что феназепам в субстанции в дозе 0,5 и 1 мг/кг (внб) обладает выраженным анксиолитическим эффектом в тесте конфликтной ситуации, седативным действием в тесте открытого поля и вызывает нарушение координации движений в тесте вращающегося стержня. Феназепам, сорбированный на поверхности наночастиц и феназепам, включенный в матрикс наночастиц, в дозах 0,5 и 1 мг/кг (внб) оказывали сходный по выраженности с феназепамом в субстанции анксиолитический эффект в тесте конфликтной ситуации. Однако, в противоположность феназепаму в субстанции, феназепам, сорбированный на поверхности наночастиц и феназепам, включенный в матрикс наночастиц, в дозе 1 мг/кг (внб) не вызывали угнетения поведения в тесте открытого поля и миорелаксантного эффекта в тесте вращающегося стержня. Сопоставление эффектов феназепама, сорбированного на поверхности наночастиц и феназепама, включенного в матрикс наночастиц, в дозах 0,5 и 1 мг/кг (внб) выявило сходство в направленности действии этих двух веществ. Феназепам, включенный в матрикс наночастиц, обладал более выраженным достоверным анксиолитическим эффектом. Вместе с тем, феназепам, включенный в матрикс наночастиц имел меньший седативный и миорелаксантный эффект в сравнении с феназепамом, сорбированном на ПБЦА наночастицах, однако эти различия были статистически недостоверными.
Анализ данных литературы показывает, что для транспорта веществ на наночастицах используется как сорбирование вещества на поверхности ПБЦА наночастиц (Кройтер 1994, Гельперина, Аляутдин 2000) так и включение в матрикс ПБЦА наночастиц (Аляутдин и др., 1998; Alyautdin et al., 1997)
Фармацевтические исследования, проведенные нами по технологии создания феназепама включенного в матрикс ПБЦА наночастиц и феназепама, сорбированного на ПБЦА наночастицах свидетельствуют о том, что методика получения феназепама, включенного в матрикс ПБЦА наночастиц технологически более адекватна и технология его получения в этой форме более оптимальна (процент включения феназепама в матрикс ПБЦА наночастиц составил 65%, а процент сорбции 43,7%). Кроме того, результаты фармакологического исследования показали, что феназепам, включенный в матрикс наночастиц обладает достоверно более выраженным, по сравнению с феназепамом, сорбированным на поверхности наночастиц, анксиолитическим эффектом и несколько менее выраженным (различие недостоверно) седативным и миорелаксантным действием.
