Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние исследований видов рода Hypericums. (обзор литературы) 15
1.1. Морфолого-анатомические и экологоценотические признаки видов рода Hypericum L 15
1.1.1. Ботаническое описание некоторых видов рода Hypericum L 15
1.1.2. Анатомо-морфологическая характеристика сырья «Зверобоя трава» 22
1.1.3. Ареал обитания 26
1.1.4. Заготовка сырья «Зверобоя трава» и его природные запасы 27
1.1.5. Культивирование зверобоя продырявленного 29
1.2. Химический состав травы зверобоя 31
1.2.1. Характеристика важнейших групп биологически активных соединений из травы зверобоя 31
1.2.2. Динамика накопления биологически активных соединений в траве зверобоя 37
1.2.3. Исследование химического состава и проблемы стандартизации травы зверобоя 38
1.3. Фармакологические свойства препаратов зверобоя 49
1.3.1. Обзор номенклатуры препаратов на основе зверобоя травы 49
1.3.2. Характеристика основных лекарственных средств зверобоя травы 56
1.3.3. Возможные побочные действия и противопоказания к применению препаратов зверобоя травы 64
1.3.4. Анализ номенклатуры антидепрессантных лекарственных средств на фармацевтическом рынке РФ 66
Экспериментальная часть 70
Глава 2. Объекты и методы исследования 70
2.1. Объекты исследования 70
2.2. Методы исследования 71
2.2.1. Морфолого-анатомический и товароведческий анализ сырья видов Hypericum L 71
2.2.2. Колоночная хроматография 72
2.2.3. Методики проведения качественных реакций 73
2.2.4. Метод тонкослойной хроматографии 75
2.2.5. Метод УФ-спектроскопии 77
2.2.6. Технологические методы получения спиртовых препаратов зверобоя 77
2.2.7. Методики фармакологических исследований 78
Глава 3. Морфолого-анатомическое исследование сырья видов рода Hypericums 80
3.1. Морфологические признаки сырья видов рода Hypericum L 80
3.2. Микроскопические признаки сырья видов рода Hypericum L 86
Глава 4. Выделение биологически активных соединений из травы зверобоя продырявленного методом колоночной хроматографии 95
4.1. Исследования по выделению биологически активных соединений 95
4.2. Описание выделенных биологически активных соединений 96
Глава 5. Разработка новых подходов к стандартизации сырья и препаратов видов рода Hypericum L 110
5.1. Исследования по разработке методик качественного анализа для сырья и препаратов зверобоя 111
5.1.1. Разработка методики качественного анализа сырья и препаратов зверобоя травы 111
5.1.2. Методика качественного анализа сырья «Зверобоя трава» 115
5.1.3. Методика качественного анализа препарата «Зверобоя настойка» 120
5.1.4. Методика качественного анализа препарата «Зверобоя экстракт жидкий» 124
5.1.5. Методика качественного анализа препарата «Зверобоя экстракт сухой» 126
5.2. Исследования по разработке методики количественного анализа суммы флавоноидов в сырье и препаратах зверобоя 130
5.2.1. Исследования по разработке методики количественного анализа суммы флавоноидов в сырье зверобоя 130
5.2.2. Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве зверобоя 1 5.2.3. Исследования по разработке методики количественного анализа суммы флавоноидов препарата «Зверобоя настойка» 136
5.2.4. Методика количественного определения суммы флавоноидов в препарате «Зверобоя настойка» 136
5.2.5. Методика количественного определения суммы флавоноидов в препарате «Зверобоя экстракт жидкий» 138
5.2.6. Методика количественного определения суммы флавоноидов в препарате «Зверобоя экстракт сухой» 140
5.3. Исследования по разработке методики количественного анализа суммы антраценпроизводных в сырье и препаратах зверобоя 141
5.3.1. Исследования по разработке методики количественного анализа суммы антраценпроизводных в сырье зверобоя 141
5.3.2. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье «Зверобоя трава» 146
5.3.3. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в препарате «Зверобоя настойка» 146
5.3.4. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в препарате «Зверобоя экстракт жидкий» 147
5.3.5. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в препарате «Зверобоя экстракт сухой» 148
Глава 6. Сравнительное исследование надземных частей различных видов рода Hypericums 151
6.1. Исследование качественного состава извлечений из надземных частей различных видов рода Hypericum L 152
6.2. Количественный анализ извлечений из надземных частей различных видов рода Hypericum L 158
Глава 7. Обоснование целесообразности создания новых лекарственных средств на основе сырья и препаратов видов рода Hypericums 160
7.1. Оптимизация способа получения сырья зверобоя продырявленного высокого качества 160
7.1.1. Исследование различных видов сырья зверобоя продырявленного 160
7.1.2. Исследование показателей травы зверобоя в зависимости от длины стебля 166
7.1.3. Исследование динамики накопления биологически активных соединений в траве зверобоя продырявленного 168
7.1.4. Исследование степени измельченности сырья, используемого для анализа 174
7.1.5. Исследование травы зверобоя продырявленного, заготовленного в различных регионах РФ 175
7.1.6. Исследование суммы дубильных веществ в траве и препаратах зверобоя 177
7.1.7. Исследование режимов сушки сырья зверобоя 179
7.2. Разработка способов получения лекарственных средств на основе травы зверобоя 180
7.2.1. Оптимизация способа получения препарата «Зверобоя настойка» 180
7.2.2. Исследования по разработке препарата «Зверобоя экстракт жидкий» 185
