Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Na/K-АТФАЗА, ЭНДОГЕННЫЕ ДИГИТАЛИСОПОДОБНЫЕ ВЕЩЕСТВА И АЛКОГОЛЬНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11
l.l. Na/K-АТФаза 11
1.2. Эндогенные дигиталисоподобные лиганды натриевого насоса 14
1.2.1. Открытие «эндогенного дигиталиса» 14
1.2.2. Ингибиторы карденолидной природы 15
1.2.3. Эндогенные буфадиенолиды 15
1.2.4. Эндогенный дигиталис и мембранная сигнализация клеток 18
1.2.5. Изоформы Na/K-АТФазы как рецепторы для эндогенного дигиталиса 19
1.2.6. Эндогенные дигиталисоподобные факторы и ЦНС 20
1.3. Клинические наблюдения 23
1.4. Этанол, Na/K-АТФаза и эндогенные дигиталисоподобные ингибиторы 26
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 32
2.1. Материалы 32
2.1.1. Экспериментальные животные 32
2.1.2 Препараты 33
2.2. Измерение активности Na/K-АТФазы и концентраций биологически активных веществ 33
2.2.1. Методы определения концентраций маринобуфагенина и оуабаиноподобных соединений в плазме крови и тканях головного мозга 33
2.2.2. Методы определения активности Ка+/К+-АТФазы в головном мозге 34
2.2.3.. Определение нейротрансмиттерных аминокислот при помощи микродиализной техники с последующим HPLC-ED анализом у крыс в условиях свободного поведения 35
2.3. Методы поведенческой фармакологии 37
2.3.1. Инициация и поддержание внутривенного самовведения веществ у мышей 37
2.3.2. Исследование дискриминативных стимульных эффектов этанола и влияния на них ингибиторов Na/K-АТФазы 42
2.4. Методы статистического анализа результатов 44
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ МАРИНОБУФАГЕНИНА НА ВНУТРИВЕННОЕ САМОВВЕДЕНИЕ ЭТАНОЛА И НИКОТИНА 46
3.1. Результаты исследования 46
3.1.1. Определение концентрации маринобуфагенина в плазме крови и тканях головного мозга 46
3.1.2. Влияние маринобуфагенина на активность Ыа+/К+-АТФазы в синаптосомах головного мозга 47
3.1.3. Влияние маринобуфагенина на внутривенное самовведение этанола у мышей 50
3.1.4. Влияние антител к маринобуфагенину на реакцию внутривенного самовведения этанола у мышей 54
3.1.5. Влияние маринобуфагенина на внутривенное самовведение никотина у мышей 57
3.2. Обсуждение результатов 61
ГЛАВА 4. ДИСКРИМИНАТИВНЫЕ СТИМУЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МАРИНОБУФАГЕНИНА, ОУАБАИНА И ДИГОКСИНА 66
4.1. Результаты исследования 66
4.1.1. Выработка дискриминативного поведения 66
4.1.2. Тесты "замещения" и "антагонизма" 67
4.2. Обсуждение результатов 71
ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ АМИНОКИСЛОТ В N ACCUMBENS У КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ НАТРИЕВОГО НАСОСА: МИКРОДИАЛИЗНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 75
5.1. Результаты исследования 76
5.1.1. Изменение концентрации аминокислот в n.accumbens под влиянием этанола 76
5.1.2. Изменение концентрации аминокислот в n.accumbens под влиянием маринобуфагенина и оуабаина 77
5.1.3. Изменение концентрации аминокислот в n.accumbens после совместного введения ингибиторов натриевого насоса и этанола 77
5.2. Обсуждение результатов 83
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 103
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
- Na/K-АТФаза
- Экспериментальные животные
- Определение концентрации маринобуфагенина в плазме крови и тканях головного мозга
- Выработка дискриминативного поведения
- Изменение концентрации аминокислот в n.accumbens под влиянием этанола
Введение к работе
Актуальность проблемы. На протяжении последних 20 лет накоплен значительный клинический и экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что различные ткани и плазма крови человека и других млекопитающих содержат эндогенные дигиталисоподобные лиганды натриевого насоса (ЭДЛНН), т.е. вещества, ингибирующие Na/K-АТФазу и обладающие дигиталисоподобной иммунореактивностью (De Wardener и Clarkson, 1985, Goto et al., 1992, Schoner, 1992).
Оуабаин-чувствительная, магний-зависимая натрий-калиевая аденозинтрифосфатаза (Na/K-АТФаза) представляет собой уникальную регуляторную систему. Na/K-АТФаза является ферментом, встроенным в мембрану и осуществляющим гидролиз АТФ. Na/K-АТФаза является также и транспортной системой, осуществляющей активный трансмембранный транспорт моновалентных катионов против градиента их концентрации. Участок аминокислотной цепи альфа-субъединицы фермента, обладая эволюционной консервативностью, является специфическим рецептором для сердечных гликозидов.
