Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований чистотела большого и маклейи (обзор литературы) 12
1.1. Чистотел большой 12
1.1.1. Историческая справка 12
1.1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика чистотела 14
1.1.3. Распространение 15
1.1.4. Сырье 16
1.1.5. Заготовка 16
1.1.6. Сушка и хранение 17
1.1.7. Требования к качеству 18
1.1.8. Химический состав 18
1.1.9. Стандартизация 27
1.1.10. Фармакологические свойства 28
1.1.11. Применение 30
1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика маклейи 34
1.2.1. Места обитания. Распространение 37
1.2.2. Размножение 37
1.2.3. Заготовка и качество сырья 38
1.2.4. Химический состав 39
1.2.5. Использование 39
1.2.6. Применение в медицине 39
Выводы к главе 1 43
Экспериментальная часть
Глава 2. Объекты и методы исследования 44
2.1. Объекты исследования. 44
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Метод микроскопических исследований ЛРС 45
2.2.2. Метод колоночной хроматографии 46
2.2.3. Метод ТСХ 47
2.2.4. Метод хроматоспектрофотометрии 48
2.2.5. Метод 'Н-ЯМР-спектроскопии 49
2.2.6. Качественные реакции 49
2.2.7. Методы, использованные для получения лекарственных средств и определения числовых показателей 50
Глава 3. Исследование химического состава лекарственного сырья чистотела большого и маклейи мелкоплодной 53
3.1. Получение суммы биологически активных веществ из сырья и их хроматографическое разделение 53
3.1.1. Получение суммы биологически активных веществ из сырья чистотела большого 53
3.1.2. Получение суммы биологически активных веществ из сырья маклейи мелкоплодной 56
3.2. Изучение химической структуры и определение физико-химических характеристик выделенных соединений и их производных 58
Выводы к главе 3 69
Глава 4. Совершенствование методов стандартизации лекарственного сырья и препаратов чистотела большого 70
4.1. Микроскопия 71
4.2. Качественный анализ 76
4.3. Количественное определение суммы алкалоидов в траве и настойке чистотела большого 81
4.4. Количественное определение суммы флавоноидов в траве чистотела большого 87
Выводы к главе 4 93
Глава 5. Совершенствование методов стандартизации травы маклейи мелкоплодной 95
5.1. Качественный анализ травы маклейи с использованием ТСХ-анализа 96
5.2. Качественный анализ травы маклейи с использованием УФ-спектроскопии 98
5.3. Количественное определение суммы флавоноидов в траве
маклейи мелкоплодной 99
Выводы к главе 5 104
Глава 6. Исследования по разработке лекарственного средства «Маклейи настойка» 105
6.1. Разработка технологических способов получения препарата «Маклейи настойки» 106
6.2. Определение антимикробной активности настойки травы маклейи мелкоплодной 110
6.3. Разработка методов стандартизации препарата «Маклейи настойка» 111
6.3.1. Качественный анализ препарата «Маклейи настойка» с использованием ТСХ-анализа и УФ-спектроскопии 111
6.3.2. Количественное определение суммы алкалоидов в настойке
маклейи мелкоплодной 113
Выводы к главе 6 117
Общие выводы 118
Список литературы
- Ботанико-фармакогностическая характеристика чистотела
- Метод колоночной хроматографии
- Получение суммы биологически активных веществ из сырья маклейи мелкоплодной
- Количественное определение суммы алкалоидов в траве и настойке чистотела большого
Введение к работе
Актуальность темы. В медицинской практике с целью профилактики
и лечения различных заболеваний широко используются
противовоспалительные, антимикробные и регенерирующие
лекарственные средства растительного происхождения. Однако проблема создания эффективных фитопрепаратов данного спектра действия по-прежнему остается актуальной. Это связано с тем, что лекарственные средства на основе природных биологически активных соединений (БАС) обладают рядом преимуществ по сравнению с их синтетическими аналогами, так как широта терапевтического действия фитопрепаратов сочетается с минимальными побочными эффектами, что особенно важно при лечении хронических заболеваний. Такие свойства препаратов обеспечивает ряд биологически активных соединений растительного происхождения, в том числе и алкалоиды.
