Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современное состояние исследований плодов расторопши пятнистой (обзор литературы) 7
1.1. Ботанико-фармакогностическая характеристика расторопши пятнистой 7
1.2. Историческая справка 8
1.3. Химический состав 10
1.4. Методы контроля качества плодов и препаратов расторопши пятнистой 18
1.4.1. Количественное определение суммы флаволигнанов в плодах и препаратах расторопши пятнистой 22
1.4.2. Методы качественного и количественного анализа комплексного фитопрепарата на основе плодов расторопши пятнистой «Силибохол» 27
1.5. Фармакологические свойства, клиническое применение плодов и препаратов расторопши пятнистой 30
1.5.1. Определение гепатопротекторной активности экстракта расторопши жидкого 36
1.5.2. Определение гепатопротекторной активности комплексного фитопрепарата на основе плодов расторопши пятнистой «Силибохол» 40
1.6. Перспективы создания новых лекарственных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой 44
Выводы к главе I
Экспериментальная часть
Глава II. Объекты и методы исследования.
2.1. Объекты исследования 47
2.2.Методы исследования 47
2.2.1. Методы, использованные для установления химического строения и выделения соединений 47
2.2.1.1. Метод колоночной хроматографии 47
2.2.1.2. Метод тонкослойной хроматографии 48
2.2.1.3. Метод спектрофотометрии 49
2.2.1.4. 'Н-ЯМР-спектроскопия. Масс-спектрометрия 49
2.2.1.4.Качественные реакции и химические превращения...50
2.2.2. Методы получения и определения числовых показателей лекарственных средств 51
Глава III. Исследование химического состава плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области 53
3.1. Изучение химических параметров выделенных флаволигнанов растропши пятнистой 59
3.2. Обоснование методики выделения 2,3-дегидросилибина 61
Выводы к главе III 64
Глава IV. Исследования по обоснованию целесообразности создания новых гепатопротекторных лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп» 66
4.1. Разработка нового лекарственного препарата на основе плодов расторопши пятнистой «Холемарин» 66
4.1.1. Разработка способа получения лекарственного средства «Холемарин» 69
4.1.2. Числовые показатели лекарственного средства «Холемарин» 75
4.2. Исследования по разработке «Расторопши сиропа» 76
4.2.1. Способ получения сиропа расторопши 79
4.2.2. Разработка числовых показателей сиропа расторопши 80
4.3. Обоснование использования разработанных препаратов в медицинской практике 81
Выводы к главе ІV 86
Глава V. Исследования по стандартизации гепатопротекторного средства «Холемарин» и сиропа расторопши 87
5.1. Качественный анализ препаратов на основе плодов расторопши пятнистой 88
5.1.1. Качественный анализ лекарственного средства «Холемарин» 80
5.1.2. Качественный анализ сиропа расторопши 91
5.2. Количественное определение суммы флаволигнанов в холемарине и сиропе растропши 93
5.2.1. Количественный анализ лекарственного средства «Холемарин» 93
5.2.2. Количественный анализ суммы флаволигнанов в сиропе расторопши 100
Выводы к главе V 107
Общие выводы 108
Список литературы 110
Приложения 140
- Количественное определение суммы флаволигнанов в плодах и препаратах расторопши пятнистой
- Определение гепатопротекторной активности комплексного фитопрепарата на основе плодов расторопши пятнистой «Силибохол»
- Разработка способа получения лекарственного средства «Холемарин»
- Качественный анализ лекарственного средства «Холемарин»
Введение к работе
2096/ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время плоды расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn. сем. Asteraceae - Астровых] широко применяются в России и за рубежом для производства таких ценных гепатопротекторных препаратов, как Силимар, Карсил, Легален, Силибор, Гепабене и др. Уникальность данных препаратов заключается в том, что их гепатозащитные свойства обусловлены новой группой биологически активных соединений (БАС) - флаволигнанами, в частности, силибином, силидианином и силикристином. Механизм действия указанных БАС включает в себя снижение перекисного окисления фосфолипидов в ткани печени и повышение активности таких антиоксидантных ферментов, как каталаза и супероксиддисмутаза, а также стимуляцию регенерации клеток печени.