Показано, что ЭДЛНН принимают участие в регуляции сократимости миокарда, водно-солевого обмена, играют важную роль в патогенезе некоторых, преимущественно объем-зависимых, форм артериальной гипертензии. Помимо этого, существуют предположения о возможной нейрорегуляторной роли ЭДЛНН, в частности в отношении поведенческих реакций и участии в патогенезе психических заболеваний.
Растет количество доказательств, которые указывают на существование нескольких ЭДЛНН в центральной нервной системе млекопитающих (Yamada et al., 1992; Goto et al., 1995; Tymiak et al., 1993; De Lorez Arnaiz, 2000). ЭДЛНН представлены в различных отделах мозга (Yamada Н. et al, 1992; Goto et al., 1995; Tymiak et al., 1993; De Lorez Arnaiz, 2000). Содержание оубаионоподобных соединений (ОПС) изменяется при эмоциональном
7 стрессе (Goto et al., 1995), при психических заболеваниях (Grider et al., 1999). Центральное введение оубаина влияет на поведение у крыс (Li et al., 1997; Ruktanochai et al., 1998). Изменение активности натриевого насоса в различных тканях было замечено при маниакально-депрессивном психозе (Naylor et al., 1973; Rybakowski et al., 1994; El-Mallakh и Wyatt, 1995).
Есть свидетельства вовлечения ЭДЛНН в контроль настроения и в развитие алкогольной зависимости. Действие этанола может быть связано как с ингибированием, так и с активацией Na/K-AT Первым идентифицированным эндогенным ОПС был карденолид (Ludens et al., 1991). Далее были выявлены лиганды буфодиенолидной структуры (Goto et al., 1991; Lichtstein et al., 1993, Hilton et al., 1996; Sich et al., 1996). Стероидные соединения класса буфадиенолидов являются эндогенными ингибиторами Na/K-АТФазы, которые синтезируются в паротидных железах и коже амфибий (Barbier et al., 1959; Flier, 1978) и являются регуляторами чрезкожного транспорта натрия, действующими за счет влияния на активностьКа/К-АТФазы. Было показано (Bagrov et al., 1993), что яд жаб Bufo marinus имеет в своём составе буфадиенолиды, среди которых нас особенно заинтересовал селективный лиганд альфа-1 изоформы натриевого насоса - маринобуфагенин (МБГ) (Bagrov et al., 1995). Позже МБГ был описан у млекопитающих (Bagrov et al.,1998, Fedorova et al., 2000). Примечательно, что экскреция МБГ у крыс под действием этанола возрастает, а активная иммунизация животных против МБГ вызывает повышение потребления этанола в условиях свободного выбора (Bagrov et al., 1999). Таким образом, учитывая данные об эндогенной природе буфадиенолидов, их участии в регуляции активности натриевого насоса, изменении функции данного энзима под влиянием этанола и при психопатологии представлялось целесообразным исследовать фармакологические свойства маринобуфагенина на экспериментальных моделях аддиктивного поведения в условиях, доказывающих их центральный эффект. Цель исследования. Цель данной работы заключалась в изучении фармакологических эффектов ингибитора альфа-1 изоформы натриевого насоса маринобуфагенина на экспериментальных моделях, используемых для оценки аддиктивного потенциала алкоголя. Основные задачи исследования: 1. Определить способность маринобуфагенина проникать в ЦНС и ингибировать Na/K-АТФазу в синаптосомах головного мозга. Исследовать собственное влияние маринобуфагенина и оубаина, а также эффект их совместного введения с этанолом на уровень нейротрансмиттерных аминокислот в прилежащем ядре перегородки головного мозга. Изучить влияние маринобуфагенина и антител к нему на подкрепляющие свойства этанола. Изучить влияние маринобуфагенина на дискриминативные стимульные свойства этанола. Положения, выносимые на защиту: Эндогенные нейроактивные дигиталисоподобные стероиды являются модуляторами мотивационно-подкрепляющих эффектов этанола и, возможно, других аддиктивных средств. Активность натриевого насоса в ткани мозга, зависящая от уровня его эндогенных лигандов, является одним из факторов патогенеза алкогольной зависимости. Эндогенный буфадиенолид маринобуфагенин вызывает диссоциацию мотивационно-подкрепляющих и дискриминативных стимульных свойств этанола. Маринобуфагенин способен повышать активность глутаматергической системы, что может отражать потенциальный нейротоксический эффект данного соединения. Одновременно маринобуфагенин вызывает компенсаторную защитную реакцию в форме повышения уровня таурина. Экспериментально-наркологическое исследование нейроактивных аналогов эндогенных дигиталисоподобных веществ является новым направлением изыскания средств