Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Лечение остеоартроза. Методы анализа глюкозамина, метилсульфонилметана, кальция аскорбата, марганца цитрата, экстракта коры ивы 12
1.1 Лечение остеоартроза 12
1.2 Анализ состава препаратов, применяемых для лечения остеоартроза 14
1.3 Противоартрозная активность глюкозамина, метилсульфонилметана, кальция аскорбата, марганца цитрата, экстракта ивы 21
1.3.1 Противоартрозная активность глюкозамина 21
1.3.2 Противоартрозная активность метилсульфонилметана 22
1.3.3 Фармакологические свойства экстракта коры ивы 23
1.3.4 Применение кальция аскорбата и марганца цитрата при лечении артрозов 24
1.4 Методы анализа глюкозамина 26
1.4.1 Методы идентификации глюкозамина 26
1.4.2 Методы количественного определения глюкозамина 29
1.5 Биологически активные вещества ивы, методы анализа 30
1.6 Методы анализа метилсульфонилметана, кальция аскорбата, марганца цитрата 33
1.6.1 Методы анализа метилсульфонилметана 33
1.6.2 Методы анализа соединений кальция 34
1.6.3 Методы анализа соединений марганца (II) 36
1.7 Заключение по обзору литературы 38
Глава 2 Изучение специфической активности противоартрозного средства (таблеток «Флексиэктив») 41
2.1 Изучение противоартрозной активности таблеток «Флексиэктив» 41
2.1.1 Моделирование остеоартроза 43
2.1.2 Гистологическое исследование 43
2.1.3 Макроскопическое исследование бедренной головки кости 46
2.2 Выводы по главе 2 48
Глава 3 Идентификация компонентов противоартрозного средства (таблеток «Флексиэктив») 49
3.1 Идентификация глюкозамина сульфата в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив») 49
3.2 Идентификация метилсульфонилметана в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив») 51
3.3 Идентификация кальция аскорбата в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив») 55
3.4 Идентификация биологически активных веществ экстракта ивы методом ТСХ 57
3.5 Идентификация марганца (II) цитрата в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив») 60
3.6 Выводы по главе 3 64
Глава 4 Разработка методик количественного анализа ингредиентов комбинированного противоартрозного средства 65
4.1 Методики определения глюкозамина 66
4.1.1 Разработка спектрофотометрической методики определения глюкозамина 66
4.1.1.1 Подбор оптимальных условий проведения щелочной деструкции глюкозамина 68
4.1.1.2 Валидационная оценка методики определения глюкозамина по продуктам деструкции 72
4.1.1.3 Количественное определение глюкозамина гидрохлорида в таблетках «Аминоартрин» 73
4.1.2 Количественный анализ глюкозамина сульфата методом Эльсона- Моргана 76
4.1.2.1 Валидационная оценка определения глюкозамина методом Эльсона- Моргана 78
4.1.2.2. Количественный анализ глюкозамина сульфата методом Эльсона- Моргана в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив») 80
4.2 Определение метилсульфонилметана 83
4.2.1 Валидационная оценка методики определения метилсульфонилметана... 85
4.2.2 Количественный анализ метилсульфонилметана при помощи газожидкостной хроматографии 86
4.3 Анализ кальция аскорбата 89
4.4 Анализ марганца (II) цитрата 93
4.4.1 Валидация методики количественного определения марганца (II) цитрата 95
4.4.2 Спектрофотометрический анализ количественного содержания марганца (II) цитрата в таблетках «Флексиэктив» 96
4.5 Выводы по главе 4 101
Глава 5 Изучение стабильности и установление сроков годности противоартрозного средства (таблеток «Флексиэктив») 101
5.1 Изучение деструкции компонентов таблеток «Флексиэктив» и установление срока годности 102
5.2 Изучение стабильности компонентов противоартрозных таблеток «Флексиэктив» в процессе хранения '. 109
5.3 Выводы по главе 5 120
Общие выводы 121
Литература
- Противоартрозная активность глюкозамина, метилсульфонилметана, кальция аскорбата, марганца цитрата, экстракта ивы
- Гистологическое исследование
- Идентификация кальция аскорбата в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив»)
- Валидационная оценка методики определения глюкозамина по продуктам деструкции
Введение к работе
Актуальность темы
Фармакотерапия остеоартроза (ОА) до недавнего времени была направлена скорее на уменьшение симптомов болезни, нежели на ее причину. Анальгетики , нестероидные противовоспалительные средства и стероидные составляли основу лечения ОА. Однако побочные эффекты большинства этих лекарственных средств заставили пересмотреть показания к их широкому назначению больным ОА и способствовали разработке препаратов, способных контролировать течение болезни. К таким препаратам относится глюкозамин, который является универсальным предшественником всех аминогликанов сустава. Глюкозамин определяет метаболизм хрящевой ткани в целом и отлаженное его поступление в организм позволяет добиться существенного прогресса в восстановлении суставного хряща.