7.2.3. Исследования по разработке препарата «Зверобоя экстракт сухой» 186
7.3. Изучение фармакологической активности новых препаратов на основе сырья видов рода Зверобой 192
Общие выводы 200
Список литературы 202
Приложения 246
- Ботаническое описание некоторых видов рода Hypericum L
- Описание выделенных биологически активных соединений
- Исследование качественного состава извлечений из надземных частей различных видов рода Hypericum L
- Изучение фармакологической активности новых препаратов на основе сырья видов рода Зверобой
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в медицинской практике наблюдается тенденция все более широкого применения фитопрепаратов для лечения и профилактики различных заболеваний. Это связано с тем обстоятельством, что лекарственные средства на растительной основе, как правило, сочетают в себе широту и мягкость терапевтического действия с отсутствием значительного числа побочных эффектов в случае рационального применения. Именно поэтому целесообразным является применение фитопрепаратов для лечения хронических заболеваний, в том числе патологий центральной нервной системы, главными причинами которых являются стресс, психоэмоциональное напряжение и экологическое неблагополучие окружающей среды. Перспективным источником растительных средств, на основе которого возможно получение отечественных эффективных антидепрессантных препаратов, являются виды рода Зверобой - Hypericum L.
В настоящее время в медицинской практике Российской Федерации применяется два вида рода Зверобой (Hypericum L.) – зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) и зверобой пятнистый (четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz., (синоним Hypericum quadrangulum L.) семейства Hypericaceae (Guttiferae). Так, трава обоих фармакопейных видов зверобоя в нашей стране служит для получения антимикробных, противовоспалительных, вяжущих и фотосенсибилизирующих средств, в то время как за рубежом на основе данного сырья производят эффективные антидепрессантные препараты, такие как «Деприм», «Негрустин» и «Гелариум Гиперикум», разрешенные к применению на территории РФ. Однако до сих пор нет единого мнения относительно характера нейротропного эффекта препаратов зверобоя: его трактуют седативным, антидепрессивным, а в некоторых случаях стимулирующим ЦНС. Противоречия касаются и химической природы биологически активных соединений (БАС) видов рода Hypericum L., обладающих нейротропным действием. Все это не способствует созданию на основе травы зверобоя импортозамещающих отечественных антидепрессантных лекарственных средств. Разработке отечественных антидепрессантных аналогов мешают и такие факторы, как недостаточная степень изученности химического состава видов рода Зверобой, отсутствие унифицированного подхода к анализу сырья и препаратов зверобоя (Самылина И.А., 1994). Кроме того, требуется оптимизация методик анализа как для сырья, так и препаратов, включая средство «Зверобоя настойка». Это обстоятельство связано с тем, что в действующей нормативной документации (НД) допущены существенные неточности. Кроме того, в случае зверобоя травы для определения подлинности сырья не используются современные физико-химические методы анализа.
Исследования по этой проблеме представляются актуальными и важными также ввиду того, что трава зверобоя широко применяется как в нашей стране, так и за рубежом, однако до сих пор многие проблемы оставались нерешенными. Так, в нашей стране качество сырья и препарата «Зверобоя настойка» оценивается методом дифференциальной спектрофотометрии по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин. В то же время, в препаратах импортного производства методом прямой спектрофотометрии оценивается содержание суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин. И тот, и другой подход к анализу имеет свои недостатки в силу того, что каждый из них в отдельности не позволяет в полной мере объективно охарактеризовать качество сырья и препаратов видов рода Зверобой.
Создание конкурентоспособных препаратов возможно лишь на основе глубокого изучения химической природы действующих веществ, а также использовании современных методов стандартизации сырья и препаратов (Куркин В.А., 2007). Выделение из сырья индивидуальных биологически активных веществ позволяет изучить их химическое строение, физико-химические свойства и фармакологические эффекты.
Кроме того, следует также отметить, что изучение морфолого-анатомических признаков фармакопейных и примесных видов рода Зверобой ранее в сравнительном аспекте не проводилось, тогда как современный уровень исследований предполагает использование в НД качественных цветных цифровых микрофотографий макро- и микроскопических признаков отдельных частей сырья, представляющего собой траву.
Таким образом, углубленное изучение химического состава, фармакологических свойств индивидуальных веществ и субстанций, в сочетании с проведением морфолого-анатомического анализа позволит научно обосновать подходы к созданию и стандартизации сырья и препаратов видов рода Зверобой.
Цель и задачи исследования. Экспериментально-теоретическое обоснование новых подходов к созданию и стандартизации лекарственных средств на основе видов рода Зверобой (Hypericum L.).
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1. Сравнительное исследование химического состава надземной части видов рода Зверобой.
