Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований цветков календулы лекарственной (Обзор литературы) 13
1.1. Историческая справка 13
1.2. Ботаническое описание 17
1.3. Ареал, культивирование 22
1 А. Химический состав 22
1.5. Микроскопия 32
1.6. Числовые показатели 34
1.7. Промышленное возделывание 34
1.8. Заготовкаи первичная обработка 36
1.9. Применение цветков календулы лекарственной в народной и традиционной медицине 1.10. Фармакологические свойства цветков календулы лекарственной и препаратов на ее основе
1.11. Перспективы создания новых препаратов на основе цветков календулы лекарственной 44
Выводы к главе 1 46
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 47
2.1. Объекты исследования 47
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод колоночной хроматографии 49
2.2.2. Метод тонкослойной хроматографии 49
2.2.3. Метод спектрофотометрии 51
2.2.4. Н-ЯМР-спектроскопия. Масс-спектрометрия 51
2.2.5. Методы, использованные для установления строения и з
идентификации выделенных соединений 2.2.6. Методы, использованные для получения лекарственных средств и определения числовых показателей 54
2.2.7. Исследование анатомического строения соцветий календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области 56
Глава 3. Микроскопический анализ соцветий календулы лекарственной 58
3.1. Методика приготовления микропрепарата «Цветки календулы лекарственной» 58
3.2. Приготовление микропрепарата на основе пыльцы календулы лекарственной 59
3.3. Анализ строения цветков календулы лекарственной 59
Выводы к главе 3 67
Глава 4. Изучение химического состава цветков календулы лекарственной 68
4.1. Получение суммы биологически активных веществ из сырья «Ноготков цветки» и их хроматографическое разделение 68
4.2. Физико-химическая характеристика выделенных соединений и их производных 72
Выводы к главе 4 77
Глава 5. Совершенствование методов стандартизации сырья «Ноготков цветки» 78
5.1. Качественный анализ 80
5.1.1. Методика качественного анализа цветков календулы лекарственной по содержанию флавоноидов 82
5.1.1.1. Ультрафиолетовый спектр 82
5.1.1..2. Качественная реакция 83
5.1.1.3. Методика ТСХ-анализа цветков календулы лекарственной ... 83
5.2. Количественное определение 85
5.2.1. Методика количественного суммы флавоноидов в сырье «Ноготков цветки» 90
5.3. Методика ТСХ-анализа цветков календулы лекарственной на содержание каротиноидов 91
5.4. Методика количественного анализа цветков календулы лекарственной на содержание каротиноидов 93
5.5. Обоснование нижнего предела содержания суммы каротиноидов в различных образцах сырья календулы QA
лекарственной Выводы к главе 5 96
Глава 6. Исследования по разработке и стандартизации новых препаратов на основе цветков календулы лекарственной 97
6.1. Качественный анализ препаратов на основе цветков календулы лекарственной 98
6.1.1. Методика качественного анализа настойки календулы лекарственной 101
6.1.2. Методика качественного анализа жидкого экстракта на основе цветков календулы лекарственной 102
6.2. Количественное определение суммы флавоноидов в препаратах на основе цветков календулы лекарственной 104
6.2.1. Методика количественного определения суммы флавоноидов в настойке календулы лекарственной 111
6.2.2. Методика количественного определения суммы флавоноидов в экстракте календулы лекарственной
6.3. Оптимизация состава и технологии получения препарата «Календулы настойка» 113
6.4. Разработка препарата «Календулы экстракт жидкий» 119
6.5. Обоснование целесообразности использования
лекарственных препаратов «Календулы настойка» и 122
«Календулы экстракт жидкий» в медицинской
практике Выводы по главе 6 125
Общие выводы 126
Список литературы
- Числовые показатели
- Метод тонкослойной хроматографии
- Приготовление микропрепарата на основе пыльцы календулы лекарственной
- Методика ТСХ-анализа цветков календулы лекарственной
Введение к работе
Актуальность темы Препараты календулы лекарственной, или ноготков лекарственных (Calendula officinalis L.) успешно используются в аллопатической и гомеопатической медицине как средства обладающие ранозаживляющими, противовоспалительными, регенерирующими, желчегонными и отхаркивающими свойствами Календула широко культивируется в Российской Федерации, а Самарская область является регионом, где сосредоточена самая крупная сырьевая база календулы лекарственной (СГПУ «Сергиевский», ЗАО «Самаралектравы» и ООО «Кентавр»)
В настоящее время цветки календулы лекарственной используются в отечественной медицинской практике в виде настойки (1-Ю на 70% этиловом спирте), экстракта жидкого (1:2 на 40% этиловом спирте), масляного экстракта, мази, суппозиторий, входят в состав комплексных препаратов. Ротокан, Витаон, Алором, Венен гель, сбор желчегонный №3, сбор грудной №4 и др.