В стадии острого воспаления сустава требуется дополнительное использование специфических противовоспалительных средств. Известно, что использование некоторых растительных экстрактов повышает эффективность противоартрозных средств. Так, экстракт ивы, содержащий производные салициловой кислоты, оказывает противовоспалительное действие и способствует усилению эффективности противоартрозных средств. Имеются сведения о том, что применение метилсульфонилметана усиливает биосинтез коллагена – белка хрящевой и соединительной ткани. Антиоксиданты участвуют в восстановлении хрящевой ткани, укреплении связочного аппарата сустава и уменьшают ломкость капилляров. Соли кальция и марганца, способствуют активизации процесса регенерации хрящевой ткани, а также усвоению глюкозамина. Однако в Российской федерации комбинированные препараты, содержащие глюкозамин вместе с метилсульфонилметаном, растительными экстрактами, антиоксидантами, солями кальция и марганца (II) не производятся.
Поэтому создание комбинированного противоартрозного средства, содержащего глюкозамин, метилсульфонилметан, экстракт ивы, кальция аскорбат, марганца (II) цитрат является актуальной задачей для фармации.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось обоснование состава и установление научно обоснованных норм качества комбинированного противоартрозного средства, содержащего глюкозамина сульфат, метилсульфонилметан, соли кальция и марганца (II), антиоксиданты, экстракт ивы.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. На основе анализа влияния известных хондропротекторов, антиоксидантов, метилсульфонилметана, солей кальция, марганца (II) и растительных экстрактов на эффективность их противоартрозного действия обосновать состав комбинированного противоартрозного средства.
2. Осуществить выбор основных критериев качества, необходимых для стандартизации предложенного противоартрозного средства.
3. Разработать методики идентификации компонентов.
4. Предложить и валидировать методики количественного определения компонентов.
5. Провести исследование стабильности данного лекарственного средства с целью обоснования сроков годности.
6. Изучить специфическую активность предлагаемого лекарственного средства.
Научная новизна
На основе изучения лекарственных средств, применяющихся для лечения больных, страдающих остеоартрозом, предложен состав нового лекарственного средства. Показана целесообразность включения в состав предлагаемого противоартрозного средства наряду с глюкозамином метилсульфонилметана, кальция аскорбата, экстракта ивы, марганца (II) цитрата.
На основе анализа известных лекарственных средств данного спектра действия рассчитаны дозировки ингредиентов, входящих в предложенное лекарственное средство.
Проведено сравнительное фармакологическое изучение предложенного комбинированного лекарственного средства с глюкозамина гидрохлоридом и установлено, что новое комбинированное средство приводит к значительному повышению его противоартрозной и противовоспалительной активности (увеличивается подвижность суставов, усиливается рост хрящевой ткани, уменьшается болевой синдром, сокращаются сроки лечения).
Изучены возможности различных физико-химических и химических методов для идентификации и количественного определения глюкозамина сульфата, метилсульфонилметана, кальция аскорбата, марганца (II) цитрата, экстракта ивы, проведен выбор методик, позволяющих определять указанные вещества при совместном присутствии, показана возможность их использования для стандартизации указанного лекарственного средства.
Найдены оптимальные условия фотометрического определения глюкозамина по продуктам, образующимся в щелочной среде при нагревании (температура, время, рН среды). Разработана и валидирована методика количественного определения глюкозамина по продуктам деструкции. Линейность методики соблюдается в пределах концентраций глюкозамина 0,0028-0,0064%.