2. Выделение из надземной части зверобоя продырявленного индивидуальных биологически активных соединений, установление структуры выделенных веществ и изучение их физико-химических и фармакологических свойств.
3. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование надземных частей видов рода Зверобой с использованием цифровой микроскопии.
4. Разработка и научное обоснование новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя травы, отвечающих параметрам валидации.
5. Разработка методик качественного анализа для сырья и препаратов зверобоя травы с использованием метода тонкослойной хроматографии в сочетании с качественными реакциями и УФ-спектроскопией.
6. Разработка методик количественного анализа для сырья и препаратов зверобоя травы с применением дифференциальной спектрофотометрии (в случае суммы флавоноидов), а также прямой спектрофотометрии (в случае антраценпроизводных).
7. Научное обоснование подходов к созданию новых антидепрессантных лекарственных препаратов на основе зверобоя травы.
8. Обоснование способов получения лекарственного препарата «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой».
9. Исследование показателей качества сырья и препаратов зверобоя.
10. Разработка проектов ФСП «Зверобоя трава», «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой».
11. Обоснование целесообразности использования в медицинской практике отечественных антидепрессантных препаратов на основе зверобоя травы.
Научная новизна. Исследования химического состава видов рода Hypericum L. позволило получить новые данные о содержании биологически активных соединений. Так, из надземной части зверобоя продырявленного выделено 9 индивидуальных соединений, относящихся к флавоноидам, флороглюцинам, фенилпропаноидам и стеринам. На основе изучения данных ЯМР-спектроскопии, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, тонкослойной хроматографии (ТСХ) установлено химическое строение выделенных веществ, среди которых вещества 3,811-бисапигенин, гиперфорин, -ситостерин и эргостерин выделены впервые в РФ, а 6,811-дикверцетин впервые описан для рода Hypericum L. и является новым природным соединением.
Сравнительное исследование видов рода Hypericum L. позволило выявить разнообразную природу биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение для целей стандартизации имеют флавоноиды (гиперозид, рутин и бисапигенин) и антраценпроизводные (гиперицин). Разработаны новые подходы к стандартизации сырья и препаратов видов рода Hypericum L., которые заключаются в сочетанном определении двух групп действующих веществ – суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин.
Сравнительное анатомо-морфологическое исследование сырья видов рода Hypericum L. позволило выявить общие и отличительные признаки для фармакопейных и примесных видов, необходимых для объективной идентификации сырья. На основе цифровых микрофотографий показано, что основные диагностические признаки выявляются при рассмотрении листьев, цветков и чашелистиков сырья.
Обоснованы технологические подходы для создания препаратов «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой», которые позволили повысить выход целевых веществ, обладающих нейротропной активностью. В результате фармакологических исследований обнаружена выраженная антидепрессантная активность для новых препаратов «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой». Обоснована целесообразность применения в медицинской практике импортозамещающих препаратов видов рода Hypericum L. в качестве антидепрессантных средств.
Практическая значимость работы. Сравнительное исследование сырья видов рода Hypericum L. свидетельствует о различии в содержании биологически активных соединений фармакопейных и примесных видов сырья, что имеет существенное значение с точки зрения идентификации сырья и препаратов зверобоя. Разработаны унифицированные методики качественного (ТСХ в сочетании с качественными реакциями и УФ-спектроскопией) и количественного анализа (сочетанное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин и определение содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин) для зверобоя травы, зверобоя настойки, зверобоя экстракта жидкого и зверобоя экстракта сухого. Исследованы показатели качества сырья «Зверобоя трава», «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой». Проведенные фармакологические исследования нейротропной активности позволили выявить наличие выраженной антидепрессантной активности для новых препаратов на основе видов рода Hypericum L. Обоснована ресурсосберегающая технология заготовки сырья высокого качества, что нашло свое отражение в рекомендациях по заготовке сырья. Разработаны проекты ФСП «Зверобоя трава», «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой».
Получен патент РФ на изобретение № 2327481 «Способ получения средства, обладающего антидепрессантной активностью» (2008 г.).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 77 научных работах, в том числе 19 работ в журналах, реферируемых ВАК, 1 патенте РФ на изобретение и монографии «Зверобой: итоги и перспективы создания лекарственных средств» (2008 г.).
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на различных региональных, Всероссийских и Международных конференциях, в том числе на X, XI, XII, XIII, XIV, XV Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2005; 2006; 2007; 2008; 2009; 2010), XIII, XIV, XV, XVI и XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006; 2007; 2008; 2009; 2010); Международном медицинском конгрессе (Ганновер, 2006), Международной конференции по полифенольным соединения (Канада, 2006), XII Съезде русского ботанического общества «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008), VII, VIII Международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2009; 2010), VII Международном конгрессе «Традиционная медицина» (Москва, 2009), Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), II Российском фитотерапевтическом съезде (Москва, 2010) и др.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» по темам «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ 01200900658) и «Фармакогностическое и химико-фармацевтическое исследование лекарственных растений и фитопрепаратов» (№ 01200405620), а также соответствует тематике Проблемной комиссии по химико-фармацевтическим наукам. Кроме того, работа выполнена при поддержке проекта 02.740.11.0650 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
-
Результаты химического изучения травы зверобоя продырявленного.