Широкий спектр фармакологического действия цветков календулы обусловлен содержанием различных классов биологически активных соединений (БАС). К ведущей группе БАС относятся витамины, а именно' каротиноиды Установлено, что содержание каротиноидов в сырье коррелирует со степенью махровости соцветий, а также зависит от способа сушки и условий хранения, однако анализ цветков календулы на содержание каротиноидов в НД не предусмотрен. Вторая группа
4 биологически активных соединений представлена флавоноидами, однако
данные по компонентному составу являются противоречивыми
Фотохимические аспекты показателей качества в случае сырья и препаратов данного растения, также нуждаются в дальнейшем изучении, поскольку в Фармакопейной статье (ФС) 5 ГФ СССР XI издания на цветки календулы лекарственной отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение», а содержание действующих веществ оценивается лишь косвенно по показателю «экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этиловым спиртом, «не менее 35%»
Решение вопросов стандартизации новых лекарственных средств (ЛС) связано с разработкой объективных и унифицированных методов анализа сырья и препаратов (Арзамасцев А П. и др, 2000; Самылина И.А. и др , 1994)
Актуальна также задача по оптимизации состава и технологии препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий На наш взгляд, повышение в лекарственной форме уровня содержания действующих веществ приведет к усилению антимикробной и противовоспалительной активности
Цель и задачи исследования. Проведение изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, а также разработка унифицированных методик стандартизации сырья и препаратов на основе данного растения
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
-
Изучение химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области
-
Разработка новых подходов к стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной, с учетом принципа унификации методик в
5 ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная
форма. 3 Разработка методик качественного анализа цветков календулы
лекарственной 4. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов
в цветках календулы лекарственной
-
Разработка методики количественного определения суммы каротиноидов в цветках календулы лекарственной
-
Разработка методик качественного и количественного анализа препаратов «Календулы настойка», «Календулы экстракт жидкий».
-
Оптимизация состава и технологии получения лекарственных препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий»
-
Разработка и изучение числовых показателей препаратов. «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий».
-
Разработка и оформление нормативной документации (НД) на сырье «Ноготков цветки», а также препараты «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий»
Научная новизна. В результате изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, среди которых доминирующее флавоноидное вещество (нарциссин) выделено впервые в РФ из данного растения и идентифицировано с использованием УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии и различных химических превращений (кислотный и ферментативный гидролиз)
Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной по каротиноидам (ведущая группа БАС) и флавоноидам
6 Разработаны подходы к стандартизации, заключающиеся в
обнаружении диагностического доминирующего флавоноида - нарциссина
с использованием ТСХ-анализа, ГСО рутина и УФ-спектроскопии.
Научно обоснована целесообразность оптимизации состава и
технологии получения лекарственных средств «Календулы экстракт
жидкий» и «Календулы настойка», обладающих более высокой
противомикробной активностью
Практическая значимость:
-
Разработаны методики качественного и количественного анализа цветков календулы лекарственной в проект ФС «Ноготков цветки» предложено ввести новые разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» и числовой показатель «Содержание суммы флавоноидов не менее 1,0%»
-
Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» с использованием ТСХ-анализа и спектрофотометрии.