Перспективными источниками получения антимикробных лекарственных средств являются трава чистотела большого {Chelidonium majus L.) и трава маклейи (Macleaya Sp.) - видов сем. Маковых (Papaveraceae). Ранее при химическом изучении чистотела большого было обнаружено, что в нем содержатся алкалоиды сангвинарин и хелеритрин, и трава чистотела большого была предложена в качестве источника получения данных алкалоидов [180]. Однако в дальнейшем было установлено, что вследствие низкого содержания сангвинарина и хелеритрина, производство препарата «Сангвиритрин» из травы чистотела большого экономически нецелесообразно. Поиски данных алкалоидов в других растениях сем. Маковых привели к тому, что вследствие высокого содержания сангвинарина и хелеритрина в траве маклейи данное растение рекомендовано для получения лекарственного средства «Сангвиритрин». Препарат «Сангвиритрин», представляющий собой сумму бисульфатов алкалоидов сангвинарина и хелеритрина нашел широкое применение в
дерматологии, стоматологии, гинекологии и неврологии. Данный препарат обладает широким спектром антимикробной активности, ингибируя развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжеподобных и мицелярных грибов, патогенных простейших. В числе положительных качеств отмечают высокую эффективность, хорошую переносимость, отсутствие общетоксических и местнораздражающих свойств, отсутствие явления резистентности даже при длительном применении.
Несмотря на многолетний опыт применения данных растений в медицинской практике, проблема более подробного изучения химического состава данных растений, стандартизации и создания новых отечественных фитопрепаратов на их основе по-прежнему остается актуальной.
Оценка качества лекарственного растительного сырья (ЛРС) травы чистотела осуществляется в соответствии с ФС 47 ГФ СССР XI издания «Трава чистотела большого». Ранее были разработаны объективные методики качественного и количественного анализа сырья и препаратов чистотела большого, однако в них не предусмотрено использование государственного стандартного образца (ГСО) (Первушкин СВ.,2000; СохинаА.А., 1999).
Необходимость совершенствования нормативной базы возникает в связи с тем, что современные тенденции развития методов стандартизации лекарственных средств служат предпосылкой для формирования новых фармакопейных требований к их качеству (Арзамасцев А.П., 2000; Багирова В.Л., 2001). В отношении обсуждаемого объекта целесообразным представляется пересмотр разделов «Качественные реакции» и «Количественное определение», что обусловлено повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств (Самылина И.А., 1994).
Таким образом, представляется актуальным дальнейшее
фитохимическое исследование сырья чистотела большого и маклейи, а также поиск новых путей к решению проблемы химической стандартизации сырья и препаратов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фитохимическое исследование травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной и разработка новых подходов к решению проблемы стандартизации сырья и препаратов на их основе.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Сравнительное изучение химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной.
Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов чистотела большого и маклейи с учетом принципа унификации методик в ряду ЛРС — субстанция - лекарственная форма.
Разработка методик качественного анализа травы чистотела большого, а также галенового препарата «Чистотела настойка» с использованием стандартного образца коптизина.
Разработка методик количественного анализа травы чистотела большого и галенового препарата «Чистотела настойка» с использованием стандартного образца коптизина.
Разработка методик качественного анализа травы маклейи мелкоплодной и препарата «Маклейи настойка».
Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи.
Разработка и изучение в процессе хранения числовых показателей травы чистотела большого, а также препарата «Маклейи настойка».
Разработка проекта нормативной документации (НД) на траву чистотела большого, ГСО коптизина и галенового препарата «Чистотела настойка».
Научная новизна. В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого {Chelidoniiim majus L.) и
травы маклейи мелкоплодной (Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde), культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к алкалоидам и флавоноидам. Из травы чистотела большого впервые выделен нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина), а из травы маклейи мелкоплодной - рутин (3-О-рутинозид кверцетина). Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были использованы метод УФ-, ЯМР-спектроскопия, тонкослойно-хроматографического анализа (ТСХ), а также результаты различных химических превращений (кислотный, ферментативный гидролиз).