-
Результаты сравнительного морфолого-анатомического анализа сырья различных видов рода Hypericum L.
-
Новые подходы к стандартизации сырья и препаратов на основе зверобоя травы, которые заключаются в сочетанном определении суммы флавоноидов в пересчете на рутин и определении суммы антраценпроизводных в пересчете на гиперицин.
-
Способы получения новых лекарственных средств «Зверобоя настойка», «Зверобоя экстракт жидкий» и «Зверобоя экстракт сухой».
-
Научное обоснование целесообразности применения разработанных препаратов в медицинской практике.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 90 рисунков. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 355 источников, из которых 50 зарубежных.
Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цель и задачи исследования, отмечены новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований растений рода Hypericum L., в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств и применению в медицине. Главы 2-7 являются экспериментальными, в них дана характеристика объектов и методов исследования, обсуждаются результаты изучения химического состава сырья видов рода Hypericum L., разработки новых подходов к стандартизации сырья и препаратов, изложены способы получения новых лекарственных препаратов, а также результаты сравнительного анатомо-морфологического исследования сырья видов рода Hypericum L.
Ботаническое описание некоторых видов рода Hypericum L
Как известно;, в медицинской практике РФ используется зверобоя трава, заготовленная от двухвидов растений - зверобоя продырявленного {Hypericum perforatum L.) и зверобоя; пятнистого (четырехгранного) {Hypericum maculatumGrantz., (синонимы Hypericum quadrangulum L.) [51, 53]i
Зверобой продырявленный [Hypericum- perforatum L., сем; Hypericaceae (Guttiferae)]) представляет собой, многолетнее травянистое растение; (рис. 1). Это растение1 имеет множество народных названий -зверобой пронзеннолистный; зверобой обыкновенный заячья, кровь, божья кровь, кровавник, трава святого Иоанна; кровяная трава; жесткое сено; плакуш трава; трава иисусовых ран, раневая- трава и др. Все вышеперечисленные: народные: названия говорят о широком применении: этого уникального растения в медицинской практике [51, 53,. 245; 285]; . Считается; что русское слово «зверобой» происходит от казахского1 названия этого растения «джербай» - целитель.ран. [185, 245]. Другие авторы считают, что родовое наименование Hypericum происходит от греческого hypo- (под, среди) и еглке (вереск) и связано с местообитанием данного растения (растущий среди вереска) [44, 121, 144, 196]! Рисунок 1 - Зверобой продырявленный (рисунок растения).
Морфологические признаки зверобоя продырявленного позволяют легко диагностировать это растение в природе (рис. 1). Стебель у данного растения прямой с двумя гранями, наверху ветвистый, от 30 см достигает иногда 1 м в высоту. Листья овальные, эллиптические, продолговато яйцевидные или продолговатые, 0,7-3 см длиной и 0,3-1,5 см шириной. Они почти всегда туповатые, плоские по краю более менее завернутые вниз, с многочисленными просвечивающимися светлыми и редкими черными точечными железками. Цветки многочисленные, собранные в широко метельчатое, почти щитковидное соцветие (тирс) 7-11 см длиной, 5-11 см шириной. Прицветники ланцетные, острые 0,5 см длиной. Чашечка глубоко раздельная, 5 мм длиной, почти в 2-3 раза короче венчика. Чашелистики ланцетные или узко ланцетные. Они также острые или тонко заостренные, с редкими железистыми черными большей частью овальными точками, по краю ровные или немного зубчатые. Лепестки продолговатые или продолговато эллиптические, неравнобокие, 1,2-1,5 см длиной, 0,5-0,6 см шириной, по краям и верхней части с многочисленными черными железками в виде черных точек и черточек и на поверхности с многими желтыми светлыми точечными и в виде тонких черточек и полосок железками или без черных точек. Тычинки многочисленные в 3 пучках, завязь яйцевидная, 3-5 мм длиной. Корневище короткое, вертикальное, корни слабоветвистые, неглубоко погруженные в почву. Семена мелкие - 1 мм длиной, цилиндрические, коричневые, продольно мелко ячеистые. Известно, что на одном побеге может созревать около 23000 семян. Растение легко размножается семенами, поэтому может являться злостным сорняком для пастбищ [60, 73, 285].
Цветет зверобой продырявленный в июне-августе. Плоды созревают в сентябре-октябре. При скашивании зверобоя в годы влажной второй половины лета в августе-сентябре наблюдается его отрастание и вторичное цветение. Свое название «продырявленный» или «пронзеннолистный» этот вид зверобоя получил из-за наличия большого количества вместилищ с эфирным маслом, расположенных по всей поверхности листа этого растения: если смотреть на листья зверобоя сквозь свет, то можно видеть большое количество прозрачных точек. Таким образом выглядят эфирномасличные вместилища на листьях зверобоя продырявленного [285].