-
Определены числовые показатели препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» содержание суммы флавоноидов, сухой остаток, концентрация спирта, экстрактивные вещества
-
Обоснована целесообразность применения разработанных препаратов цветков календулы лекарственной «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» в медицинской практике в качестве средств обладающих противомикробными свойствами.
-
Оформлены и направлены в Фармакопейный государственный комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ Изменения №1 к ФС 5 и проект ФС «Ноготков цветки» для включения в Российскую Государственную Фармакопею ХП издания
7 6 Разработаны проекты ФС на препараты «Календулы настойка» и
«Календулы экстракт жидкий», для которых оптимизированы состав и
технология получения
7. Результаты исследований используются в научных изысканиях и в
учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами
фитотерапии Самарского государственного медицинского университета
(акты внедрения от №1 и №2 от 4.09.2007 г.).
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Результаты изучения химического состава цветков календулы лекарственной, культивируемой в Самарской области
-
Данные результатов исследований по разработке методов стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной.
-
Методики качественного и количественного анализа лекарственного растительного сырья (ЛРС) «Ноготков цветки» и препаратов «Календулы настойка» и «Календулы экстракт жидкий» с использованием ГСО рутина
4. Результаты разработки и определения показателей качества ЛРС и препаратов «Календулы настойка», «Календулы экстракт жидкий». Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканских программ
1 «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме-«Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).
8 2 «Разработка методик качественного и количественного анализа
сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих
фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации
01990007536).
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на П Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005 г.), на X и XI Всероссийском конгрессе "Экология и здоровье человека" (Самара, 2005; 2006 гг); на Межвузовской конференции «Аспирантские чтения» (Самара, 2005, 2006 гг), на конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета БГМУ (Уфа, 2006 г), на 62-й Межрегиональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2007 г), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора ЛН Березнеговскои «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006 г.); на V международной конференции «Медико-социальная экология личности состояние и перспективы» (Минск, 2007 г ), на ХП Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007 г), на Ш Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007 г), на XIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 16-20 апреля 2007 г)
Основное содержание диссертации опубликовано в 14 научных работах
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 23 рисунка Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных
Числовые показатели
Календула лекарственная - это однолетнее травянистое растение с прямостоячим ребристым и разветвленным стеблем высотой почти до 1 м (обычно 30—70 см). Ломкий стебель густо опушен короткими, жесткими, в верхней части железистыми волосками (содержащими эфирные масла). Корень ветвистый, стержневой. Листья очередные, светло-зеленые, лопатчатые, на верхушке закругленные, цельно-крайние, близко расположенные друг к другу на стебле. Рисунок 2 - Календула лекарственная (Calendula Нижние листья крупнее верхних, officinalis L.). Общий вид. продолговато-яйцевидные с черешками, верхние — продолговатые или ланцетовидные, сидячие. Соцветия от кремовато-желтой до темно-оранжевой окраски, расположены на концах стеблей. Они одиночные, это так называемые цветочные корзинки, диаметр которых колеблется от нескольких сантиметров у дикорастущих форм до 10 см у махровых культурных сортов. Наиболее крупная цветочная корзинка располагается на макушке центрального стебля. Надземные части растения слабоклейкие. Клейкость заметно увеличивается в сухую теплую погоду Это хорошо чувствуется на пальцах и ладонях после ручного сбора цветочных корзинок. В соцветии-корзинке на общем цветоложе, словно в пчелиных сотах, располагается множество цветочков, тесно соприкасающихся друг с другом [71,96,123]. Цветки, которые расположены по внешнему краю (периферии) соцветия и. называются краевыми, отличаются от внутренних как внешним видом, так и строением, и функции на общем цветоложе в соцветии они выполняют различные.