Обоснована необходимость использования в методиках качественного и количественного анализа травы чистотела большого и препаратах на его основе ГСО коптизина.
Обоснована целесообразность использования ТСХ и УФ-спектроскопии для определения подлинности сырья и препаратов маклейи.
Практическая значимость. Охарактеризованы выделенные и идентифицированные доминирующие вещества травы чистотела большого и травы маклейи: коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин, рутин, нарциссин и изорамнетин.
Разработаны методики качественного и количественного анализа травы чистотела большого с использованием ГСО коптизина.
Разработаны методики качественного анализа травы маклейи с использованием ТСХ-анализа, ГСО сангвиритрина и УФ-спектроскопии.
Определены и изучены в процессе хранения числовые показатели качества травы чистотела большого, травы маклейи, препарата «Маклейи настойка», в том числе «Содержание алкалоидов», «Сухой остаток», «Концентрация спирта», «Микробиологическая чистота.
Разработаны проекты фармакопейных статей «Чистотела большого трава», «Коптизин - стандартный образец», фармакопейной статьи
предприятия «Чистотела настойка».
Результаты исследований используются в научных изысканиях и учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (акты внедрения № 1-2 от 03.09.07 г.).
Положения, выносимые на защиту:
Результаты сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной.
Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации сырья чистотела большого и маклейи, а также препаратов на их основе.
Методики качественного и количественного анализа сырья чистотела большого и препарата «Чистотела настойка» с использованием ГСО коптизина.
Методики качественного анализа травы маклейи мелкоплодной и препарата «Маклейи настойка» с использованием ТСХ-анализа, ГСО сангвиритрина и УФ-спектроскопии.
Методика количественного анализа флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной.
Результаты исследований показателей качества ЛРС «Чистотела большого трава» и лекарственного средства «Маклейи настойка».
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим
планом научно-исследовательских работ Государственного
образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Государственная регистрация № 012001053332) и республиканских программ:
«Совершенствование лекарственного обеспечения населения и
лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).
«Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на X и XI Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2005; 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2006); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); V Международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2007); III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007).
Основное содержание работы опубликовано в 9 научных работах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 31 рисунок. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 208 источников, из которых 28 — на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена научная новизна и практическая
значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
Ботанико-фармакогностическая характеристика чистотела
Чистотел большой - многолетнее травянистое растение высотой 30-100 см., что и подчеркивает видовое название majus — большой. Корень стержневой, ветвистый, снаружи красно-бурый, внутри желтый. Стебель прямостоячий, ребристый, полый, в верхней части разветвляющийся, голый или с редкими волосками, в узлах густо опушенный. Листья очередные, сверху зеленые, снизу сизоватые, нижние - черешковые, стеблевые - сидячие. Пластинки листьев в очертании широкоэллиптические, глубоконепарноперисто-раздельные с извилисто-лопастными или надрезанно-городчатыми долями. Цветки собраны по 3— 8 штук в зонтиковидные соцветия. Чашечка состоит из двух чашелистиков, которые опадают сразу при распускании цветка. Венчик цветков правильной формы состоит из четырех ярко-желтых лепестков. Тычинки многочисленные, пестик с удлиненной одногнездной завязью, развивающейся в одногнездную стручковидную коробочку длиной до 5 см. Семена в коробочке расположены в два ряда. Открывается плод от основания вверх двумя створками. Семена мелкие, блестящие, черные или темно-оливковые, яйцевидной формы. На каждом семечке имеются придатки (присеменники) белого цвета. Растение очень плодовито, один экземпляр может давать до 36 000 штук семян. Цветет с мая до осени.
Плоды созревают в июне-июле. После скашивания в фазу цветения наблюдается вторичное цветение в июле-августе. В годы с обильными осадками во второй половине лета и без скашивания наблюдается вторичное цветение. Все части растения содержат желто-оранжевый млечный сок с характерным запахом и жгучим вкусом [105, 107, 111].