Зверобой продырявленный произрастает в светлых лиственных и смешанных лесах, среди кустарников, на луговых степях, лугах, каменистых склонах. Встречается на суходольных, реже пойменных лугах, лесных опушках и полянах, в разреженных лесах, по склонам балок и речных долин, в горах до 2300 м, по предгорьям, лесам и субальпийским лугам. Может встречаться как сорное растение по насыпям, около дорог, по окраинам полей и среди посевов [285]. В то же время является уязвимым видом и нуждается в охране [182]. Зверобой продырявленный может образовывать разреженные заросли на площади в несколько гектаров. Встречается на всей территории Европейской части Российской Федерации (РФ), на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири (за исключением северных районов), а также в горах Средней Азии. В районах Дальнего Востока и Приморья зверобой продырявленный является заносным видом. Для этих районов типичными видами являются зверобой большой, зверобой прямой, зверобой оттянутый, а также зверобой Геблера [302, 304].
Трава зверобоя продырявленного может вызывать заболевания животных при поедании растений в больших количествах на пастбищах. В основном, это проявляется в случае овец с белой шерстью. Это связано с фотосенсибилизирующим действием антраценпроизводных, входящих в состав травы зверобоя [44, 66]. Как известно, животные с белой шерстью особенно к ним чувствительны. Причем заболевание более выражено, если животные съедали траву зверобоя в жаркий солнечный день. Считается, что действие гиперицина подобно гемотопорфирину, искусственному продукту расщепления гемоглобина [38]. Заболевания проявляется в виде длительно незаживающих, кровоточащих язв и ран на коже и слизистых оболочках животных. Поэтому зверобой нежелательный компонент на пастбищах и считается небезопасным для животных [66, 245, 285]. В то же время зверобой является хорошим медоносом и перганосом.
Зверобой пятнистый (четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz., (синонимы Hypericum quadrangulum L.) сем. Hypericaceae) морфологически отличается от предыдущего вида лишь наличием четырехгранного стебля и листьев с редкими просвечивающимися и темными железками (рис. 2). Кроме того, зверобой пятнистый отличается местами произрастания [60, 285]. Этот вид зверобоя в большей степени мезофит, и произрастает по опушкам хвойных и смешанных лесов. Отсюда и его меньшие размеры по сравнению со зверобоем продырявленным [285]. Данный вид, по литературным данным, имеет химический состав такой же, как и у зверобоя продырявленного, поэтому применяется и заготавливается наряду с ним [245, 285]. Длительное время этот вид зверобоя считался примесным [28, 52, 218, 267] и не подлежал заготовке, однако большинство современных авторов не видят существенной разницы в химическом составе зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого [53, 245].
Примесями для фармакопейного сырья может являться трава, заготовленная от других видов зверобоя, произрастающих в аналогичных фитоценозах - зверобой жестковолосистый и зверобой изящный, характеристика которых приведена ниже.
Зверобой изящный {Hypericum elegans Steph.) представляет собой многолетнее растение, высотой 30-50 см. На его стебле имеются 2 узких боковых ребра (рис. 3). Чашелистики усажены по краям темными железками на ножках, видимые в лупу. Это растение произрастает по склонам холмов, по степям, а также в подлеске, среди зарослей кустарников. В народной медицине используется аналогично зверобоя продырявленному. Данное растение является редким и охраняемым видом в Самарской области, занесено в Красную книгу [28, 182, 212, 285].
Описание выделенных биологически активных соединений
З,8п-Бисапигенин. Светло-желтое аморфное вещество состава Сз0Н18О10 с т.пл. 233-235С, М4" 302 (100 %), УФ-спектр: Хтах 270, 330 нм. -ЯМР-спектр в дейтероацетоне (6, м.д.): 13,15 (с, 5-ОН), 12,99 (с, 511-ОН), 7,71 (д, 9 Гц, 2Н, Н-2 ,61), 7,51 (д, 9 Гц, 2Н, Н-2Ш,6Ш),), 6,90 (д, 9 Гц, 2Н, Н-З1 1), 7,79 (д, 9 Гц, 2Н, Н-3Ш,5Ш), 6,61 (с, Н-311), 6,60 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,35 (д, 2,5 Гц, Н-6), 6,34 (с, Н-611) (рис. 42 и 53) Кверцетин. Светло-желтое аморфное вещество состава С15Н10О7 с т.пл. 312-314 С, М 302 (100 %), УФ-спектр в этаноле: тах 257, 268 пл, 372 нм. -ЯМР-спектр в дейтероацетоне (5, м.д.): 12,20 (с, 5-ОН), 7,83 (д, 9 Гц, Н-2 ), 7,70 (дд, 2 и 9 Гц, Н-6 ), 6,99 (д, 9 Гц, Н-5 ), 6,53 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,26 (д, 2,5 Гц, Н-6) (рис. 43 и 54).
6,8П-Дикверцетин. Желтое аморфное вещество состава СзоН Ои, УФ-спектр в этаноле: Хтах 257, 268 пл, 374 нм. ]Н-ЯМР-спектр в дейтероацетоне (8, м.д.): 7,83 (д, 9 Гц, Н-21), 7,70 (дд, 2 и 9 Гц, Н-61), 7,53 (д, 9 Гц, Н-2111), 7,48 (дд, 2 и 9 Гц, Н-6111), 6,98 (д, 9 Гц, Н-51), 6,89 (д, 9 Гц, Н-5111), 6,53 (уш. с, Н-8), 6,27 (уш. с, Н-6) (рис. 44 и 55).