Краевые цветки (не совсем правильно иногда называемые лепестками) — женские (пестичные), с одногнездной изогнутой завязью, двулопастным столбиком. Они язычковые, ланцетовидные, с трехзубчатым внешним краем, оранжевые или желтые, расположены несколькими рядами (у махровых сортов может быть более 15 рядов). Именно они и придают цветочной корзинке календулы такой нарядный вид и служат для привлечения всевозможных насекомых-опылителей, но основное их предназначение — образование семян [96].
Маленькие срединные тычиночные цветки — трубчатые, пятизубчатые, с недоразвитым пестиком и пятью тычинками — служат в качестве опылителей. Снаружи общее цветоложе окружено оберткой из видоизмененных верховых листьев. Само цветоложе голое, плоское. Обертка блюдцевидная, шириной около 1-5 см, одно - или двухрядная с ровными линейно заостренными листочками. Ее основная функция — защита цветков от неблагоприятных воздействий внешней среды [5,77,104].
Благодаря своим оригинальным плодам — семянкам календула и получила свое второе название — ноготки, более распространенное среди любителей-садоводов и дачников. Они изогнутой формы, напоминают когти на лапах многих хищных млекопитающих — кошек, собак и других, а также птиц, ящериц и даже конечности некоторых насекомых. Но по отношению к человеку название ноготки имеет более прозаичный характер — форма семян напоминает кусочки остриженных ногтей. Кроме этого, плодам ноготков присуща интересная биологическая особенность, так называемое разноплодие, или, выражаясь научным языком, гетерокарпия. В одной корзинке располагаются семена самой разнообразной величины и формы. Наружные плоды крупные, с длинным полым носиком, серповидные, срединные — не имеют носика, кольцеобразно изогнутые с широким крылом, внутренние — мелкие, крючковидные (длиной до 1 см), без носика и крыла. На выпуклой стороне семена острозубчатые, желтовато Рисунок 3 - Виды махровость соцветий календулы.
Махровость обусловлена формированием преимущественно женских язычковых цветков, у которых полностью подавлено развитие тычинок и сильно разрастается венчик. Проведенные исследования (Мелконова Е.Ф. и др., 1994) показали, что махровость наследуется как рецессивный признак. Махровость в определенной мере зависит от гидротермальных условий в период формирования генеративного побега: она выше в прохладные и влажные годы [39,121]. Махровость соцветий, как мутация, может искусственно вызываться обработкой семян различными мутагенами. Так, махровость может возникнуть при воздействии на семена диметилсульфатом (Татевосян В.Б., 1977). Данный мутаген воздействует на мейотическое деление: у махровых растений начиная с профазы первое деление мейоза протекает со значительными нарушениями [58,121].
Плоды располагаются, в зависимости от степени махровости, в несколько рядов. Количественное соотношение трех типов семян в корзинке зависит от количества рядов семян. У немахровых соцветий с 2-3 рядами наружные серповидно-изогнутые семена составляют -25% от общего количества семян в соцветии, срединные ладьевидные -34-38%, мелкие кольцевидные -37-41% [95,96]. По мере увеличения количества рядов содержание кольцевидных семян увеличивается, а ладьевидных и серповидно-изогнутых - уменьшается.
В полностью махровых соцветиях (с количеством рядов семян больше 9) почти все (более 95%) семена мелкие кольцевидные, располагаются в соцветии плотно, куполообразно [58].