Род Chelidoniwn следует считать монотипным. Растение, известное в средние века под названием чистотел малый, сейчас называют чистяком весенним (оно выделено в самостоятельный род и отнесено к другому семейству). Описанные ранее близкие Chelidoniwn majus виды,
Chelidonium laciniatum Mill. (1768) и Chelidonium grandiflorum DC (1824) являются классическим примером мутаций того же Chelidonium majus. Chelidonium laciniatum Mill., представляя собою западную форму, может встретиться у нас во всех западных областях и указывался для Московской и Ленинградской обл. Он отличается от типа сильной надрезанностью листовых сегментов, рассеченных на ланцетные острые доли, а также лепестками надрезано-рассеченными или, по крайней мере, цельным и острыми. Chelidonium grandiflorum отличается часто более крупным венчиком и более короткими коробочками, которые нередко короче плодоножек; прицветники у него шире, яйцевидные, тупые. Он встречается главным образом в Южной Сибири, от Алтая до Даурии. Оба названных вида растут в пределах распространения обычной «типичной» формы и связаны с ней переходами. Сибирский тип отличается от европейско-кавказского более вытянутыми, узкими сегментами листьев, часто большим числом прикорневых листьев и более многочисленными сегментами; кроме того, он почти всегда имеет пушистые снизу листья. На западе распространен тип голосистый с более широкими овальными сегментами [140].
Это растение очень широко распространено по всей европейской части России, также произрастает в Сибири (от Тюменской области до Тихого океана), на Кавказе, в Казахстане, Киргизии, Средней Азии. Чистотел большой является сорной травой. Растет в садах, огородах, парках, встречается в замусоренных местах, на обочинах дорог, кюветах, оврагах, канавах, по берегам рек и озер. Но встречается также и в разреженных лесах — хвойных и смешанных, на вырубках, просеках и прогалинах, гарях, образуя в этих местах редкие заросли. Растет он, как правило, небольшими группками, но может образовывать и заросли. Чистотел любит увлажненные и плодородные почвы, плохо переносит бедные и истощенные [15, 112, 117]. Сырье. Лекарственным сырьем служит собранная в фазу цветения трава многолетнего травянистого растения чистотела большого.
Внешние признаки: Цельные или частично измельченные олиственные стебли с цветками и плодами различной степени развития, кусочки стеблей, листья, цветки и плоды. Стебли слегка ребристые, иногда ветвистые, в междоузлиях полые, слабоопушенные, длиной до 50 см. Листья очередные, черешковые, в очертании широкоэллиптические, пластинки непарноперисторассеченные с 3-4 парами городчатолопастных сегментов. Бутоны обратнояйцевидные с двумя опушенными чашелистиками, опадающими при распускании цветка. Цветки по 4-8 в пазушных зонтиковидных соцветиях на цветоносах, удлиняющихся в период плодоношения. Венчик из 4 обратнояйцевидных лепестков, тычинок много. Плод - продолговатая, стручковидная, двустворчатая коробочка. Семена многочисленные, мелкие, яйцевидные с ямчатой поверхностью (под лупой), с мясистым белым придатком.
Цвет стеблей светло-зеленый, листьев с одной стороны зеленый, с другой - сизоватый, венчика — ярко-желтый, плодов — серовато-зеленый и семян от буроватого до черного. Запах своеобразный. Вкус не определяется [61, 111].
Метод колоночной хроматографии
С использованием колоночной хроматографии изучался химический состав травы чистотела большого на этапе препаративного разделения веществ. Измельченное (3-5 мм) воздушно-сухое растительное сырье чистотела большого (150 г) экстрагировали десятикратным количеством 70% этилового спирта методом настаивания. Для полного истощения сырья две последующие экстракции проводили в условиях кипящего растворителя. Объединенные экстракты упаривали на ротационном упарителе под вакуумом при температуре 40-60С. Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100 (30 г).