Гиперозид. Светло-желтое кристаллическое вещество состава С21Н20О12 с т.пл. 233-235С (водный ацетон); УФ-спектр в этаноле: Хтах 258,. 266 пл, 362 нм. Н-ЯМР-спектр в смеси дейтероацетона и дейтероводы (б, м.д.): 12,30 (с, 5-ОН), 7,92 (д, 2,5 Гц, Н-21), 7,55 (дд, 2,5 и 9 Гц, Н- б1), 6,88 (д, 9 Гц, Н-51), 6,45 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,20 (д, 7,5 Гц, Н-111 галактозы), 3,5-4,0 (м, 6Н галактозы) (рис. 45 и 62).
Рутин. Зеленовато-желтое кристаллическое вещество состава С27Н30О16; т.пл. 192-194 С (водный спирт) УФ-спектр: А,тах 258, 266 пл, 362 нм. Н-ЯМР-спектр в смеси дейтероацетона и дейтероводы, 2:1 (5, м.д.): 7,74 (д 9 Гц, Н-21), 7,68 (дд, 2,5 и 9 Гц, Н-61), 6,94 (д, 9 Гц, Н-51), 6,50 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,27 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,13 (д, 7 Гц, Н-111 глюкозы), 4,55 (д, 2 Гц, Н-I111 рамнозы), 3,70-3,25 (м, 6Н глюкозы + 4Н рамнозы), 1,08 (д, 6 Гц, ЗН, СНз рамнозы) (рис. 46 и 61).
Хлорогеновая кислота СібНізОд. Т. пл. 203-205 (вода). УФ-спектр в спирте этиловом: 243, 300 пл, 330 нм. -ЯМР-спектр в ДМСО-с16 (100 МГц, м.д.): 7.45 (д, 16 Гц, Н-7), 7.06 (д, 2 Гц, Н-21), 7.01 (дд, 2 и 8 Гц, Н-61), 6.80 (д, 8 Гц, Н-51), 6.18 (д, 16 Гц, Н-8), 5.10 (дт, 5 и 9 Гц, Н-5), 4.00 (кв, 3 Гц, Н-3), 3.62 (дд, 3 и 9 Гц, Н-4).
Гиперфорин. Светло-желтое сиропообразное вещество состава С35Н54О4; УФ-спектр в этаноле: , А,тах 275 нм. Н-ЯМР-спектр в дейтерохлороформе (5, м.д.): 4,8-5,3 (м, 4Н, Н-15, Н-22, Н-27, Н-32), 4,2-4,3 (м, 2Н, Н-14), 3,20 (м, Ш, Н-11), 1,8-2,5 (м, ЮН, Н-6, Н-7, 2Н-19, 2Н-21, 2Н-26, 2Н-31), 1,5-1,8 (м, 28Н, СН3-17, 18, 24, 25, 29, 30, 34, 35), 1,20 (с, 6Н, СНз-12, СНз-13), 1,00 (с, ЗН, СН3-20) (рис. 47, 48 и 56).
Р-ситостерин: пластинчатые кристаллы белого цвета, С29Н50О.; 1Н-ЯМР-спектр (200 МГц, (CDC13, 5, м.д.): 5,32 (м, 1Н, Н-6), 3,73 (м, Ш, Н-3), 0,8-2,2 (м, 47Н, в том числе 6 СН3). Масс-спектр (70 eV, 200 С, m/z, %): 414 (М+, 32), 255 (32), 231 (19), 213 (27), 145 (34), 135 (37), 119 (60), 105 (43), 97 (58), 71 (63), 69 (65), 43 (50) (рис. 49 и 50).
Эргостерин: мелкие кристаллы серого цвета, СгвНнО; Т.пл. 163-165 С. УФ-спектр (ЕЮН, Хтах): 271 нм. Н-ЯМР-спектр (200 МГц, (CDC13, 8, м.д., J/Гц): 5,35 (м, 2Н, Н-6, Н-7), 4,37 (д, 2Н, 7,7, Н-22, Н-23), (м, Ш, Н-3), 3,1-3,4 (м, 2Н, Н-9, Н-14), 0,65-2,4 (м, 47Н, в том числе 6 СН3). Масс-спектр (70 eV, 200 С, m/z, %): 396 (М+, 100), 255 (7), 213 (13), 147 (28), 80 (34), 57 (52), 43 (68) (рис. 51 и 52).
Следует отметить, что 3,8 і -бисапигенин впервые выделен из травы зверобоя продырявленного, произрастающего в РФ. Вещество, выделенное нами в минорном количестве и идентифицированное как 6,8п-дикверцетин, является новым природным соединением и впервые описано для рода Hypericum (табл. 2). Гиперфорин, р-ситотерин и эргостерин также выделены из данного лекарственного растительного сырья впервые в РФ, хотя об исследовании этих веществ сообщалось ранее [6, 8, 31, 32, 33, 34, 98, 330, 336, 337].
