Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11-37
1.1. Механизмы антибактериального эффекта бета-лактамных антибиотиков 11
1.2. Влияние антибиотиков на функциональное состояние фагоцитирующих клеток, продукцию N0 и воспаление 25
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 38-46
2.1. Экспериментальные животные 38
2.2. Изучаемые лекарственные средства 38
2.3. Дозы и схемы введения бета-лактамных антибиотиков 39
2.4. Изучение функционального состояния НГ периферической крови.40
2.5. Определение содержания нитритов в супернатанте перитонеальных макрофагов мышей 41
2.6. Анализ содержания нитратов и нитритов в крови 42
2.7. Исследование экскреции стабильных конечных метаболитов оксида азота с мочой у крыс 44
2.8. Моделирование острого асептического воспаления 44
2.9. Этологические методы исследования 46
2.10. Статистическая обработка результатов 46
ГЛАВА 3. Собственные исследования 47-103
3.1. Влияние бета-лактамных антибиотиков на функциональное состояние НГ периферической крови мышей 47
3.2. Влияние бета-лактамных антибиотиков на макрофагальную продукцию N0, нитроксидемию и нитроксидурию у экспериментальных животных 54
3.3. Влияние бета-лактамных антибиотиков на острое асептическое воспаление у мышей 75
3.4. Анализ психотропных эффектов бета-лактамных антибиотиков во взаимосвязи с их влиянием на острое асептическое воспаление 85
Заключение 98-115
Выводы 116
Список литературы 118-140
- Влияние антибиотиков на функциональное состояние фагоцитирующих клеток, продукцию N0 и воспаление
- Определение содержания нитритов в супернатанте перитонеальных макрофагов мышей
- Моделирование острого асептического воспаления
- Влияние бета-лактамных антибиотиков на макрофагальную продукцию N0, нитроксидемию и нитроксидурию у экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бета-лактамные антибиотики являются широкой группой средств антибактериальной терапии, включающей исторически первый антибиотик - пенициллин (Навашин СМ., Навашин П.С, 1993; Яковлев СВ., 2001). Длительное применение антибиотиков данной группы вызвало закономерное развитие устойчивости бактериальных патогенов к бета-лактамам, что обусловило разработку новых средств бета-лактамной структуры. В настоящее время наряду с пенициллинами группа бета-лактамных антибиотиков включает цефалоспорины, монобактамы и карбапенемы (Назаров А.Д., Желаев А.А., 1991; Beaucaire G., 1999). Непрерывная разработка новых препаратов этой группы позволяет успешно решать проблемы устойчивости микроорганизмов к средствам антибактериальной терапии (Сидоренко СВ.,1999; Гиссенс И.К., 2001). Благодаря широкому спектру противомикробного действия современные бета-лактамы рассматриваются как средства выбора для эмпирической терапии нозокомиальных и хирургических инфекций (Савицкая К.И., Насонов В.Н.и соавт., 1993; Яковлев СВ. 1999; Белобородов В.Б., 2002).
Инфекционная патология, для лечения которой используются бета-лактамные антибиотики, связана с развитием острого воспалительного процесса, главными эффекторами которого являются фагоцитирующие клетки (нейтрофильные гранулоциты [НГ] и мононуклеарные фагоциты) (Никитин А.В.,Смолкина Т.В., Йорданова А.И., 2001; Сидоренко СВ., 2001). В литературе достаточно широко представлены сведения о влиянии бета-лактамов на функциональное состояние фагоцитирующих клеток (Априкян B.C., 1992; Абдрашитова Н.Ф., Романов Ю.А., 2001). Зачастую эти сведения являются весьма противоречивыми и не позволяют составить однозначного представления о влиянии бета-лактамов на эффекторы воспалительного процесса. При этом практически отсутствуют данные о влиянии бета-
лактамов на чувствительность к асептическим флогогенам, которые широко используются в экспериментальных фармакологических исследованиях для скрининга средств с антифлогистической активностью. Имеются лишь единичные указания на наличие противовоспалительного действия у антибиотиков пенициллинового ряда (Голиков П.П., 2002). Современные группы бета-лактамов (цефалоспорины и карбапенемы) до настоящего времени не изучались на предмет противовоспалительной активности в условиях действия асептических флогогенов.