Махровость влияет и на массу семени. Масса 1000 семян в пределах 8-15 г. Здесь необходимо учитывать, что масса семени календулы находится в прямой зависимости от соотношения типов семян в соцветии и количества рядов семян. Масса 1000 семян у немахровых соцветий с большим количеством крупных серповидно-изогнутых и ладьевидных семян составляет в среднем 18 г. У махровых соцветий с подавляющим большинством мелких кольцевидных семян этот показатель не превышает 7-8 г [6,49]. Описание рода «Календула»
Корзинки многоцветковые, верхушечные; обертка из 1-2 рядов удлиненных листочков. Наружные (язычковые) цветки. Пестичные, плодущие, с линейным рыльцем; внутренние цветки. Трубчатые, обоеполые, но бесплодные, с головчатым рыльцем. Семянки располагаются в 2-3 ряда, они изогнутые (до кольцевидных), гетероморфные: наружные отличаются по форме и структуре поверхности от средних и внутренних. Одно- или многолетние травы, пушковато железисто опушеные, с желтыми или оранжевыми цветками, 20-30 видов в Средиземноморье, Западной Европе и Передней Азии. Некоторые виды (Calendula officinalis L.) принадлежат к числу наиболее популярных декоративных растений [104,105,149]. 1. С. Persica-кялеіщуля персидская
Метод тонкослойной хроматографии
К 1мл препарата приливают 10 мл воды, встряхивают и дают отстояться в течение 5 мин, после чего фильтруют через бумажный фильтр. К 5 мл фильтрата прибавляют 3 капли раствора хлорида окисного железа; появляется зелено-коричневое окрашивание, исчезающее при прибавлении разведенной серной кислоты (дубильные вещества) [38,129]. Ацетилирование
Смесь 10 мг соединения, 0,5 безводного пиридина, 1 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида оставляли на 24 часа при 20 С. Полноту ацетилирования контролировали методом ТСХ (при облучении УФ-светом пятна ацетатов имеют ярко-голубую флуоресценцию). При добавлении ледяной воды из реакционной смеси выпадал осадок, который промывали 4 раза водой и многократно перекристаллизовывали из спирта. В случае некристаллических ацетатов (извлекают из реакционной смеси хлороформом) или некристаллизующихся из спиртов ацетатов, их очищали колоночной хроматографией на силикагеле в системе гексан-хлороформ в различных соотношениях. Кислотный гидролиз
10 мг гликозида нагревали с 3 мл 2 % НС1 на кипящей водяной бане в течение 5-30 мин. Полноту гидролиза проверяли ТСХ. Из охлажденной смеси отфильтровывали кристаллы агликона через взвешенный стеклянный фильтр, а в случае некристаллического агликона его извлекали из кислотного гидролизата хлороформом. Водный раствор упаривали в вакууме и использовали для идентификации углевода методом БХ. Ферментативный гидролиз
5 мг или 100 мг (для препаративных целей) гликозида термостатировали в течение 24-48 часов в ацетатном буфере (рН 5,4) с 1 или 10 мг р-гликозидазы («Serva»). Из гидролизата агликон извлекали хлороформом и анализировали его методом ТСХ, масс-спектрометрии и др. методами, а в водном растворе методом БХ идентифицировали углевод.
Лекарственные препараты изготавливали в соответствии с общими правилами фармацевтической технологии: в перколяторах и в мацерационных баках.
Для приготовления настоек и экстрактов использовали спирт этиловый 70% (ВФС 42-3382-99). Полученные лекарственные формы контролировали на соответствие требованиям общих фармакопейных статей: "Настойки"- ГФ XI вып. 1, стр. 148-149; "Экстракты" - ГФ XI, стр. 171-172. Определение концентрации спирта проводили в соответствии с ГФ XI, вып. 1, стр. 26-29. Определение тяжелых металлов проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 3, стр 148, 161.
Сухой остаток определяли по фармакопейной методике ГФ XI, вып. 2, стр 149, 161. Определение экстрактивных веществ проводили в соответствии с ГФ XI, вып. 1, стр. 295. Испытания на микробиологическую чистоту проводили в установленном порядке: ГФ XI, вып.2, стр. 193 [45,46,50] и Изменение №2 к ГФ XI.
Срок годности лекарственных форм определяли в естественных условиях хранения, в прохладном, защищенном от света месте. Статистическую обработку экспериментальных данных (Р=95%) фитохимических исследований проводили при помощи критерия Стьюдента с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения (ГФ XI, вып. 1, стр. 199) [46]. Отсутствие систематической ошибки разработанных методик подтверждали опытами с добавками.