Доказана возможность использования спектрофотометрических методик определения глюкозамина сульфата (по реакции Эльсона-Моргана), марганца (II) цитрата (по реакции с формальдоксимом). Обоснованы оптимальные условия определения экстракта коры ивы по салицину методом ТСХ и метилсульфонилметана методом ГЖХ. Установлена возможность определения кальция аскорбата комплексонометрическим методом при совместном присутствии ингредиентов. Проведенная валидационная оценка показала, что при использовании методик количественного определения всех компонентов соблюдается линейность в области аналитических концентраций. Методики чувствительны, специфичны и правильны.
Проведенными исследованиями показана возможность установления срока хранения предлагаемого лекарственного средства по продуктам деструкции глюкозамина сульфата. Установлено, что показатели качества разработанного противоартрозного средства сохраняются в течение двух лет естественного хранения.
От федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам получено решение о выдаче патента на изобретение №2006138970/13 (042505) от 7 ноября 2006 года «Композиция противоартрозного действия, содержащая глюкозамина сульфат».
Практическая значимость исследований
По результатам обоснования состава противоартрозного средства на кафедре технологии лекарств ГОУ ВПО «Пятигорской государственной фармацевтической академии» разработаны таблетки, получившие рабочее название «Флексиэктив». Показано увеличение противоартрозной и противовоспалительной активности указанного средства по сравнению с глюкозамином. Разработаны методики качественного и количественного определения всех ингредиентов, входящих в состав предложенных таблеток, методики воспроизводимы и доступны для практического использования. Предложена методика количественного определения глюкозамина по продуктам деструкции, которая может быть использована при отсутствии светопоглощающих компонентов в лекарственном средстве. По результатам проведенных исследований разработаны проекты ФСП и ТУ.
Внедрение результатов исследований в практику
На разработанное противоартрозное средство (таблетки «Флексиэктив») подготовлена документация, которая передана на рассмотрение в ГУ Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов фирмой ООО «ВИК – здоровье животных».
Апробация и публикация результатов исследования.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 60-й, 62-й и 63-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск 2005, 2007, 2008). Опубликовано 7 работ, 2 из них - в журналах, рекомендуемых ВАК.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации Д 208.069.01).
Основные положения, выдвигаемые на защиту
- обоснование методик идентификации действующих веществ в противоартрозном средстве (таблетки «Флексиэктив»);
- обоснование методик количественного определения глюкозамина сульфата методом Эльсона-Моргана и методом щелочной деструкции;
- результаты количественного определения метилсульфонилметана в противоартрозном средстве (таблетки «Флексиэктив») методом ГЖХ;
- обоснование методик спектрофотометрического определения марганца (II) цитрата и комплексонометрического определения кальция аскорбата;
- результаты изучения стабильности и деструкции ингредиентов таблеток «Флексиэктив», обоснование срока годности;
- результаты сравнительного фармакологического изучения противоартрозной активности предлагаемого средства (таблетки «Флексиэктив») и известного лекарственного препарата «Аминоартрин» (таблетки глюкозамина гидрохлорида - ФСП 42-0314-1478-01).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 35 таблицы, 14 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 122 источника, в том числе 26 на иностранных языках.
Противоартрозная активность глюкозамина, метилсульфонилметана, кальция аскорбата, марганца цитрата, экстракта ивы
Глюкозамин, являясь универсальным предшественником для всех амортизирующих и смазывающих веществ, по существу определяет метаболизм хрящевой ткани в целом, и отлаженное его поступление в организм позволяет добиться существенного прогресса в восстановлении метаболизма суставного хряща в полном объеме. [30,40].
В соединительной ткани глюкозамин выполняет опсоническую функцию, формируя вязко-эластические свойства суставного хряща [3,30]. Свободный глюкозамин обнаружен в печени и слизистой желудка [46,112]. Он предохраняет слизистую желудочно-кишечного тракта от действия агрессивных факторов [30,112, 36].