Отдельного внимания заслуживает рассмотрение состояния нитроксидергических процессов под влиянием антибактериальных средств бета-лактамной структуры. В литературе отмечается либо отсутствие сдвига нитроксидергических процессов (Pallister С.J., Lewis К.J.,2000) , либо их подавление при введении пенициллинов и карбапенемов (Smith A.L., 1998). Иначе обстоит ситуация с цефалоспоринами. Установлено, что низкие дозы цефодизима стимулируют продукцию NO, а высокие оказывают противоположное действие (Deby-Dupont G., Mathy Hartert М., Deby С, 1995). В большинстве публикаций, посвященных нитроксидергическим эффектам антибиотиков, рассматриваются вопросы цитокин-опосредованной регуляции iNOS (EiglerA., Endres S., 1997; Фрейндлин И.С., 1999; Nelson S. 2001). К сожалению, отсутствуют исследования, посвященные рассмотрению взаимосвязей между нитроксидергическими эффектами, фагоцитотропным действием и сдвигами реактивности к флогогенным воздействиям при введении бета-лактамов. При этом следует подчеркнуть, что гиперэкспрессия iNOS, сопровождающаяся избыточной продукцией NO, является важным механизмом развития воспалительного отека и нарушений системы гемодинамики при тяжелой воспалительной патологии (Бондаренко В.М., Виноградов НА, Малеев В.В.,1999; Kirikae Т., 1998; Ванин А.Ф., 2000).
Известно, что риск инфекционно-воспалительных осложнений после
плановых хирургических вмешательств существенно зависит от
предоперационного психоэмоционального состояния больного
(Волчегорский И.А., Попов А.Н., 2001, 2002; Попов А.Н., 2001). С другой стороны, давно установлена способность бета-лактамов увеличивать возбудимость нейронов (Романова Н.Н.,1990; Saez-Liorens X., 1995). Это действие антибиотиков традиционно рассматривается в контексте их нежелательных побочных действий. Однако нельзя исключить, что нейротропные эффекты бета-лактамов могут, оказаться потенциально полезными для коррекции проявлений «поведения болезни», закономерно сопровождающих острый воспалительный процесс (Dantzer R. et al.,1998). Не исключено также, что стимулирующее влияние бета-лактамов на ЦНС может повлиять на чувствительность организма к острым флогогенным воздействиям.
Таким образом, целенаправленное изучение взаимосвязей между влиянием бета-лактамных антибиотиков на функциональное состояние фагоцитирующих клеток, интенсивность нитроксидергических процессов, психоэмоциональный статус и поведение, а также чувствительность к флогогенам является актуальной задачей экспериментальной фармакологии.
Цель работы. Исходя из вышеизложенного, в работе была поставлена цель: исследовать фагоцит-зависимые и нитроксидергические механизмы влияния бета-лактамных антибиотиков (ретарпена, цефтазидима и тиенама) на чувствительность к асептическим флогогенам и поведение экспериментальных животных.
Задачи работы. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить влияние бета-лактамных антибиотиков (ретарпена,
цефтазидима и тиенама) на показатели фагоцитарной реакции и НСТ-теста
нейтрофильных гранулоцитов (НГ) крови мышей.
2. Изучить влияние ретарпена, цефтазидима и тиенама на NO-
продуцирующую активность перитонеальных макрофагов (МФ) мышей.
3. Изучить влияние ретарпена, цефтазидима и тиенама на показатели
нитроксидемии мышей и нитроксидурии крыс.
4. Изучить действие ретарпена, цефтазидима и тиенама на выраженность острого асептического воспаления с использованием моделей формалинового, декстранового и серотонинового отеков.
5. Изучить влияние ретарпена, цефтазидима и тиенама на длительность иммобильности мышей в тесте подвешивания мышей за хвост и их поведение в «открытом поле».
6. Изучить взаимосвязи между влиянием бета-лактамных антибиотиков
на функциональное состояние фагоцитирующих клеток,
нитроксидергические процессы, поведение животных и их устойчивость к действию асептических флогогенов.
