Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Туберкулез - одна из основных проблем современной медицины 10
Клинические признаки туберкулеза 11
Характеристика возбудителя туберкулеза 15
Характеристика генома микобактерий туберкулеза 19
Диагностика туберкулеза 21
Полимеразная цепная реакция (ПНР) 26
Теоретические основы метода ПЦР 27
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний 30
Ограничения метода ПЦР 32
Выделение ДНК из образцов 32
ПЦР в реальном времени З 3
Генодиагностика туберкулеза 3 7
Стандартизация метода ПЦР 3 8
Основные проблемы, связинные с лечением туберкулеза 43
Резистентность к лекарственным препаратам 46
Профилактика туберкулеза 48
Неспецифическая профилактиака 49
Специфическая профилактика 52
1.9. Заключение по литературному обзору 53
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение ДНК микобактерий методом ПЦР 56
Выделение ДНК и РНК микобактерий из культуральных и клинических образцов 56
Проведение ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени для определения суммарного количества нуклеиновых кислот микобактерий туберкулеза 57
Дифференциальная детекция мРНК микобактерий 59
Обнаружение мРНК MDR1 60
Электрофорез ДНК в агарозном геле 61
Анализ результатов ПЦР в реальном времени 61
Конструирование искусственной референтной плазмиды
mimicMtp40 62
2.9. Биологические образцы и культуры, содержащие
микобактерий туберкулеза 66
III. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1.Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для
выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis 6 8
3.2. Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в
реальном времени для выявления и дифференцирования
М. tuberculosis и М. bovis 74
3.3. Разработка тест-системы для количественного
определения M.tuberculosis 76
3.4.Разработка тест-системы для выявления
жизнеспособности M.tuberculosis 78
3.5 .Исследования клинического материала от больных 8 3
3.6.Разработка ФСП, СТО и инструкции по применению
для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для
выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis 87
IV. ОБСУЖДЕНИЕ 88
V. ВЫВОДЫ 106
VI. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 107
VII. ПРИЛОЖЕНИЯ 127
Введение к работе
Ежегодно в мире от туберкулеза умирают около 2 млн человек, а в развивающихся странах один из пяти случаев смерти связан с туберкулезом. Это больше, чем от СПИДа, малярии и всех тропических болезней вместе взятых [55].
Быстрое распространение туберкулеза, появление мультирезистентных форм, увеличение количества случаев заражения одновременно бактериями М. tuberculosis и вирусом иммунодефицита требуют применения экспресс-методов диагностики и эффективных методов противотуберкулезной терапии [139].
Использующиеся в настоящее время методы прямого обнаружения микобактерий в клиническом материале с применением микроскопии по Цилю-Нильсену и культурального метода, являются классическими и признаются «золотым стандартом» диагностики туберкулеза [55]. Специфичность микроскопии составляет 89-100%, но метод не позволяет отличить туберкулезные микобактерий от нетуберкулезных. [139, 116, 88]. Диагностика с использованием культурального метода требует нескольких месяцев. Несмотря на длительное использование этих методов, споры по поводу чувствительности и правильности интерпретации результатов продолжаются [180].
В последние десятилетия развитие молекулярной биологии способствовало появлению новых экспресс-методов лабораторной диагностики туберкулеза. Среди них значительное место занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода - ПЦР в реальном времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и классическими методами (микроскопией и культуральным методом) и позволяет получать результаты в течение нескольких часов. Кроме того, ПЦР в реальном времени позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ, а также упрощает разработку мультиплексных тестов.
На фармацевтическом рынке представлено очень незначительное количество тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза. Большая часть из них предназначена для обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и не позволяет дифференцировать микобактерии, выявлять их жизнеспособность, проводить количественный анализ и ускоренную диагностику с применением мультиплексных реакций.
Проблема туберкулеза усугубляется сложностью лечения мультирезистентных форм [177]. Исследования в области мультирезистентности к противотуберкулезным препаратам состредоточены на изучении взаимодействия микобактерии с лекарственным препаратом [184]. Однако в настоящее время нет исследований в области реакции клеток организма человека на воздействие противотуберкулезных препаратов.