Таким образом, нами установлено, что ведущей группой действующих веществ травы зверобоя продырявленного являются флавоноиды, среди которых доминируют рутин, гиперозид и бисапигенин. Бисапигенин является димером флавоноидов и его содержание отмечается лишь в растениях рода Hypericum L. Однако димер на основе апигенина описан для сырья гинкго двулопастного, препараты которого оказывают нейротропное действие [143, 154, 155, 325, 346, 348]. В Н-ЯМР-спектре 3,8п-бисапигенина присутствуют два однопротонных синглетных сигнала при 12,99 и 13,15 м.д., принадлежащих 5-ОН- и 5п-ОН группам. В пользу С-С связи в димере апигенина (С-3 и С-8) свидетельствует тот факт, что в ЯМР-спектре обнаруживается четыре двухпротонных дублетных сигнала с константой спин-спинового взаимодействия (КССВ) 9 Гц, соответствующих строению кольца В с замещением при С-41 и С-41". Кроме того, в ЯМР-спектре 3,8 -бисапигенина содержатся два однопротонных дублетных сигнала с КССВ 2,5 Гц при 6,60 м.д. (Н-8) и 6,35 м.д. (Н-6), а также однопротонные синглетные сигналы Н-6 и Н-3 при 6,34 м.д. и 6,61 м.д. соответственно (рис. 42).
Рутин и гиперозид представляют собой гликозиды кверцетина, которые достаточно широко распространены в растительном мире, поэтому обнаружение в ходе анализа только этих компонентом не может надежно идентифицировать сырье и препараты зверобоя. При этом достаточно уникальными компонентами травы зверобоя являются антраценпроизводные. Однако нет достаточных оснований утверждать, что именно этими веществами обусловлен антидепрессантный эффект, присущий препаратам зверобоя [221, 342]. Поэтому, на наш взгляд, оптимальным будет применение подхода к стандартизации, сочетающего в себе качественный и количественный анализ флавоноидов и антраценпроизводных. В дальнейших исследованиях мы осуществляли поиск оптимального пути анализа суммы флавоноидов и антраценпроизводных травы зверобоя.
Исследование качественного состава извлечений из надземных частей различных видов рода Hypericum L
Извлечения из надземных частей различных видов рода Hypericum L. были исследованы с помощью качественных реакций на наличие дубильных веществ и антраценпроизводных. Прибавление раствора хлорида окисного железа вызвало появление черного окрашивания во всех исследуемых образцах, что свидетельствует о высоком содержании дубильных веществ. При этом реакцию на наличие антраценпроизводных с раствором щелочи и хлористоводородной кислоты, возможно провести только с извлечением из травы зверобоя продырявленного, зверобоя олимпийского, зверобоя изящного и зверобоя пятнистого. Это связано с тем обстоятельством, что извлечения из этих видов растений имеют красную окраску, обусловленную высоким содержанием антраценпроизводных. Извлечения из травы зверобоя красивого, зверобоя большого и зверобоя волосистого не имеют красной окраски, что указывает на низкое содержание антраценпроизводных в исследуемых извлечениях.
Анализ извлечений, проведенный методом ТСХ показывает отличия химического состава надземных частей различных видов рода Hypericum L. (рис. 69 и 70). Причем если общее содержание флавоноидов в различных образцах приблизительно одинаковое, то содержание их отдельных компонентов может существенно отличаться. Так, в надземной части зверобоя продырявленного и зверобоя волосистого содержание рутина несколько превалирует над гиперозидом. В то же время, в сырье зверобоя пятнистого, зверобоя большого и зверобоя красивого, наоборот, содержание гиперозида превышает содержание рутина. Следует отметить, что надземные части зверобоя изящного и зверобоя олимпийского значительно отличаются по химическому составу от других видов.
Характерные отличительные признаки можно заметить и на кривых поглощения УФ-спектров извлечений из этих видов сырья (рис. 71-76). Следует отметить, что для извлечения из надземной части зверобоя продырявленного типичными являются максимумы поглощения, характерные для бисапигенина (270 ± 2 нм), рутина и гиперозида (362 ± 2 нм) и гиперицина (591 ± 2 нм). Наиболее существенные отличия для кривых поглощения можно заметить также для извлечений из сырья зверобоя изящного и зверобоя олимпийского (рис. 73 и 76).
Изучение фармакологической активности новых препаратов на основе сырья видов рода Зверобой
Разработанные новые лекарственные препараты на основе видов рода Hypericum L. были исследованы на белых беспородных крысах на предмет обнаружения антидепрессантных и анксиолитических свойств. Были исследованы образцы новых лекарственных препаратов «Зверобоя настойка» и «Зверобоя экстракт сухой» полученные на основе травы зверобоя продырявленного. Содержание основных БАС — флавоноидов и антраценпроизводных в исследуемых нами лекарственных средствах отражено в таблице. Кроме того, проведено исследование препарата «Настойка зверобоя изящного», полученного по технологии, аналогичной препарату «Зверобоя настойка». Экстрагентом для этого средства являлся также 70% этиловый спирт. Препараты «Зверобоя настойка» и «Настойка зверобоя изящного» вводили животным из расчета 100 мг на кг массы тела животного. Для этого препараты разводили водой очищенной непосредственно перед введением. Контрольная группа животных получала раствор 70% этилового спирта в воде, разведенного аналогично препарату.