Научная новизна. Впервые показано, что угнетающее влияние бета-лактамных антибиотиков на фагоцитарную реакцию и кислород-зависимый метаболизм НГ является механизмом антифлогистического действия ретарпена, цефтазидима и тиенама в условиях острого воспалительного процесса. Продемонстрирован параллелизм между влиянием бета-лактамов на NO-продуцирующую функцию перитонеальных МФ и нитроксидемическими эффектами изученных антибиотиков. Показано угнетающее влияние бета-лактамных антибиотиков на бемитил- и продигиозан-индуцированный прирост продукции N0 МФ и сопутствующее увеличение нитроксидемии.
Впервые продемонстрировано стимулирующее влияние ретарпена, цефтазидима и тиенама на поведение мышей в «открытом поле». Установлено, что подоплекой стимуляции поведения под действием бета-лактамных антибиотиков является их антидепрессивная активность. Впервые выявлено, что чувствительность экспериментальных животных к серотониновому отеку отражает их устойчивость к экспериментальному депрессогенному воздействию. Впервые продемонстрирована взаимосвязь между психотропным действием бета-лактамных антибиотиков и их влиянием на устойчивость к асептическим флогогенам.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы связана с характеристикой ранее неизвестных аспектов фармакодинамики бета-лактамных антибиотиков. Полученные результаты могут рассматриваться как теоретическая база для оптимизации клинического использования бета-лактамов с учетом их антифлогистической активности и стимулирующего влияния на состояние центральной нервной системы.
Положения, выносимые на защиту.
Введение бета-лактамных антибиотиков (ретарпена, цефтазидима и тиенама) интактным экспериментальным животным вызывает снижение показателей фагоцитарной реакции и НСТ-теста НГ крови, снижает N0-продуцирующую функцию перитонеальных МФ и увеличивает устойчивость животных к действию асептических флогогенов.
Введение бета-лактамных антибиотиков (ретарпена, цефтазидима и тиенама) экспериментальным животным оказывает антидепрессивный эффект и увеличивает показатели поведенческой активности в «открытом поле».
3. Выраженность стимулирующего влияния бета-лактамных антибиотиков на
поведение зависит от их гипонитроксидемической и антифлогистической
активности.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах международной конференции «Медицинская иммунлогия» (Москва, 1999), VI Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999), XXXI научно-практической конференции «Современные проблемы медицины и биологии» (Курган, 1999), международной конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биология. Ветеринария.» (Екатеринбург, 1999), конференции «Вклад молодых ученых и специалистов в развитие науки и культуры» (Челябинск, 2000),научной сессии «Актуальные проблемы
медицинской науки и профессионального образования» (Челябинск, 2000), научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центр.-Черноземного научного центра РАМН (Курган, 2002), III -ей Конференции Иммунологов Урала (Челябинск, 2003), конференции, посвященной 10-летию НГЩ диагностики, лечения и профилактики дисбактериозов НИИ Иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ «Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов» (Челябинск, 2004).
Апробация работы состоялась на научном заседании кафедры фармакологии ГОУ ВПО ЧелГМА МЗ РФ при участии сотрудников кафедр биохимии и микробиологии.
Влияние антибиотиков на функциональное состояние фагоцитирующих клеток, продукцию N0 и воспаление
Оксид азота (NO) - соединение свободнорадикальной структуры, являющееся одним из главных «орудий» антипатогенной активности клеток (макрофаги, моноциты, нейтрофилы, гепатоциты, глиоциты, эндотелиоциты и др.), которые участвуют в обеспечении устойчивости организма к инфекционной патологии ( Dawson V.L., Dawson Т.М. et al., 1991; Aggarwal В., Metha К., 1996; Маеда X., Акаике Т., 1998; Бондаренко В.М., Виноградов Н.А., Малеев В.В.Д999). NO убивает множество типов патогенов или останавливает их рост (вирусы, бактерии, грибы, простейшие, паразиты, раковые клетки) ( Маляр К.В., 2000; Проскуряков С.Я., Бикетов СИ. и соавт., 2000).