Несмотря на широкое распространение метода ПЦР, в действующей ГФ отсутствуют как общая фармакопейная статья, так и статьи по применению конкретных тест-систем на основе ПЦР [9], например, для выявления и дифференцирования различных типов бактерий туберкулеза. Длительность сертификации, отсутствие или недоступность нормативной документации ограничивает распространение тест-систем на основе ПЦР, которые, в свою очередь, должны способствовать совершенствованию методов лечения и их стандартизации.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация тест-систем для диагностики туберкулеза на основе новой модификации ПЦР -метода ПЦР в реальном времени.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.
Оптимизировать условия проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis;
Разработать тест-систему для количественного определения М. tuberculosis;
Оптимизировать условия для выявления жизнеспособности М. tuberculosis;
Провести исследование возможности применения разработанных тест-систем при использовании культурального материала и клинического материала от больных туберкулезом.
Исследовать экспрессию гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом.
Разработать проекты ФСП, СТО и инструкцию по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.
Научная новизна
Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая идентифицировать М. tuberculosis и M.bovis и дифференцировать их между собой и с другими микобактериями. Показано, что экспрессность реакции повышена в сравнении с «гнездовой» ПЦР с сохранением одинаковой чувствительности.
Оптимизированы условия для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющей идентифицировать М. tuberculosis и М. bovis и дифференцировать их между собой и с другими микобактериями. Тест-система характеризуется более высокой экспрессностью в сравнении с обычной ПЦР в реальном времени.
Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени для количественной оценки содержания ДНК М. tuberculosis в образце.
Впервые разработана отечественная тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для дифференцирования жизнеспособных и
нежизнеспособных микобактерий. В основе разработанной тест-системы лежит обнаружение мРНК М. tuberculosis.
Сравнительные результаты использования тест-системы для обнаружения мРНК М. tuberculosis и культурального метода свидетельствуют о возможности использования разработанного теста для быстрого дифференцирования живых и неживых микобактерий, а также дормантных форм.
Экспериментальное использование разработанных тест-систем показало возможность их применения при работе как с культуральным материалом, так и с клиническим материалом от больных.
Впервые обнаружена экспрессия гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом, что открывает широкие перспективы продолжения исследований причин резистентности к лекарственным препаратам у больных туберкулезом. Практическая значимость работы
Разработанные в ходе проведения исследовательской деятельности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПНР в реальном времени могут быть использованы в диагностических лабораториях для дифференциальной экспресс-диагностики М. tuberculosis и М. bovis.
Тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis применима для дифференцирования живых, неживых и дормантных форм М. tuberculosis, что важно для контроля эффективности лечения заболевания.
Разработанная тест-система для количественного анализа М. tuberculosis может быть использована для оценки эффективности лечения туберкулеза существующими лекарственными препаратами и прогнозировать эффективность новых лекарственных средств.
Обнаружение гена мультирезистентности у больных туберкулезом и проведение дополнительных исследований открывает перспективы выявления дополнительных причин лекарственной устойчивости и корректировки схем лечения.
Положения, выносимые на защиту
Возможность идентификации М. tuberculosis и M.bovis и дифференцирования их между собой и с другими микобактериями с использованием разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности реакции в сравнении с «гнездовой» ПЦР при сохранении одинаковой чувствительности.
Одновременное обнаружение и дифференцирование в одной пробирке М. tuberculosis и М. bovis с использованием разработанной тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности теста в сравнении с ПЦР в реальном времени.
Возможность количественной оценки содержания ДНК М. tuberculosis в образце с применением разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.
Возможность быстрого дифференцирования живых, неживых и дормантных форм микобактерий с использованием тест-системы на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis.
Возможность применения разработанных тест-систем на основе ПЦР в реальном времени при работе с культуральным материалом и клиническим материалом от больных.
Обнаружение экспрессии гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом и необходимость продолжения исследований резистентности к противотуберкулезным препаратам.
Проекты ФСП, СТО и инструкции по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и M.bovis.