Метод мацерации
В мацерационный бак помещали необходимое количество сырья «Ноготков цветки» и заливали трехкратным по отношению к массе сырья объемом экстрагента. Выдерживали для набухания в течение 1 часа. Затем настаивали сырьё с прописанным объемом экстрагента при комнатной температуре в течение 7 суток с периодическим перемешиванием мешалкой. После этого сырье отжимали и замеряли объем полученной вытяжки. Объемом экстрагента, равным недостатку, промывали сырьё, повторно отжимали и обе порции извлечения объединяли [45,46,73].
Метод перколяции Данный метод в классическом лабораторном исполнении для получения настоек 1:5 из сырья «Ноготков цветки». Он заключался в пропускании через сырье непрерывного потока всего рассчитанного количества экстрагента [45,46,73]. Для этого в мацерационный бак помещали необходимое количество сырья и заливали 2- кратным по отношению к массе ЛРС объемом экстрагента. Оставляли для набухания на 1,5 часа. Набухший материал загружали в перколятор на ложное дно достаточно плотно, чтобы в сырье оставалось как можно меньше воздуха. Сверху сырье прижимали перфорированным диском. Экстрагентом заливали сырье (при открытом кране для вытеснения воздуха) непрерывным потоком. Как только экстрагент начинал вытекать в приемник, кран перколятора закрывали, экстрагент возвращали на сырье и добавляли его до "зеркала", толщина которого составляла 30-40 мм. Мацерационная пауза составляла 24 часа. Затем у перколятора открывали кран, а на сырье непрерывно, с постоянной скоростью подавали экстрагент. Перколировали до получения заданного количества настойки.
Метод модифицированной мацерации
Разработан на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ. Данный метод получения настойки заключается в сочетании методов дробной мацерации (в случае настоек - с делением сырья на равные части) и термической экстракции, где экстрагент делится на три равные части [98,99]. Данный способ был апробирован раннее на нескольких видах сырья содержащего фенилпропаноиды и их производные, что нашло отражение в патентах РФ на изобретение (№2102999, №2134584, №2133620 и др.).
Микроскопический анализ проводили на образцах цветков календулы лекарственной сорта «Кальта», аналогичных тем, которые использовались для изучения химического состава.
Приготовление микропрепарата «Цветки календулы лекарственной»: «строение эпидермиса язычкового цветка календулы лекарственной (сорт «Кальта»). Подготовку препарата вели путем предварительного нагревания сырья «Цветки календулы лекарственной». В термостойкую колбу вместимостью 50 мл помещали 3-5 соцветий календулы лекарственной, заливали «до зеркала» водой очищенной и кипятили на водяной бане в течение 5 мин. Затем колбу охлаждали и сырье переносили в чашку Петри, заливая при этом спирто-водно-глицериновой смесью (1:1:1). Долее, выдерживали иля набухания, сырье при комнатной темп, в течение 2 часов. Просветление микропрепарата проводили двумя способами (ГФ XI издания стр. 278).
1. Несколько кусочков сырья помещали в колбу или пробирку, прибавляли 5% раствор едкого натра, разведенный водой (1:1), и кипятили в течение 1-2 мин. Затем содержимое выливали в чашку Петри (или фарфоровую), жидкость сливали и сырье тщательно промывали водой очищенной. Из воды кусочки сырья вынимали скальпелем или лопаточкой и помещали на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата или глицерина [46].
2. Кусочки кипятили в растворе хлоралгидрата, разведенного водой (1:1), в течение 5-10 мин (до просветления). Просветленные кусочки сырья помещали на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата или глицерина, разделяли скальпелем или препаровальной иглой на две части, одну из них осторожно переворачивали. Объект накрывали покровным стеклом, слегка подогревали до удаления пузырьков воздуха и после охлаждения рассматривлит с обеих сторон под микроскопом [46].