Физико-химические свойства, синтез, особенности метаболизма и биохимичекая активность NO к настоящему времени изучены довольно подробно (Брюне Б., 1998; Ванин А.Ф., 2000). NO является неорганическим соединением со свойствами радикала, газообразным при нормальных условиях, синтезируется ферментами со свойствами NO-синтаз (Bredt D.S., Snyder S.H., 1994; Furchgott R.F., 1996; Марков Х.М., 1996; Башкатова В.Г., Раевский К.С., 1998; Ванин А.Ф., 1998; Реутов В.П., Сорокина Е.Г.,1998) , которые в присутствии кофакторов окисляют гуанидиновую группу L-аргинина до NO.
Существует несколько изоформ NOS: нейрональная (nNOS), или тип 1, эндотелиальная (eNOS), или тип 2, и индуцибельная (iNOS) (Северина И.С., 1998; Сафронов Ю.А., 2000). Изоформы отличаются друг от друга локализацией в организме и способом активации. Тип 1 (нейрональная изоформа) и тип 2 (эндотелиальная изоформа) являются конституитивными (cNOS). Они обеспечивают синтез N0 в нормальных условиях. Индуцибельные формы (iNOS) в нормальных условиях неактивны. Синтез их увеличивается в ответ на действие патогенных стимулов (Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs F.A., 1991; Win К. et al., 1996; Виноградов H.A., 1997; Урзаев A.X., Зефиров А.Л., 1999; Захарова М.А., 2001).
Индуцибельная NO-синтаза контролирует образование NO в количествах, в сотни тысяч раз превышающих концентрацию NO, контролируемую конститутивной NOS (Башкатова В.Г.и др.,1997; Горрен А.К.Ф., Майер Б. 1998). Уровень образования NO нередко достаточен для подавления микробов в организме хозяина, но он излишне активирует внутриклеточные мишени NO (Eiserich J., 1998). Гиперпродукции же NO отводится большая роль в развитии воспаления, а также гипотонии при инфекционно-токсическом шоке (Liew F., 1995; Стокле Ж.-К. и др., 1998; Волин М.С. и др., 1998; Вальц В.О., 2000; Меньшикова Е.Б. и др., 2000). Важно добавить, что гиперпродукция NO под действием липополисахаридов (LPS) угнетает образование кортикотропин-рилизинг -гормона (Clancy R.M., 1995; Moilanen E., 1995; Berczi I., 1998), являющегося центральным эффектором гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, роль которой в ограничительной регуляции воспаления общеизвестна (Хмельницкий O.K., Белянин В.А.,1984; Фрейндлин И.С., Назаров П.Г. 2000).
Очевидно, что модулирование активности iNOS (прежде всего макрофагальной) и содержания NO в организме является эффективным подходом к фармакологической коррекции острой воспалительной патологии (Малышев И.Ю., 1997; Манухина Е.Б. и др., 1999; Кульчицкий СВ., 2000; Смирин Б.В. и др., 2000; Destache C.J., 1998; Drapler J., 1995; Evans С, 1995).
Успех антибактериальной терапии зависит от координации взаимодействия между противомикробными средствами и системой мононулеарных фагоцитов ( Гуськова Т.А., 1990; Никитин А.В., 1999; Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н., 1999; Сидоренко СВ., 2000;2001; Смоленов И.В., 2002).
Иммуномодулирующие свойства антибиотиков определяются сложными многофакторными зависимостями. Это определяет необходимость разработки адекватных методических подходов к оценке иммунотропных эффектов антибактериальных средств в эксперименте и клинике (Смолкина Т.В.,1993; Couper M.R., 1997; Craig W.A., 1998; Janaro A. et al., 2000).