Препаративное разделение экстрактивных веществ осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии с использованием следующих сорбентов: 1. Силикагель марки L 40/100 мкм (Чехия); 2. Полиамид Woelm (Германия). В хроматографическую колонку на слой силикагеля, сформированный в хлороформе (высота сорбента - 8 см, диаметр - 6 см), переносили сухой порошок (экстракт+силикагель). Колонку элюировали хлороформом, а также хлороформом, содержащим в различных концентрациях этиловый спирт (3%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%).
Эффективного разделения и очистки веществ удалось добиться чередованием указанных сорбентов и соответствующих систем растворителей (хлороформ-этиловый спирт, этиловый спирт-вода в различных соотношениях).
Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ. Для ТСХ анализа водно-спиртовых извлечений из травы чистотела большого и выделенных соединений использовали пластинки «Силуфол УФ-254» (Чехия) и «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия). Пластинки предварительно активировали в сушильном шкафу не менее 1 ч при температуре 100-105 С для четкого разделения компонентов. С той же целью хроматографическую камеру насыщали парами системы растворителей не менее 24 ч. Анализ проводили при комнатной температуре, фронт прохождения растворителя составлял около 9 см (Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ) и 13 см (Силуфол УФ-254). Хроматографическое разделение веществ осуществлялось в системах растворителей А-В.
Бумажную хроматографию (БХ) Сахаров осуществляли на бумаге FN-11, FN-15 в нисходящем токе растворителей. При этом использовались системы растворителей Г-Е.
Хроматографический анализ выполнен с использованием следующих систем растворителей при комнатной температуре: А - хлороформ:метанол:вода, 26:14:3 Б - хлороформ:этанол, 2:1 В - хлороформ:этанол, 9:1 Г - этилацетат-н-пропанол-вода, 7:2:1 Д - 15% уксусная кислота Е - н-бутанол-уксусная кислота-вода, 4:1:2. Обнаружение пятен проводили в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм до и после обработки хроматограмм 1% спиртовым раствором АІСІз (флавоноиды и др. компоненты), 1% спиртовым раствором FeCl3 и содовым (ТЧагСОз) свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты (фенольные соединения) и реактивом Драгендорфа.
Приготовление щелочного раствора диазобензолсульфокислоты: 0,01 г диазобензолсульфокислоты (ГФ-Х, с. 876-877) растворяли в 10 мл 10% раствора натрия карбоната. Раствор использовали свежеприготовленным (для обнаружения фенольных соединений).
Приготовление реактива Драгендорфа (ГФ XI, вып 1, стр. 300): Раствор I: 0,85 г азотнокислого основного висмута растворяют в смеси из 40 мл воды и 10 мл уксусной кислоты. Раствор II: 8 г йодида калия растворяют в 20 мл воды. Смешивают равные объемы растворов I и II. К 10 мл полученной смеси прибавляют 100 мл воды и 20 мл уксусной кислоты (для обнаружения алкалоидов).
Метод спектрофотометрии использовали для изучения возможности проведения качественного анализа и количественной оценки содержания суммы алкалоидов в сырье и препаратах чистотела большого. Для этих целей использовали метод прямой УФ-спектроскопии, а также хроматоспектрофотометрии. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра Specord 40 (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10мм. Раствором сравнения служил 70% спирт этиловый. Спектрофотометрическое исследование проводили также для качественной и количественной оценки содержания суммы флавоноидов в сырье и препаратах чистотела большого и сырье маклейи. Для этих целей использовали метод дифференциальной спектроскопии (с использованием комплексообразующих добавок). Кроме того, метод УФ-спектроскопии использовали для идентификации выделенных веществ в совокупности с данными результатов химических превращений и ЯМР-спектров.
С помощью данного метода изучены спектральные свойства индивидуальных веществ. Спектры ЯМР- Н записаны на приборе Gemini-200 фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц. Величины химических сдвигов приведены по шкале 8. Внутренний стандарт - тетраметилсилан (=0). Приняты следующик сокращения: с-синглет, д-дуплет, т-триплет, дд-двойной дуплет, кв-квартет, м-мультиплет.