При этом важно подчеркнуть, что гепатопротекторы на основе плодов расторопши пятнистой используются не только для лечения патологии печени, но и в качестве вспомогательной терапии многих инфекционных поражений (хронический бронхит, хламидиоз, токсоплазмоз и.т.д.), а также для профилактики различных заболеваний, возникших в результате воздействия на организм неблагоприятных факторов окружающей среды. Однако отсутствие на сегодняшний день достаточного ассортимента отечественных аналогов и дороговизна импортных препаратов не позволяют удовлетворить острую потребность населения в данной группе лекарственных средств. Огромные возможности для создания современных гепатопротекторов на основе флаволигнанов расторопши пятнистой имеются в Самарской области, где создана крупнейшая в Российской Федерации промышленная сырьевая база.
Таким образом, разработка отечественных, эффективных, безопасных, доступных по цене гепатопротекторных фитопрепаратов, применимых и в педиатрической практике, представляется актуальной и перспективной как в научном, так и в практическом отношении.
. «ИМИОТЕКА
Для достижения этой цели решались следующие зад ачи: цл,
О»
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение фармакогностических и аналитических аспектов создания лекарственных средств на основе плодов расторопши п івдсГОАЦК
-
Сравнительное изучение химического состава плодов, шрота, жома растропши пятнистой, культивируемой в Самарской области.
-
Обоснование способа получения нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».
-
Разработка методик качественного и количественного анализа нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».
-
Разработка методик качественного и количественного анализа гепатопротекторного лекарственного средства «Расторопши сироп».
-
Разработка числовых показателей новых гепатопротекторных лекарственных средств «Холемарин» и «Расторопши сироп».
-
Разработка проектов нормативной документации ФСП «Холемарин» и ФСП «Расторопши сироп».
Научная новизна.
В результате изучения химического состава плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы силибин, силидианин, силикристин, а также впервые получено и охарактеризовано индивидуальное вещество флаволигнан (один из основных биологически активных соединений) 2,3-дегидросилибин. Выявлено, что 2,3-дегидросилибин обладает выраженным антиоксидантным действием, что позволяет относить данный флаволигнан к основным биологически активным соединениям плодов расторопши пятнистой. Для установления структуры и определения физико-химических свойств дегидросилибина использованы УФ-спектрометрия, 'Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия, а также различные химические превращения. На основе принципа унификации разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа препаратов «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием тонкослойной хроматографии и прямой спектрофотометрии и Государственнного стандартного образца (ГСО) силибина. Научно обоснована целесообразность использования шрота плодов (после экстракции хладоном-12) для получения, гепатопротекторных препаратов. Проведено сравнительное фитохимнческое исследование плодов, шрота и жома плодов, экстракта, холемарина и сиропа расторопши.
Практическая значимость.
1. Обоснованы технология получения экстракта расторопши жидкого и лекарственного средства «Холемарин» (достигается максимальное извлечение основных БАС плодов расторопши пятнистой из нативных плодов и обезжиренного сырья) и методы качественного и количественного анализа, позволяющие определять содержание суммы флаволигнанов в сырье и препаратах.
-
Получен Патент РФ на изобретение № 2209063 «Способ получения вещества, обладающего антиоксидантным действием» по заявке № 2002103533 от 08.02.2002 г.
-
Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов «Холемарин» и «Расторопши сироп» с использованием ТСХ-анализа и прямой спектрофотометрии.
-
Определены числовые показатели препаратов «Холемарин», «Расторопши
сироп»: содержание суммы флаволигнанов, сухой остаток, концентрация спирта, установлен срок годности.
-
Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов на основе плодов растропши пятнистой «Холемарин» и «Расторопши сироп» в медицинской практике в качестве гепатопротекторных лекарственных средств.
-
Результаты исследований используются в практическом здравоохранении, научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 10.03.2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 1 патент РФ на изобретение.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VII, VIII и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000-2002 гг.); на II Международной научной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (С. Пб, 1999 г.); на Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000 г.); на VI и VII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека»
(Самара, 2001,2002 гг.); на научной конференции «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики», посвященной 35-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 2001 г.); на юбилейной IX научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностик, лечения и реабилитации больных» Пензенского института усовершенствования врачей МЗ РФ с участием регионов России (Пенза, 2002 г.); на XXI международной конференции по полифенолам (Марокко, 2002 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200112941) и Республиканских программ:
1. «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277). 2. «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536). Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Результаты сравнительного изучения химического состава плодов и обезжиренного сырья (жома и шрота) расторопши пятнистой.