фармакотерапии в наркологии. Научная новизна работы. Впервые доказано модулирующее влияние уровня активности натриевой помпы на первично-подкрепляющие свойства этанола на основе анализа эффектов эндогенного ингибитора маринобуфагенина и антител к нему. Впервые доказана способность маринобуфагенина проникать в мозг и ингибировать Na/K-АТФазу мозговой ткани. Впервые показано, что ингибирование Na/K-АТФазы маринобуфагенином не воспроизводит дискриминативные стимульные свойства этанола и не изменяет их при совместном введении двух веществ. Впервые показано, что ингибирование натриевого насоса приводит к повышению внеклеточной концентрации глутамата и таурина в прилежащем ядре перегородки. Обоснована гипотеза об уровне активности системы «Na/K-АТФаза -эндогенные лиганды» как факторе предрасположенности к формированию алкогольной зависимости. Научно-практическая ценность работы. Теоретическая ценность работы заключается в экспериментальном доказательстве связи между активностью Na/K-АТФазы и подкрепляющими свойствами этанола, что 10 позволяет рассматривать активность системы «Na/K-АТФаза и ее эндогенные лиганды» в качестве фактора, влияющего на предрасположенность к формированию алкогольной зависимости. Практическая ценность работы состоит в создании нового направления поиска лекарственных средств для терапии алкогольной зависимости среди лигандов натриевого насоса. Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, в исследовательскую работу лаборатории мембранных барьеров Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН; в деятельность областного наркологического диспансера. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001); Северо-Балтийских курсах по нейробиологии зависимости (Турку, Финляндия, 2001); Межрегиональной научно-практической конференции «С.-Петербургские научные чтения» (С.-Петербург, 2001, 2002, 2004); IV Международной конференции «Современные проблемы наркологии» (Москва, 2002); Сессии института фармакологии им. А.В. Вальдмана СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (С.-Петербург, 2003, 2004); на научных заседаниях института фармакологии им АВ. Вальдмана и отдела психофармакологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2001-2004). По результатам исследования опубликовано 10 работ. Na/K-АТФаза - ключевой мембранный фермент, который состоит из трех главных полипептидов: альфа-, бета- и гамма субъединиц. Альфа субъединица ( 112 kDa) ответственна за каталитические и транспортные свойства фермента и содержит участки связывания для катионов, АТФ, дигиталисоподобных ингибиторов и сердечных гликозидов (Lingrel и Kuntzweiler, 1994; Mercer, 1993; Pedemonte и Kaplan, 1990). Бета субъединица (40-60 kDa) важна для нормальной деятельности фермента (Blanco et al., 1994; McDonough et al., 1990) и обеспечивает модуляцию сродства фермента к К+ и Na+. (Blanco et al., 1995). Третий белок, субъединица гамма (8-14 kDa) (Forbush et al., 1978), сопряжен с альфа субъединицей и проявляет высокую межвидовую гомологичность (Blanco, Mercer, 1998). Несмотря на доказательство, что гамма субъединица может модулировать функцию Na/K-АТФазы, роль данной субъединицы до конца не понята (Beguin et al., 1997). Различные гены кодируют определенные молекулярные формы как альфа-, так и бета-полипептидов (Fambrough, 1988; Lingrel et al., 1990; Lingrel и Kuntzweiler, 1994). Факт существования изоформ натриевого насоса был выявлен в результате экспериментов, в которых анализировали чувствительность Na/K-АТФазы грызунов к препаратам дигиталиса. Было показано, что кривые угнетения Na/K-АТФазы в мозгу мыши оуабаином имеют гетерогенный характер, что указывало на то, что угнетение происходило на уровне нескольких мест связывания (Marks, Seeds, 1978). В сравнении с почечной Na/K-АТФазой, ингибирование мозговой Na/K-АТФазы происходило на уровнях высоко- (Ki «100 нмоль/л) и низко- (Кі « 100 мкмоль/л) аффинного связывания. Структурное доказательство гетерогенности натриевого насоса было найдено у морской креветки, у которой альфа субъединица могла бы быть разделена на две отличные друг от друга формы в додецил сульфат SDS-полиакриламидном геле (Peterson et al., 1978). Первая демонстрация изоформ Na/K-АТФазы у млекопитающих была выполнена Sweadner (1979), которая нашла две формы альфа субъединицы, почечной альфа формы и мозговой формы, которая была названа альфой +. Эта новая каталитическая субъединица фермента показала более высокую