Получение суммы биологически активных веществ из сырья маклейи мелкоплодной
Измельченное (3-5 мм) воздушно-сухое растительное сырье маклейи мелкоплодной (100 г) экстрагировали десятикратным количеством 70% этилового спирта методом настаивания. Для полного истощения сырья две последующие экстракции проводили в условиях кипящего растворителя. Объединенные экстракты упаривали на ротарном испарителе под вакуумом при температуре 40-60С. Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100 (30 г).
Препаративное разделение экстрактивных веществ осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии с использованием силикагеля марки L 40/100 мкм (Чехия). В хроматографическую колонку на слой силикагеля, сформированный в хлороформе (высота слоя сорбента - 8 см, диаметр - 6 см), переносили сухой порошок (экстракт+силикагель). Колонку элюировали хлороформом, а также хлороформом, содержащим в различных концентрациях этиловый спирт (3%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%) (Колонка № 4). Кристаллизацию и перекристаллизацию веществ осуществляли с использованием различных растворителей: воды, этанола (рис. 2).
Сангвинарин: Фракции с колонки № 4, содержащие преимущественно сангвинарин (10 % EtOH в хлороформе), объединяли и упаривали до сиропообразного остатка.
Хелеритрин: Фракции с колонки № 4, содержащие преимущественно хелеритрин (15 % EtOH в хлороформе) объединяли и упаривали до небольшого остатка.
Рутин: Фракции, содержащие преимущественно рутин (30 % EtOH в хлороформе), объединяли и упаривали до небольшого объема. Упаренные фракции, содержащие рутин, с колонки № 4, профильтровывали через слой полиамида (высота- 3,0 см, диаметр - 4,0 см).
Затем полиамид промывали водой, а также 20 %, 40 %, 70 %, 96 % спиртом по 20 мл (Колонка № 5). Фракции, содержащие преимущественно рутин (20 % ЕЮН в хлороформе), объединяли, упаривали до небольшого объема и оставляли для кристаллизации. Отсутствие примесей в получаемом соединении контролировали методом ТСХ.
Для установления структуры выделенных веществ использованы данные ТСХ-анализа, УФ-, Н-ЯМР-спектров, а также результаты химических превращений (кислотный и ферментативный гидролиз) и непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции.
В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого (Chelidonium majus L.) и травы маклейи мелкоплодной (Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde), культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к алкалоидам (коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин) и флавоноидам (нарциссин, изорамнетин, рутин) (табл. 2).
Коптизин (1). Н-ЯМР-спектр соединения ( J _) в смеси d-ацетона и D20 (1:1) содержит сигналы протонов, характерные для молекулы коптизина: четыре однопротонных синглетных сигнала при 9,79 м.д. (С-8), 8,76 м.д. (С-13), 7,87 м.д. (С-1) и 7,61 м.д. (С-4), два двухпротонных триплета с константой спин-спинового взаимодействия (J) 6 Гц при 3,29 (С-5) и 4,95 м.д. (С-6), два двухпротонных дублетных сигнала (J = 9 Гц) при 6,90 м.д. (С-11) и 7,98 м.д. (С-12), а также два двухпротонных синглетных сигнала при 6,09 и 6,45 м.д., принадлежащих метилендиоксигруппам при С-2,3 и С-9,10 соответственно (Приложение. Рис. 1).
Берберин (2). На стартовую линию пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия) (10x5см) в присутствии достоверно известного образца наносят микропипеткой 0,02 мл раствора из фракции содержащей берберин (40 % этанол; Колонка № 2). Пластинку высушивают на воздухе в течение 5 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ:метиловый спирт:вода (26:14:3) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 9 см, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе в течение 5 минут. Пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм до и после обработки хроматограмм реактивом Драгендорфа. При этом на хроматограмме обнаруживается пятно с величиной Rf около 0,2, имеющее желтую окраску в видимом свете и ярко-желтую флуоресценцию при просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм, а также кирпично-красную окраску при проявлении реактивом Драгендорфа (рис. 3).
Количественное определение суммы алкалоидов в траве и настойке чистотела большого
Когда фронт растворителей пройдет около 9 см, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе в течение 5 минут. Пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны 254 и 366 нм до и после обработки хроматограмм реактивом Драгендорфа. Примечание.