-
Методики качественного и количественного анализа нового гепатопротекторного лекарственного средства «Холемарин».
-
Методики качественного и количественного анализа лекарственного средства «Расторопши сироп».
-
Результаты определения показателей качества препаратов. Объем и структура работы.
Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 7 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора
5 литературы, описания объектов и методик исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 224 источника, из которых 76 на иностранных языках. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по проблеме современного состояния исследований плодов расторопши пятнистой, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медициской практике.
В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики химического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также контроля качества лекарственных форм на основе плодов расторопши пятнистой.
В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава плодов расторопши пятнистой, разработке новых препаратов и оценке их качества. В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации; акты внедрения.
Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, на рисунках, выражены в соответствующих формулах, которые приведены в тексте диссертации.
Количественное определение суммы флаволигнанов в плодах и препаратах расторопши пятнистой
Если обратиться к истории, то первым опытом по разработке методик количественного определения суммы флаволигнанов являлись работы немецких ученых [220,221], которые предложили спектрофотометрию окрашенных комплексов в присутствии динитрофенилгидразина (Х,тах 395 нм). В ходе совершенствования методик этими же авторами предложен метод, включающий ТСХ-разделение экстракта расторопши пятнистой с последующей флуорометрией. При этом содержание суммы флавоноидов находилось в пределах от 2,15 % до 4,5 %. Следует отметить, что реакция с динитрофенилгидразином положена в основу методик количественного определения суммы флаволигнанов в препаратах «Легалон 70» и «Карсил».
Разработаны также методики" хроматоспектрофотометрического определения силибина и других компонентов в плодах расторопши пятнистой с использованием ТСХ (система растворителей: хлороформ-ацетон-муравьиная кислота в соотношении 9:1:2 [99]. При этом содержание силибина в сырье колеблалось от 1,68 % до 1,97 % , от 1,3 % до 1,6 % и от 1,05 % до 1,76 % .
В соотвествии с нормативной документацией на плоды расторопши пятнистой. (ТУ 64-4-97-93) количественное определение флаволигнанов проводится методом, дифференциальной УФ-спектрофотометрии. Подобные подходы применяли при анализе препарата «Силибор», но с использованием Государственного стандартного образца (ГСО) силидианина [99]. В качестве альтернативного метода предложили метод прямой спектрофотометрии с использованием ГСО силибина [62,63,66,73,75,76,86,88,99], причем необходимо отметить, что по данным методикам определяется сумма флаволигнанов. В методике количественного определения суммы флаволигнанов (ТУ 64-4-97-93) не использовали образец силибина. Кроме того, при разработке новых методик анализа принимается во внимание принцип унификации методов в ряду: сырье-субстанция-лекарственная форма. Для целей стандартизации изучались свойства силибина, а также разработан способ его получения из плодов расторопши пятнистой [99,116,118,129]. На основе этих данных разработаны лабораторный регламент на производство силибина, а также временная фармакопейная статья «Силибин-стандартный образец» (ВФС .42-3383-99), которая затем была переоформлена в ФС 42-0072-01( Р № 001374/01-2002 от 29.04.2002 г.).
Наиболее надежным и экспрессным методом анализа лекарственного растительного сырья является ВЭЖХ, которая одновременно сочетает в себе разделение веществ и возможность проведения их качественного и количественного определения. В работах немецких ученых [218-222] с использованием обращенно-фазового сорбента и подвижной фазы метанол - вода с добавлением уксусной кислоты проведены успешное разделение, идентификация и количественное определение компонентов плодов расторопши пятнистой. Кроме того, ВЭЖХ (Сферисорб S5 ODS-2, подвижная фаза - система растворителей: 0,05 М фосфорная кислота-метанол-тетрагидрофуран в соотношении 75:18:7) использовано в разделе «Количественное определение», включенном в НД 42-10500-99 («Легалон 70»), однако в методике вместо стандартного индивидуального вещества используется сухой стандартный экстракт из плодов расторопши пятнистой.