Приготовление микропрепарата на основе пыльцы календулы лекарственной
Календула лекарственная или ноготки {Calendula officilalis L.) - одно из самых популярных растений в народной и научной медицине. Препараты на основе цветков данного растения обладают широким спектром биологической активности, включая противовоспалительное, спазмолитическое, желчегонное, противомикробное, успокаивающее, противоотечное, антитоксическое, гипосенсибилизирующее, антимитотическое, репаративное, противовирусное, ранозаживляющее действие [19,44,48,69,123]. Лечебные свойства календулы обусловлены наличием в сырье комплекса биологически активных соединений (БАС), а именно: каротиноидов, флавоноидов, тритерпеновых сапонинов и целого ряда сопутствующих веществ [71,123].
В настоящее время, наряду с определением внешних и микроскопических диагностических признаков, значительное место в комплексной оценке подлинности и качества ЛРС занимает фитохимический анализ.
Согласно современным требованиям нормативной документации (НД) на ЛРС, фитохимический анализ включает задачи качественного и количественного анализа ЛРС по содержанию ведущих групп БАС, обеспечивающих фармакологическую активность.
Так, в нормативной документации на сырье «Ноготков цветки» отсутствуют разделы «Качественные реакции» и «Количественное определение» [38,45,46,129], следовательно, для целей идентификации сырья не используются химические диагностические признаки. В этом отношении особый интерес представляет тонкослойная хроматография, которая в последнее время все более широко используется в методиках качественного анализа.
Учитывая высокое содержание флавоноидов в цветках календулы лекарственной, их несомненную значимость в проявлении биологической активности данного сырья, представляется целесообразным изучение компонентного состава календулы для обоснования возможности стандартизации данного лекарственного растительного сырья по содержанию флавоноидов.
Необходимость во внесении изменений в ФС «Ноготков цветки» (ст. 5 ГФ XI издания) объясняется в данном случае отсутствием разделов: «Качественные реакции» и «Количественное определение». В имеющихся методиках качественного и количественного анализа на препарат «Календулы настойка» имеется ряд неточностей и ошибок.
В методиках качественного анализа на препарат «Календулы настойка» [129] не используется метод тонкослойной хроматографии. Кроме того, определение подлинности препарата «Календулы настойка» по содержанию дубильных веществ, на наш взгляд, является нецелесообразным, так как доминирующим компонентом является, по результатам настоящих исследований, соединение флавоноидной природы.
Кроме того, в литературе описаны методики определения подлинности сырья «Ноготков цветки» [46,77] путем обнаружения рутина, однако, по результатам проведенных нами исследований данное соединение в соцветиях календулы лекарственной не обнаружено, что говорит о несостоятельности данных методик.
В этой связи, нами предложены новые подходы к стандартизации, заключающиеся в обнаружении доминирующего и диагностического флавоноида нарциссина в присутствии ГСО рутина (качественные реакции), а также определение суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии. 5.1 Качественный анализ
С целью определения подлинности сырья «Ноготков цветки», использовали ТСХ-анализ, основанный на обнаружении и идентификации доминирующего флавоноида и качественные реакции.
В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющие эффективно разделить основные компоненты сырья и однозначно идентифицировать доминирующее БАС - нарциссин.
В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами (хлороформ-этанол, хлороформ-метанол, хлороформ-метанол-вода в различных соотношениях) предпочтение было отдано системе растворителей хлороформ-метанол-вода (26:14:3), обеспечивающей наиболее четкое разделение флавоноидов, в том числе и доминирующего компонента 3-О-рутинозид изорамнетина. При просмотре хроматограммы в УФ-спектре при длине 254нм 3-О-рутинозид изорамнетина обнаруживается в виде доминирующего пятна с ярко-фиолетовой флуоресценцией (Rf около 0,5).