В случае бактериальных, вирусных и грибковых инфекций основными индукторами иммунных и воспалительных реакций являются структурные компоненты микроорганизмов или продукты их жизнедеятельности. В качестве примера можно привести каскад реакций, возникающих при воздейтвии липополисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий (Lee Hand W., L. Hand D., 1990). При попадании в кровоток ЛПС взаимодействуют с ЛПС-связывающим белком с образованием комплекса, который затем связывается с рецептором CD 14 на поверхности моноцитов и макрофагов (Gould I.M.,1998). Это взаимодействие приводит к активации клеток, экспрессии провоспалительных цитокинов и выделению их в кровоток. Данные медиаторы рекрутируют макрофаги, лимфоциты, тромбоциты в очаг поражения (Labro М.Т., 1998), а также активируют ряд факторов свертывания крови (Labro М.Т., 1994; Pallister С.J., Lewis KJ.,1998). Одновременно развивается и противовоспалительная реакция, регулирующая баланс двух разнонаправленных процессов (Маянский А.Н., 1989). Основными провоспалительными цитокинами являются IL-lb, TNFcr, а также IL-2,6,8,9,11,16 и 17 (Smith A.L.,1998). Эти цитокины стимулируют мобилизацию нейтрофилов из костного мозга и продукцию N0 макрофагами (Kostoglou-Athanassiou I. et al., 1998). Цитокины стимулируют синтез лейкотриенов, тромбоксана А2 и простагландинов. IL-lb активирует образование интерферона, IL-2 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМКСФ) (Smith W.S. et al., 1995). TNFa активирует систему комплемента, гемокоагуляцию, вызывает расширение сосудов, повышение сосудистой проницаемости, активацию полиморфноядерных лейкоцитов и тучных клеток, МФ и тромбоцитов (Маянский Д.Н., Урсов И.Г., 1997). Наряду с этим усиливается экспрессия молекул адгезии на лейкоцитах и клетках эндотелия, миграция лейкоцитов, выделение белков теплового шока, тормозящих повреждение клеток вследствие оксидативного стресса и хемокинов, оказывающих выраженное стимулирующее действие на хемотаксис и активацию лейкоцитов. К цитокинам и медиаторам с провоспалительным действием относят трансформирующий фактор роста бета, растворимые рецепторы TNFtf, рецепторный антагонист IL-lb, а также IL-3,4,10,13 (Sachar E.J. et al., 1976; Маянский Д.Н., 1991; Pallister С J., Lewis K.J., 2000).
Определение содержания нитритов в супернатанте перитонеальных макрофагов мышей
О функциональном состоянии НГ крови судили по показателям метаболизма кислорода (НСТ-тест) и фагоцитарной реакции. Для регистрации НСТ-теста использовался модифицированный метод А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана (1979). В гепаринизированные пробирки с 0,2 мл крови добавляли ОД мл 0,2% раствора НСТ («Reanal», Венгрия) в ОД М фосфатном буфере (рН 7,4). После 30-минутной инкубации при температуре 37 С к реакционной смеси добавляли 3 мл ОД Н соляной кислоты для остановки реакции. Пробирки центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадка готовили мазки. После высушивания фиксировали метанолом и окрашивали 0,1% водным раствором сафранина в течение 5 мин. Учет реакции производили с помощью светооптической микроскопии при увеличении х 1350. Подсчитывали количество диформазан-содержащих клеток с одновременной полуколичественной оценкой распространенности гранул диформазана в цитоплазме НГ.
Активность НСТ-теста выражали в виде процентной доли диформазан-положительных клеток, интенсивность (в условных единицах) рассчитывали по формуле G. Astaldi и L. Verga (1957): , Где а - процентное содержание клеток без гранул диформазана; b -процентное содержание клеток, в которых гранулы диформазана занимают 25-30% цитоплазмы; с - процентное содержание клеток, цитоплазма которых покрыта диформазаном на 30-70%; d - процентная доля клеток, у которых более 70% цитоплазмы занято диформазаном.
Параллельно оценивали показатели «спонтанного» и «индуцированного» НСТ-теста. Изучение «индуцированного» НСТ-теста проводилось так же, как и «спонтанного» НСТ-теста, но с дополнительным внесением 20 мкл взвеси монодисперсного полистирольного латекса, с диаметром частиц 1,7 мкм в концентрации 1x109 частиц/мл. Постановка реакции и учет ее результатов производились вышеуказанным способом.