Предпринята также попытка использования ВЭЖХ для количественной оценки содержания силибина и суммы флаволигнанов [82,88,99]. При этом изучение компонентного состава плодов расторопши пятнистой авторы проводили методом обращение-фазовой ВЭЖХ на хроматографе "Милихром-4" (колонка 2 х 64 мм, стационарная фаза Сепарон С-18) в изократическом режиме (подвижная фаза - смесь ацетонитрила и воды в соотношении 3:7 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты). В результате проведенных исследований определено, что содержание силибина, силидианина и силикристина в сырье данного растения составляет 1,68 %, 0,38 % и 0,24 % соответственно. Навеску воздушно-сухих плодов расторопши пятнистой экстрагировали 95%-ным спиртом этиловым троекратно в соотношении 1 : 50 при кипячении в течение 30 минут в соответствии с ТУ 64-4-97-93. Объем объединенных экстрактов доводили до 200 мл. Полученный экстракт использован для разработки методик анализа с использованием прямой спектрофотометрии и ВЭЖХ..
В методике количественного определения использовали образец ГСО силибина, при детектировании анализируемых веществ при длине волны 290 нм. Спиртовой раствор экстракта расторопши жидкого (ВФС 42-3181-99), (1 : 2500). имел максимум поглощения при длине волны 289 нм, причем характер кривой поглощения практически совпадал с таковой раствора ГСО силибина и, следовательно, определяется в основном флаволигнанами.
Определение гепатопротекторной активности комплексного фитопрепарата на основе плодов расторопши пятнистой «Силибохол»
Терапия заболеваний печени, в том числе гепатитов, включает в себя следующие известные средства патогенетической постсиндромный терапии (Соринсон С.Н., 1996): дезинтоксикационные (5 % раствор глюкозы, физиологический раствор, гемодез), гепатопротективные (витамины - А, С, Вь В2, В2, рутин, оротат калия, рибоксин, гептрал, эссенциале форте, карсил), противовоспалительные (индометацин, антибиотики), гемостатические (викасол, препараты кальция, аскорбиновая кислота), иммунокорригирующие (ГКС, иммуноглобулин, тимоген), спазмолитические (папаверин, но-шпа) и желчегонные средства - желчьсодержащие (аллохол, лиобил, холензим) или растительные препараты (цветки бессмертника, кукурузные рыльца, желчегонные сборы, флакумин, танацехол, холосас). Наиболее часто в схему лечения заболеваний печени для реализации желчегонного эффекта включали узконаправленные растительные препараты (холекинетики). Учитывая многообразие возникающих патогенетических синдромов при воспалении печени и желчевыводящих путей, в мире создавали препараты с комбинированным действием. Так, известны зарубежные средства «Гепатофальк планта» (капсулы для лечения острых и хронических заболеваний печени) и «Гепабене» (капсулы для лечения желчевыводящих путей) [2], которые широко использовали для лечения различных заболеваний печени. Сотрудники кафедры фармакогнозии СамГМУ предлагали к применению и производству комбинированный лекарственный препарат гепатопротекторного действия . «Силибохол» [117]. Силибохол представляет собой комплексный препарат на основе, экстракта плодов расторопши пятнистой, травы тысячелистника обыкновенного, цветков ромашки аптечной, плодов кориандра посевного, листьев крапивы двудомной, травы спорыша, корней солодки [210,224], травы мелиссы лекарственной, травы череды трехраздельной, цветков календулы, листьев березы [99,117,132]. Наряду с гепатопротекторными свойствами, характерными для флаволигнанов (силибин, силидианин, силикристин и др.), плодов расторопши пятнистой данное средство обладает холекинетическим, желчегонным, противовоспалительным, спазмолитическим, иммунокорригирующим, легким седативным и противовирусным действием. Кроме того, в последние годы имеются сообщения об антиоксидантном действии препаратов из лекарственных растений, которые показали, что растительные флавоноиды обладают антиоксидантным действием [92, 96]. Некоторые препараты из 67 изученных растений способны уменьшать перекисное окисление липидов, уменьшать количество супероксидных радикалов [113]. СМ. Николаев и Т.М. Ажунова находили, что многокомпонентные препараты из лекарственных растений (полифитохол и розобтин) способны предотвращать повышение перекисного окисления липидов при токсическом повреждении печени на 50-70 %. Поэтому представлялось целесообразным изучить именно комплексный препарат на базе экстракта расторопши пятнистой с целью усиления его антиоксидантных свойств.