Для обнаружения вещества хроматограмму просматривали в видимом свете, УФ-свете (254 и 366 нм) и после проявления с раствором диазобензолсульфокислоты. При обработке реактивом хроматографические пластинки нагревали при температуре ПО С в течение 5 минут в сушильном шкафу. При этом 3-О-рутинозид изорамнетина проявляется в виде хорошо заметного пятна желто-оранжевого цвета (рис. 16.). Следовательно, описанная в литературе методика [45,46,77], в соответствии с которой доминирующий флавоноид цветков календулы лекарственной трактуется как рутин, требует критического пересмотра.
Методика ТСХ-анализа цветков календулы лекарственной
В результате проведенных исследований нами предложен следующий режим настаивания: для каждой загрузки технологическая схема предусматривает две термические и четыре нетермические экстракции. Мацерационная пауза термической экстракции всегда составляет 6 часов, нетермической - 6 ч в первую половину рабочего дня (нечетные этапы схемы) и 18 ч во вторую половину рабочего дня (четные этапы схемы).
Метод модифицированной мацерации
1-й день 150,0 г измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, цветков календулы лекарственной распределяют по 50,0 г. в три экстрактора. В первый экстрактор заливают полуторократное количество 70% этилового спирта (75 мл) для набухания в течение 3 часов и затем 5 объемов экстрагента (250 мл) для экстракции сырья в течение 24 часов при комнатной температуре. Во второй экстрактор помещают 75 мл 70% этилового спирта для замачивания сырья в течение 24 часов.
2-й день. Из первого экстрактора переливают 250 мл извлечения во второй экстрактор и оставляют на 24 ч при комнатной температуре. В первый экстрактор заливают 250 мл свежего экстрагента и оставляют на
24 часа при комнатной температуре. В третий экстрактор помещают 75 мл 70% этилового спирта для замачивания.
3-й день. Из второго экстрактора переливают 250 мл извлечения в третий экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре для экстракции, из первого экстрактора переливают 250 мл извлечения во второй экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. В первый экстрактор заливают 250 мл свежего экстрагента и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. 4-й день. Осуществляют слив извлечения из третьего экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Из второго экстрактора переливают 250 мл извлечения в третий экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. В первом экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником при температуре 60 С в течение 30 мин. Полученное извлечение из первого экстрактора переливают во второй экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. Сырье из первого экстрактора является отработанным. 5-й день. Осуществляют слив извлечения из третьего экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Во втором экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником при температуре 70-80 С в течение 30 мин. Полученное извлечение из второго экстрактора переливают в третий экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. Сырье из второго экстрактора является отработанным.
6-й день. В третьем экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником при температуре 70-80 С в течение 30 мин. Полученное извлечение из третьего экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Сырье из третьего экстрактора является отработанным.
Полученный готовый продукт составляет (750 мл). Его выдерживают при температуре 8С в течение 2-3 дней и фильтруют.
Содержание суммы флавоноидов в полученном образце настойки календулы лекарственной составляет 0,57%, что в 1,2 раза выше по сравнению с настойкой полученной методом перколяции (табл. 13). Сухой остаток Определяется по фармакопейной методике (ГФ XI, вып. 2, стр. 161). Нижний предел данного показателя - 4,0%, обусловлен содержанием ведущей группы БАС - флавоноидов (нарциссин, изокверцитрин), каротиноидов, сапонинов, фенилпропаноидов и других сопутствующих соединений.
Испытания на микробиологическую чистоту проводились в установленном порядке (ГФ XI, вып. 2, с. 193 и Изменения №3 к ГФ XI) на питательных средах, соответствующих ГОСТ и ТУ. При проведении испытаний препарата установлено, что в 1 мл лекарственного средства содержится менее 10000 аэробных бактерий, энтеробактерий менее 100, а грибы отсутствуют (разведение образца 1:10). Испытания по выявлению и идентификации бактерий Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus показали их отсутствие в препарате.
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
![Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс]](/i/i/4374/196937.png "Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс] Файзуллина Рената Ринатовна")