На тех же препаратах, в которых учитывали показатели «индуцированного» НСТ-теста, проводилась регистрация параметров фагоцитарной реакции. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза - процент НГ, захвативших хотя бы 1 частицу латекса; интенсивность фагоцитоза - число поглощенных микросфер латекса на 1 НГ; фагоцитарное число - число поглощенных микросфер латекса на 1 фагоцит (Долгушин И.И., 1982; Волчегорский И.А. и соавт., 2002)
После интраперитонеального введения 1 мл 3% раствора тиогликолята было проведено промывание брюшной полости мышей 5 мл БІРМІ с гепарином 5 ЕД/мл. Полученную клеточную взвесь вносили в силиконизированные пробирки и ресуспензировали в этой же среде. Затем проводили подсчет макрофагов под микроскопом в камере Горяева, после окрашивания 0,1% раствором метиленовой синим в 3,3% уксусной кислоте. Потом 6 х 105 клеток (МФ) в 0,2 RPMI с добавлением пенициллина (100 ЕД/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), L-глютамина (0,3 мг/мл) и 10% фетальной сыворотки вносили в каждую ячейку планшеты для иммунологических реакций. Планшету помещали на 2 часа в газопроточный термостат ГПИ-01, обеспечивающий деконтаминацию воздуха, с 5% содержанием углекислого газа в воздушной среде и температурой 37 С. Затем планшет вынимали из термостата и в условиях стерильного ламинарного шкафа СМИ-130 содержимое ячеек извлекали с последующим их 2-х-кратным промыванием от неприлипших клеток средой RPMI. В каждую ячейку добавляли по 200 мкл RPMI с пенициллином, стрептомицином, L-глютамином и фетальной сывороткой в пропорциях, указанных выше, а также LPS Е. Coli в конечной концентрации 10 нг/мл. Последний компонент вносили с целью стимуляции макрофагальной продукции NO. Затем планшет вновь помещали в газопроточный термостат на 48 часов при температуре 37С. По истечении этого срока, пробы доставали из термостата, по 100 мкл супернатанта МФ переносили в каждую ячейку другого планшета, затем добавляли составляющие реактива Грисса: 50 мкл 1% раствора сульфаниламида (белого стрептоцида) и 50 мкл 0,1% раствора N-нафтилэтилендиаминди-гидрохлорида (НЭДА). Через 10 мин. инкубации полученной смеси при комнатной температуре, определяли экстинцию полученного раствора при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов расчитывали по калибровочной кривой.
Концентрация конечных стабильных метаболитов NO в крови (нитратов и нитритов) отражает, по мнению многочисленных исследователей, уровень продукции эндогенного оксида азота в организме (Chiuech С. Et al., 1994; Shiraishi I. Et al., 1997; Lincoln J.,et al., 1997). Данный непрямой метод определения NO широко распространен в фармакологических исследованиях и считается адекватно отражающим реальный уровень продукции эндогенного оксида азота в организме. Он основан на фотометрическом анализе продуктов реакции на нитрит-анион с- реагентом Грисса - раствором сульфаниламида и N - (І)-нафтилзтилендиамина в 2,5% ортофосфорной кислоте. Реакция дает окрашенный диазопродукт с максимумом поглощения при длине волны 548 нм (Moncada S., 1999). Обычно соотношение нитритов и нитратов в крови млекопитающих составляет 1:10. Хотя содержание нитрит-аниона менее подвержено влиянию состояния питания, при необходимости для более полного выявления образования NO измеряют и содержание нитрат-аниона. С этой целью NO3-, секретируемый в биологические жидкости восстанавливают губчатым кадмием, который получают из сернокислого кадмия с добавлением цинковых гранул и соляной кислоты.
Второй этап исследования конечного содержания нитритов и нитратов в биологических субстратах заключался в испытании рабочей способности изготовленной указанным выше способом редукционной колонки, где вместо фильтрата, изготовленного из исследуемых проб, применяли стандартный раствор сернокислого кадмия.
Моделирование острого асептического воспаления
Бета-лактамные антибиотики широко применяются в качестве этиотропной терапии для лечения острой воспалительной патологии, обусловленной бактериальной инфекцией. Однако в литературе имеются данные об их возможном влиянии на патогенез воспалительного процесса (Голиков П.П., 2002). Исходя из того, что центральными эффекторами острого воспалительного процесса являются нейтрофильные гранулоциты (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989), мы сочли целесообразным изучить влияние различных доз и схем применения бета-лактамных антибиотиков на функциональное состояние этих клеток.