При введении четыреххлористого углерода крысам происходило значительное усиление перекисного окисления липидов в ткани печени [92,132]. Установлено, что уровень малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени увеличивался с 0,31+0,03 нМ МДА/мг белка до 0,71+0,05 нМ (р 0,001). Одновременно происходило снижение активности антиоксидантных ферментов печени. Активность супероксиддисмутазы (СОД) снижалась с 9,61+0,88 до 1,51+0,38 АЕД (активность в единицах действия) на мг белка (р 0,001). Активность каталазы также снижалась с 5,33+0,39 нМ Н202 / 1 мг белка . сек до 2,38+0,07(р 0,001). Таким образом, интоксикация четыреххлористым углеродом снижала активность, как СОД, так и каталазы, что и проявляется, очевидно, в повышении перекисного окисления липидов [21,22,39,57,58,92,132]. Силибохол статистически достоверно снижал перекисное окисление липидов в 2,2 раза, в то время как легалон снижал его в 1,4 раза. Оба препарата - и силибохол, и легалон повышали активность супероксиддисмутазы в 4,5 и 4,0 раза соответственно. Активность каталазы также повышалась в 3,5 раза при действии силибохола и в 4,5 раза при действии легалона.
Таким образом, силибохол является эффективным препаратом, обладающим антиоксидантным действием, которое более выражено, чем аналогичное действие у легалона. Очевидно, этот эффект являлся выражением гепатопротекторного действия силибохола и легалона, препятствующих поражению печени. Указанные выше подходы были особенно актуальны в случае хронических и острых вирусных гепатитов при наличии дискинезии желчевыводящих путей, хронического холецистита, развитии холестатического синдрома, замедленного восстановления функциональных проб печени. В этой связи предлагался способ лечения печени и желчевыводящих путей, который осуществляют следующим образом: наряду с патогенетической терапией назначают препарат «Силибохол» по 15 капель на столовую ложку воды комнатной температуры за 20-30 МИІІ ДО еды в течение 3-4 недель [117,132]. Заявленным способом с применением препарата «Силибохол» было пролечено 16 человек, а в случае контрольной группы терапия осуществлялась с использованием средства «Гепатофальк планта». При этом были отмечены следующие результаты-: использование «Силибохола» на фоне применения средства «Гепатофальк плаита» способствует сокращению периода желтухи, более быстрому уменьшению размеров печени и восстановлению ее функциональных проб, особенно на фоне холестатического синдрома [140].
Разработка способа получения лекарственного средства «Холемарин»
Целью работы является углубленное изучение химического состава плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской области (совхоз «Сергиевский»), а также совершенствование существующей технологии получения экстракта расторопши жидкого.
В фармацевтической технологии известны способы получения лекарственных средств и субстанций на основе суммы БАС (карсил, силибор, силимар, силимарин и др.), а также индивидуальных веществ из плодов расторопши пятнистой, однако недостатком известных способов является сложность технологического процесса и низкий выход целевого продукта. Кроме того, до настоящего времени как в отечественной, так и зарубежной литературе [214,216] подчеркивалась прежде всего значимость трех_ основных действующих веществ плодов расторопши пятнистой - силибина, силидианина и силикристина, которые определяют гепатопротекторные, антиоксидантные, мембраностабилизирующие свойства препаратов на основе сырья данного растения [1,6,7,13,32,33,99,223,224]. Именно это стало основанием для разработки целой серии очищенных препаратов на основе суммы вышеперечисленных флаволигнанов, получившей название "Силимарин". Однако следует учесть то обстоятельство, что в экстракте расторопши жидком в заметном количестве содержится 2,3-дегидросилибин, впервые выделенный и идентифицированный в ходе настоящих исследований из сырья расторопши пятнистой, культивируемой в Российской Федерации. Для целей стандартизации плодов расторопши пятнистой и отечественных препаратов на основе этого сырья нами предложено использовать силибин в качестве Государственного стандартного образца [62,64,99].