Проведено также исследование нового лекарственного средства «Зверобоя экстракт сухой». Для эксперимента использовали сухой экстракт в дозе 2 мг/кг. Вводили животным препарат, смешанный с 1% раствором крахмала. Контрольная группа крыс при этом получала 1% раствор крахмала.
В качестве одного из препаратов сравнения нами был использован «Деприм». Для этого таблетки освобождали от оболочки и растирали в фарфоровой ступке. Данный препарат также смешивали с раствором крахмала и вводили животным из расчета 10 мг/кг. Содержание основных БАС данных препаратов отражено в таблице 37.
Кроме того, мы проводили исследование водного извлечения травы зверобоя продырявленного. Настой травы зверобоя был получен из образца травы зверобоя продырявленного в соотношении 1:10 по общим правилам приготовления настоев [53]. Данный препарат вводили животным из расчета 5 мл/кг. Контрольные животные при этом получали воду.
Наряду с вышеперечисленными препаратами были исследованы биологические свойства биаспигенина - индивидуального БАС, выделенного нами из травы зверобоя продырявленного с помощью колоночной хроматографии [145]. Данное вещество вводили однократно в растворе крахмала, параллельно сравнивали эффекты однократного ведения амитриптилина и феназепама.
В качестве препаратов сравнения были использованы феназепам в дозе 0,5 мг на кг массы тела животного (анксиолитическое действие) и амитриптилин 5 мг/кг массы тела животного (антидепрессантное действие). Оба препарата вводили в растворе крахмала.
Результаты проведенных фармакологических исследований отражены в таблицах 38-39.
Как видно из результатов, приведенных в таблицах 38 и 39, под действием исследуемых препаратов существенно увеличивается время активных попыток животных выбраться из воды. Так, сухой экстракт зверобоя увеличивает антидепрессантный эффект почти в два раза по сравнению с контролем. «Зверобоя настойка», зверобоя настой и «Деприм» увеличивают время движения животного в эксперименте на 25%, 85% и 48% соответственно. При этом для препарата «Настойка зверобоя изящного» характерно некоторое уменьшение времени движения по сравнению с контролем. Это еще раз говорит о существенных отличиях в химическом составе травы зверобоя изящного от сырья фармакопейных видов. Следует отметить, что разработанный нами препарат «Зверобоя экстракт сухой» обладает более выраженной антидепрессантной активностью по сравнению с зарубежным лекарственным средством «Деприм» (табл. 37).
Обнаруженная нами выраженная антидепресантная активность флавоноидного вещества бисапигенина показывает (табл. 39), что этот компонент также влияет на развитие фармакотерапевтического эффекта препаратов зверобоя. При исследовании антидепрессантной активности происходит увеличение времени движения животных на 58%, тогда как в случае амитриптилина этот показатель составляет лишь 12%. Это обстоятельство является очень важным, ведь данный компонент является уникальным для зверобоя травы. Следовательно, необходимым условием, на наш взгляд, является обнаружение этого компонента при фитохимическом исследовании сырья и препаратов зверобоя травы для целей их стандартизации.
Следует отметить, что ранее нами были проведены исследования, которые позволили выявить выраженное антидепрессантное действие для флавоноида гиперозида [127, 128]. При этом данный эффект отсутствовал для другого флавоноида - рутина, хотя в зарубежной литературе имеется сообщение об антидепрессантной активности для данного флавоноида [315]. Кроме того, наши исследования показали что препарат «Зверобоя настойка», для получения которого был использован 70% этиловый спирт, в эксперименте значительно превосходит по антидепрессантной активности препарат, полученный промышленным способом на 40% спирте. Для препарата «Зверобоя настойка» выявлено тонизирующее, антигипногенное и умеренное ноотропное действие [86, 87, 88, 91, 93, 94, 158].
Результаты исследований анксиолитическоой активности фитопрепаратов и индивидуальных соединений приведены в таблицах 40 и 41.
У исследуемых фитопрепаратов обнаружена также некоторая анксиолитическая активность (табл. 40). Фитопрепараты значительно увеличивают время пребывания животных на открытых площадках приподнятого крестообразного лабиринта. Причем в случае исследования настойки зверобоя продырявленного время пребывания животного на центральной площадке приподнятого крестообразного лабиринта увеличивается в два раза. В случае сухого экстракта зверобоя и препарата «Деприм» в два раза возрастает время пребывания животных в открытых рукавах (табл. 40). Следует отметить, что разработанный нами препарат «Зверобоя экстракт сухой» обладает более выраженной нейротропной активностью по сравнению с зарубежным лекарственным средством «Деприм», причем последний, с учетом содержания основных БАС в анализируемых лекарственных средствах (табл. 37), животным вводили в большей дозировке.
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
![Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс]](/i/i/4381/176171.png "Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс] Петрова Елена Сергеевна")