1. Подготовка пластинок: Пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия) разрезают поперек линий накатки на 3 части размером 10x5см и высушивают в сушильном шкафу при температуре 100-105С в течение 1 часа.
2. Приготовление раствора РСО коптизина. Около 0,02 г ГСО коптизина (ФС 42- ) (точная навеска) растворяют в 15 мл этилового спирта 95% в мерной колбе вместимостью 25 мл при нагревании на водяной бане при температуре от 70 до 90С. Раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до метки 95% этиловым спиртом и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом 95% и перемешивают (раствор Б). Срок годности раствора 1 месяц.
В ФС 47 ГФ XI «Трава чистотела» нами предлагается включить раздел «Качественные реакции», а именно методику, основанную на обнаружении доминирующего алкалоида коптизина с использованием ТСХ и ГСО коптизина.
Методика качественного анализа травы чистотела большого методом УФ-спектроскопии
1 мл извлечения из травы (методика приготовления см. раздел Методика качественного анализа травы чистотела большого методом ТСХ) фильтруют через оксид алюминия в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 70 % спиртом до метки (испытуемый раствор А).
Ультрафиолетовый спектр раствора А должен иметь полосу поглощения с максимумами при 280 нм±2 нм, 360 нм±2 нм и 460нм ±2 нм (рис. 22). Методика качественного анализа препарата чистотела настойка методом ТСХ На линию старта пластинки "Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ" микропипеткой наносят 0,05 мл препарата и рядом 0,02 мл (16 мкг) 0,08 % раствора А РСО коптизина. Пластинку с нанесенными пробами помещают в вертикальную камеру, которую предварительно насыщают не менее 24 ч смесью растворителей: хлороформ:метанол:вода 26:14:3, и хроматографируют восходящим способом.
Когда фронт растворителей пройдет около 9 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 5 мин и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм. Методика качественного анализа препарата чистотела настойка методом УФ-спектроскопии 5,00 мл настойки чистотела помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 70 % спиртом до метки (раствор А). 1 мл раствора А фильтруют через оксид алюминия в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора 70 % спиртом до метки (раствор Б). УФ-спектр раствора Б должен иметь три характерных максимума поглощения: 280 нм+2 нм, 360 нм+2 нм и 460 нм+2 нм (рис.22).
Учитывая тот факт, что доминирующими БАВ травы чистотела большого являются алкалоиды, представляется целесообразным проводить анализ данного вида сырья именно по этой группе веществ. С целью исключения завышенных результатов анализа нами введена стадия очистки на хроматографической колонке со слоем оксида алюминия. Полученный при этом очищенный элюат (испытуемый раствор) имеет характер кривой поглощения, близкий к таковому раствора РСО коптизина (рис.22, 23).
При этом наиболее показательным и для УФ-спектров раствора коптизина и очищенного испытуемого раствора является максимум поглощения при длине волны 360 нм. В качестве аналитической была выбрана длина волны 360 нм еще и по той причине, что в этой области поглощают и другие алкалоиды, содержащиеся в траве чистотела большого (хелидонин, сангвинарин, хелеритрин). Опыты с коптизином показали, что потери алкалоидов в условиях очистки на оксиде алюминия не наблюдаются.
По данным литературы установлено, что наибольшее извлечение алкалоидов из сырья чистотела большого достигается при размере частиц 1 мм и экстракции сырья 70 % этиловым спиртом в соотношении 1:30 на кипящей водяной бане (умеренное кипение). В ходе разработки методики количественного определения суммы алкалоидов изучено влияние времени экстракции на извлечение целевого продукта (табл. 3). Кроме того, с экономическими целями был учтен тот факт, чтобы полученное извлечение могло быть в дальнейшем использовано при количественном анализе суммы флавоноидов в траве чистотела большого. В ходе предварительных исследований было показано, что наибольшее извлечение алкалоидов из сырья чистотела большого достигается при экспозиции 45 мин на кипящей водяной бане (умеренное кипение).
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