Выделение флаволигнанов (1-4) (см. таблицу 3) осуществляли из 200.0 г измельченных плодов расторопши пятнистой, культивируемой в Самарской обл. (урожай 2001 г.), а также из 200,0 шрота и 200,0 жома плодов - отходов производства масла. Воздушно-сухое сырье расторопши пятнистой заливали 80%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 10 и настаивали в течение 24 ч, затем экстракцию сырья осуществляли 80 %-ным этиловым спиртом при нагревании с обратным холодильником (в течение 30 мин в 2 этапа для полного истощения сырья). Объединенное водно-спиртовое извлечение упаривали под вакуумом до водного остатка, который наносили на слой полиамида (20,Ог), высушивали (рис.1). Полученный сухой порошок (экстракт+полиамид) наносили на слой полиамида, сформированный в воде (высота колонки 20 см, диаметр - 5,5 см), и элюировали водой, а затем смесью растворителей вода—этиловый спирт с возрастанием концентрации последнего. Целевой продукт элюировали 80 %-ным этиловым спиртом. Основное назначение данного этапа работы -отделение основной части гидрофильных соединений (флавоноидные гликозиды, дубильные вещества, полисахариды). Упаренные фракции, содержащие смесь флаволигнанов, высушивали на силикагеле L 40/100 (20,0 г). Сухой порошок наносили на слой силикагеля (40,0 г), сформированный в виде взвеси в хлороформе (высота колонки 8,0 см, диаметр - 4,0 см). Последующее хроматографическое разделение экстрактивных веществ осуществляли на силикагеле L 40/100 с использованием градиентной элюентной смеси хлороформ—этиловый спирт в различных.соотношениях (100:0, 98:2, 97:3, 95:5, 93:7). Это привело к получению отдельных фракций (15-18, 5% этанол в хлороформе), обогащенных силибином и 2,3-дегидросилибином, из которых были получены целевые вещества в количестве 1,0 и 0,5 г соответственно. Кроме того, в результате рехроматографирования на полиамиде «Woelm» фракций, содержащих другие целевые вещества и последующей перекристаллизации выделены флаволигнаны силидианин и силикристин. Окончательную очистку 2,3-дегидросилибина осуществляли перекристаллизацией из водного спирта, а силибина — из смеси ацетона и спирта. Выход целевого продукта — индивидуального силибина (1) и 2,3-дегидросилибина (4) составил 0,6 г и 0,2 г соответственно. С использованием метода колоночной хроматографии выделены 4 соединения флавоноидной природы (1 - 4) из приготовленного на 80% спирте экстракта расторопши. Положительный тест с серной кислотой (лимонно-желтое - для силибина) свидетельствует о наличии в молекуле (4) бензодиоксанового цикла (в случае силикристина тест отрицательный). В условиях ТСХ данное имеет величины Rf 0,45 (хлороформ-метанол, 6:1) и 0,8 (хлороформ-метанол-вода, 26:14:3) и при проявлении раствором А1С13 обнаруживается в виде пятна, имеющего ярко-зеленую флуоресценцию (флавонол). Следовательно, соединение (4) представляет собой 2,3-дегидросилибин, ранее синтезированный японскими учеными [138,139]. Флаволигнаны 1, 2, 3 имеют флаваноноловую природу и относятсяк группам 1,4-бензодиоксанов (силибин), трициклических кетонов (силидианин) и бензофурапов (силикристин) соответственно [104,115-117]. Контроль за ходом хроматографического разделения осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol UV 254» (15 15 см) и «Сорбфил-.ПТСХ-П-А-УФ (10 10 см) в системе растворителей хлороформ : метанол (6:1), хлороформ:метанол:вода (26:14:3) и хлороформ : ацетон : муравьиная кислота (9: 2: 1).
Качественный анализ лекарственного средства «Холемарин»
Исследование антиоксидантного действия флаволигнанов плодов расторопши пятнистой (2,3-дегидросилибин, силибин) и экстракта расторопши жидкого, а также настойки проведено на крысах, у которых под наркозом удалялась печень и из нее готовили гомогенат в стеклянном гомогенизаторе при температуре +1 С на 0,05 М фосфатном буфере. Во всех сериях опытов гомогенат был взят от одной крысы, разведен на пять порций, которые и были использованы в пяти сериях опытов по девять проб в каждой, что позволяло сравнивать результаты всех серий опытов с достаточно высокой степенью достоверности. Во всех пробах определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по методике О.Н.Коробейниковой [57]. К 0,5мл печеночного гомогената добавляли 5мл 20%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты. Смесь оставляли на холоде до образования крупных хлопьев, затем центрифугировали. Надосад очную жидкость сливали, к осадку добавляли 2 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора ТБК, который готовили путем растворения 80 мг ТБК в 5 мл ледяной уксусной кислоты. Пробы инкубировали в пробирках на кипящей водяной бане при температуре 99—100 С. Пробиркой охлаждали, центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин, затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длинах-волн 535 и 580 нм. Расчет производили по формуле, предложенной О. Н. Коробейниковой где С — концентрация МДА в нмоль/мл гомогената печени; AD — оптическая плотность при длине волны 535 нм за вычетом плотности при длине волны 580 нм.