В результате проведенного исследования было установлено, что пролонгированный препарат представителя первой генерации бета-лактамов (и антибиотиков вообще) - ретарпен выражено влияет на функцию нейтрофилов периферической крови. Как видно (таб. № 2.) наименее выраженные эффекты ретарпена в отношении функционального статуса НГ были отмечены при наименьшей из использованных доз. Однократное введение 10 мг/кг этого антибиотика привело к значительному увеличению интенсивности «спонтанного» НСТ-теста. Пятисуточное применение ретарпена в той же дозе вызвало достоверное снижение активности фагоцитоза НГ. В целом полученные результаты можно рассматривать как отражение способности малых доз ретарпена к разнонаправленному изменению показателей фагоцитоза и респираторного взрыва в зависимости от схем его применения.
Использование ретарпена в дозе 40 мг/кг таюке привело к противоположным изменениям в состоянии НГ в зависимости от схемы введения. Как видно ( таб. № 2) однократное применение ретарпена в этой дозе вызвало достоверный прирост фагоцитарного числа. Вместе с тем, 10-дневное введение данной дозы антибиотика обусловило значимое снижение активности «спонтанного» НСТ-теста.
Наиболее заметное влияние ретарпена на состояние Нг отмечалось при использовании дозы 400 мг/кг. Вне зависимости от схем введения эта доза антибиотика вызывала достоверное уменьшение активности «спонтанного» и «индуцированного» НСТ-теста. Влияние ретарпена на показатели фагоцитарной реакции было менее выражено и касалось главным образом активности фагоцитоза и, в меньшей степени, его интенсивности , которая также как показатели НСТ-теста, снижалась при введении 400 мг/кг антибиотика в течение 5 дней, но не менялась относительно контроля при 1-и 10-дневном применении.
Завершая описание эффектов различных доз и схем введения ретарпена на функциональное состояние НГ, следует подчеркнуть, что лишь наивысшая из изученных доз в процессе пересчета на равно-эффективные дозы для человека (Волчегорский И.А. и соавт., 2000) соответствовала диапазону терапевтических доз реально применяемых в клинике (Страчунский Л.С, Козлов Р.С., 2002). Следует отдельно подчеркнуть, что обсуждаемый дозовый режим обуславливает главным образом подавление продукции оксидантов нейтрофильными гранулоцитами, что позволяет предположить ограничивающее влияние антибиотиков на процессы тканевой деструкции в очаге воспаления.
В процессе исследования нейтрофил-модулирующего действия цефалоспоринового антибиотика Ш-го поколения - цефтазидима была установлена существенная зависимость его эффектов от дозы и схемы введения (таб. № 3). Наименьшая из изученных доз (10 мг/кг) оказала достоверное влияние на интенсивность фагоцитоза лишь при 10-суточном применении. При этом направленность действия цефтазидима была диаметрально противоположной эффекту наименьшей дозы ретарпена. Как видно, цефалоспориновый антибиотик не только не угнетал, но наоборот достоверно усиливал интенсивность фагоцитоза НГ.
Введение цефтазидима в дозе 40 мг/кг вызывало достоверное повышение интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа уже при всех использованных схемах. Активность фагоцитоза при применении соответствующей дозы антибиотика также достоверно нарастала при 5-й 10-и суточном введении. Сдвиги аналогичной направленности были отмечены для активности и интенсивности «спонтанного» НСТ-теста при всех изученных схемах введения, а также «индуцированного» НСТ-теста при десятидневной схеме введения. Достоверный прирост активности НСТ-теста был отмечен и при пятикратном использовании цефтазидима в дозе 40 мг/кг.
Переход к максимальной из исследуемых доз (400 мг/кг) сопровождался изменением направленности влияния цефтазидима на состояние НГ. Безотносительно схем введения эта доза антибиотика вызывала достоверное снижение активности фагоцитоза, интенсивности «спонтанного» и «индуцированного» НСТ-теста и активности «индуцированного» НСТ-теста. Кроме того, при 5- и 10- дневном введении цефтазидима отмечалось достоверное угнетение активности «спонтанного» НСТ-теста, а при 10-дневном введении антибиотика в данной дозе дополнительно наблюдалось значимое снижение интенсивности фагоцитоза НГ. Как и в случае ретарпена, максимальная из изученных доз цефтазидима, при пересчете на равно-эффективные дозировки для человека, оказалась наиболее близкой к режиму дозирования, применяемому в клинике (Страчунский Л.С, Козлов С.Н., 2002).