чувствительность к оуабаину (Sweadner, 1979). Было предположено, что структурные различия в NH2 концевой терминали альфы и альфы + могут иметь генетическую основу (Lytton, 1985). Впоследствии, применение методов молекулярной биологии позволило идентифицировать три альфа -полипептида у позвоночных, теперь известных как альфа-1, альфа-2, и альфа-3 (Shull et al., 1985, 1986; Sverdlov et al., 1987). Совсем недавно была идентифицирована четвертая альфа изоформа (альфа-4) в яичке крысы (Shamraj и Lingrel, 1994). Лабораторные крысы. Эксперименты выполнены на 80 самцах крыс линии Вистар массой 280-350 г (питомник РАН "Рапполово", Лен. область, Россия, питомник Католического Университета города Левен, Лувен ля Нув, Бельгия). Животных содержали в условиях 24-х часового фоторежима (12 ч день: 12 ч ночь, включение света в 9.00), контролируемой температуры (22±2С) (кондиционер «Panasonic») и влажности (65±10%) воздуха при свободном доступе к очищенной воде (фильтр «Аквафор В-150», С.Петербург) и стандартному корму (гранулированный комбикорм, агрофирма «Волосово», Лен. область). Исключение составляли эксперименты с применением пищевого подкрепления (оперантная методика), когда доступ крыс к пище ограничивали (подробности см. ниже). Для содержания животных использовали стандартные пластмассовые клетки Т-3 (47x35x17 см) с проволочной металлической крышкой и подстилкой из стружки дерева хвойных пород. Все животные были приучены к рукам экспериментатора до начала экспериментов. Лабораторные мыши. В экспериментах использовано 280 беспородных мышей-самцов и линии DBA/2 массой 20-30 г (питомник РАН «Рапполово», Лен. область, Россия). Животных содержали в стандартных лабораторных условиях с неограниченным доступом к пище и воде в виварии с регулируемым световым режимом (12 ч свет/ 12 ч темнота), температурой 22С и влажностью 60%. Эксперименты были выполнены на самцах мышей линии DBA/2. Методика измерения концентраций МБГ и оуабаиноподобных веществ была изложена в разделе 2.3. В течение 30 минут после в/б введения МБГ в дозах 1,25 и 2,5 мкг/кг массы тела животного происходило достоверное параллельное увеличение уровня МБГ как в плазме (Рис.3.1, А), так и в коре головного мозга (Рис.3.1, Б). Также достоверно повышалась и плазменная концентрация оуабаиноподобного соединения (ОПС) (Рис.3.1, В), в то время как уровень ОПС в коре головного мозга достоверно не изменялся (Рис.3.1, Г). Как и следовало ожидать, в самом начале обучения вероятность «этанольного» ответа, т.е. выбора того отверстия оперантного блока, которое было ассоциировано с предварительным введением этанола и предъявлением пищевого подкрепления после выполнения оператной реакции, была приблизительно одинакова после инъекций «физиологического» раствора и этанола и составляла примерно 50%. В результате обучения и постепенной выработки дискриминативного поведения вероятность выбора «этанольного» отверстия после введения «тренировочной дозы» этанола (1 г/кг) достигла 100%, в то время как вероятность выбора «этанольного» отверстия после введения растворителя составляла 0% (рис. 4.1, А). Таким образом, удалось получить полное различение дискриминативных стимульных свойств этанола и растворителя. Введение этанола в дозе 1 и 2 г/кг вызывало повышение уровня ингибиторной бета-аминокислоты таурина в течение первых 20 (F(2,22)=6,31; р=0,0075) и 40 (F(2,23)=3,66; р=0,045) минут после в/б инъекции (рис. 5.1, Б). Post hoc анализ (тест множественного сравнения Даннета) подтвердил достоверность влияния этанола в дозах 1 и 2 г/кг в первые 20 минут после введения (р 0,05), а также отличия дозы этанола 2 г/кг через 40 минут после введения (р 0,05) по сравнению с контрольной группой, которая получала растворитель. Двухфакторный параметрический анализ с последующими повторными измерениями (two-way ANOVA with repeated measure) не показал достоверный эффект фактора дозы этанола на внеклеточную концентрацию глутамата (р=0,23) (рис. 5.1, А) в прилежащем ядре, что также подтверждается предварительными исследованиями (de Witte, 1996; Dahchour и de Witte, 1994, 1995, 1998, 2000).Na/K-АТФаза
Экспериментальные животные
Определение концентрации маринобуфагенина в плазме крови и тканях головного мозга
Выработка дискриминативного поведения
Изменение концентрации аминокислот в n.accumbens под влиянием этанола
Похожие диссертации на Изучение эффектов эндогенного ингибитора Na/K-АТФ-азы на экспериментальных моделях алкогольной зависимости