Проведено пять серий опытов. В первой серии опытов определяли перекисное окисление липидов в гомогенате печени без добавления каких-либо веществ. Оно составило 2.80 ± 0.06 нмоль/мл гомогената. Перекисное окисление в гомогенате печени во второй серии опытов было повышено добавлением FeS04 в конечной . концентрации 0,076 мг/мл (0,5- мМ). Таким образом, нами был создан исходный фон повышенного перекисного окисления липидов с добавлением признанного стимулятора этого процесса — сульфата железа (II). Этот фон и служил контролем для последующих опытов. В следующей третьей серии опытов в пробирки добавляли силибин в конечной концентрации 2 мМ/л, в четвертой серии опытов к гомогенату печени добавляли дегидросилибин также в конечной концентрации 2 мМ/л, в пятой серии опытов к гомогенату печени, так же как и в предыдущих сериях опытов, добавляли сульфат железа, а кроме того, и экстракт расторопши в таком количестве, чтобы суммарное содержание в среде силибина и дегидросилибина, содержащихся в экстракте, было 2 мМ/л. Результаты проведенных исследований показывают, что оба флаволигнана — силибин и 2,3-дегидросилибин — уменьшают уровень перекисного окисления липидов, снижая этот показатель с 3.67 ± 0,24 до 2,20 ± 0,14 и 1,93 ± 0,11 соответственно.
Следует отметить, что сообщение об антиоксидантных свойствах 2,3-дегидросилибина получено впервые. Причем по своей активности он превосходит общепризнанное доминирующее биологически активное соединение плодов расторопши пятнистой и соответствующих гепатопротекторов — силибин на 14.0%. Ранее данное соединение было выделено из плодов расторопши пятнистой лишь индийскими учеными (Bandopadhyay et al., 1972), а затем получено путем дегидрирования природного силибина (Takemoto et al., 1975: Wagner et al., 1976).
Более выраженный антиоксидантный эффект по сравнению с флаволигнанами отмечен для экстракта расторопши жидкого, который уменьшает уровень перекисного окисления липидов в гомогенате (2-я серия опытов) в 2,4 раза, причем этот фон значительно ниже исходного показателя (1-я серия опытов) на 74,0 % (см. таблицу 9). На наш взгляд, выраженное антиоксидантное действие экстракта расторопши, холемарина и сиропа обусловлено наличием в нем еще и других флаволигнанов — силидианина и силикристина, для которых описаны гепатопротекторные свойства (Hikino et al., 1984; Vogel, 1977; Wagner, 1973).
Интересно, что ранее к основным биологически активным соединениям препаратов плодов расторопши пятнистой относили силибин, силидианин и силикристин, сумма которых получила название «силимарин» (Мадаус и др., 1978; Vogel, 1977; Wagner, 1973; Wagner et al., 1976). Открытие антиоксидантных свойств для 2,3-дегидросилибина позволило по-новому трактовать вклад флаволигнанов в биологическую активность препаратов на основе плодов расторопши пятнистой, что в свою очередь создает предпосылки-для формирования новой концепции создания гепатопротекторных лекарственных средств на основе сырья данного растения, заключающейся в учете антиоксидантной активности дегидросилибина и, следовательно, в необходимости коррекции традиционных технологий, предполагающих получение очищенной силимариновой суммы.
Из плодов расторопши пятнистой Silybum marianum (L.) Gaertn., культивируемой в Самарской обл., а также обезжиренного сырья выделены силибин и 2,3-дегидросилибин, причем последний впервые описан для данного растения, культивируемого в России и странах СНГ. Силибин и 2,3-дегидросилибин, а также новые лекарственные средства — экстракт расторопши жидкий, холемарин, расторопши сироп обладают выраженным антиоксидантным свойством, уменьшая уровень перекисного окисления липидов »в гомогенате печени крыс, инициированным FeS04- Антиоксидантная активность дегидросилибина выявлена впервые и сопоставима с таковой силибина.
Таким образом, экстракт расторопши жидкий, расторопши сироп и холемарин являются препаратами, обладающими более выраженным антиоксидантным действием по сравнению с таковым свойством у «Легалона», особенно в плане влияния на уровень МДА. Очевидно, этот эффект является выражением гепатопротекторного действия изучаемых препаратов и легалона, препятствующих поражению печени.
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