Влияние бета-лактамных антибиотиков на макрофагальную продукцию N0, нитроксидемию и нитроксидурию у экспериментальных животных
Резидентный макрофаг рассматривается как первичный акцептор флогогенных воздействий (Вашпапп Н., Gauldie J., 1994). Активизация этой клетки считается важнейшим моментом, обеспечивающим продукцию хемоаттрактантов для полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) и последующую лейкоцитарную инфильтрацию очага воспаления. Известно, что макрофаги интенсивно экспрессируют iNOS , которая играет центральную роль в обеспечении прироста уровня оксида азота при воспалительной патологии (Kostoglou-Athanassiou J. et al., 1998). Показано также, что NO является определяющим фактором в развитии воспалительной вазодилятации, увеличении проницаемости сосудистой стенки и формировании отека. Учитывая эти общеизвестные обстоятельства, мы посчитали целесобразным провести целенаправленное изучение влияния бета-лактамных антибиотиков на интенсивность макрофагальной продукции N0 и сопутствующие сдвиги нитроксидемии и нитроксидурии.
В качестве объекта исследования нами были избраны перитонеальные макрофаги мышей, получавших изученные антибиотики. Об интенсивности макрофагальной продукции оксида азота судили по концентрации нитритов в переживающих культурах перитонеальных макрофагов.
В результате проведенного исследования было установлено, что однократное введение ретарпена в минимальной из изученных доз (10 мг/кг) приводило к статистически значимому приросту концентрации нитритов в культурах макрофагов. Введение антибиотика в дозе 40 мг/кг вызывало аналогичные сдвиги только при 10-суточном применении. Максимальная из исследованных доз ретарпена (400 мг/кг), наоборот, вызывала достоверное снижение концентрации нитритов в культурах переживающих макрофагов при всех изученных схемах введения антибиотика. В целом полученные результаты хорошо согласуются с характером влияния различных доз и схем введения ретарпена на функциональное состояние нейтрофилов (таб.№2).
Известно, что введение актопротектора бемитила существенно стимулирует функции МФ (Ратников В.И., Ратникова Л.И., 1991). Имеются основания полагать, что применение бемитила может привести и к стимуляции NO-продуцирующей активности МФ. Полученные нами данные подтвердили правомерность этого положения. Это выразилось достоверным приростом концентрации нитритов в переживающих культурах перитонеальных макрофагов мышей с 14,82±0,85 нмоль/л (в контроле; п=9) до 25,06±1,09 нмоль/л (п=8; р 0,001) у мышей, получавших 25 мг/кг бемитила однократно.
Характер влияний ретарпена на бемитил-стимулированную продукцию NO макрофагами несколько изменился, в сравнении с действием на не стимулированные макрофаги (таб. № 5). Это проявилось отсутствием достоверных сдвигов при применении минимальной дозы антибиотика (таб. № 6), и одновременным усилением угнетающего действия ретарпена, которое оказалось значимым при введении антибиотика в дозах 40 и 400 мг/кг безотносительно схем введения.
Действие цефтазидима на макрофагальную продукцию оксида азота (таб. №7) носило однонаправленный угнетающий характер и проявлялось только в высшей из изученных доз 400 мг/кг независимо от схем введения. Изучение влияния цефтазидима на интенсивность бемитил-стимулированной продукции NO перитонеальными макрофагами также продемонстрировало угнетающий эффект антибиотика (таб. №8). В данном случае содержание нитритов в культуральной среде достоверно снижалось, не только при введении 400 мг/кг, но и при 10-суточном применении цефтазидима в дозе 40 мг/кг. Наиболее выраженное угнетающее влияние на макрофагальную продукцию оксида азота оказал карбапенемовый антибиотик - тиенам (таб. №9) . Как видно, применение тиенама в дозах 100 и 200 мг/кг вызывало достоверное снижение концентрации нитритов в культуральнои среде безотносительно схем введения препарата. Аналогичный эффект наблюдался в процессе оценки влияния тиенама на продукцию NO бемитил стимулированными макрофагами. В последнем случае было отмечено дополнительное подавление макрофагальной продукции NO при однократном применении тиенама в минимальной из изученных доз (20 мг/кг; таб. № 10).