Исследования глюкозамина ведутся с 1956 года, когда ученые Каролинского института (Стокгольм, Швеция) в опытах in vitro смогли доказать, что добавление глюкозамина гидрохлорида к суставной ткани увеличивает продукцию хондроитина сульфата и других аминогликанов [112]. Исследования других институтов (Институт Фармакологии в Университете Бонна и Университет Штата Иллинойс) смогли повторить и подтвердить проведенные исследования. Фактически, они показали, что добавление глюкозамина гидрохлорида увеличило продукцию аминогликанов на 170 % [101,104,112].
Базируясь на этих работах установлено, что введение глюкозамина инфузионно или инъекционно стимулирует производство аминогликанов и протеогликанов в хряще, преодолевая неспособность сустава производить достаточное количество глюкозамина.
Последующими исследованиями показано, что в 80% и более процентов случаев пациенты, ежедневно получавшие 1,5г глюкозамина, сообщали о существенном сокращении боли, ускоренном восстановлении, и частично, о полном восстановлении функции суставов после 4-6 недель лечения [112, 117].
В экспериментах на животных глюкозамин не гепатотоксичен, а предварительное введение препарата оказывает защитное действие на мембраны гепатоцитов и процессы белкового синтеза [21]. Отмечается низкая токсичность глюкозамина [99].
Метилсульфонилметан (МСМ) - это самый богатый природный источник органической пищевой серы-элемента, играющего определенную роль при формировании мышц, связок, хрящей, ногтей, волос и кожи, а также при осуществлении других функций организма. Она способствует росту хрящевой и костной ткани, сухожилий, волос, ногтей и кожи. Вместе с другими компонентами участвует в формировании структуры и обеспечении гибкости и эластичности соединительной ткани. Сера необходима также для биосинтеза коллагена - белка хрящевой и соединительной ткани. Открытие этого соединения и его лечебных и профилактических свойств при различных заболеваниях суставов принадлежит американским ученым химику Herschler R.S. и врачу Jacobs S.W. Из исторических сведений известно, что природная сера применялась в медицине Древней Греции и Египта, а также врачами Древнего Рима. Современными экспериментальными и клиническими исследованиями показано, что МСМ практически не токсичен и может применяться длительное время. МСМ проявляет высокую клиническую эффективность при артритах различного происхождения, при остеохондрозе, мышечных спазмах и судорогах. МСМ применяется для ослабления аллергических реакций, облегчения болевого и воспалительного синдрома при артритах, растяжениях связок, бурситах и других сходных состояниях. МСМ" способствует вымыванию шлаков и токсиновиз организма (в том числе, из тканей суставах). Последние научные исследования, проведённые в США, показали, что наиболее важным является противовоспалительное и обезболивающее действие МСМ при заболеваниях и травмах суставов, позвоночника, мышц и связок.
На сегодняшний день в профессиональных медицинских кругах МСМ оценивается как одно из наиболее эффективных и перспективных натуральных средств борьбы с болью.
Есть сведения о профилактическом, действии МСМ при атеросклерозе и онкологических процессах. К тому же МСМ значительно усиливает действие большинства антиоксидантов и витаминов, поэтому его приём» параллельно с поливитаминами только усилит их положительное воздействие [40] . История применения коры ивы уходит в далекое прошлое. Кора ивы как лекарственное средство использовалась в Древней Греции. Разные виды, ивы широко употреблялись в арабской медицине. Например, Авиценна рекомендовал применять сок ивы для рассасывания отеков, локализованных в разных частях организма. Сведениям о лечебных свойствах ивы- отражены в известном «Салеровском кодексе здоровья», написанном в XIV веке [24,99] .
Клиническая эффективность экстракта коры ивы при заболеваниях опорно-двигательного аппарата была подтверждена еще в конце 70-х годов XX в. Противовоспалительное действие корьь ивы, обусловлено содержанием в ней салицина, (5-8 %), который в организме под действием фермента саликазы гидролитически расщепляется на агликон салигенин и глюкозу, а салигенин далее окисляется в салициловую кислоту. Кроме салицина, кора ивы содержит и другие фенологликозиды - фрагилин, триандрин, вималин, салидрозид, саликортин, салирепозид, а также катехины, оксалаты, флавоноиды,. альбозид [16,78].
Гистологическое исследование
Изучение противоартрозной активности комбинированного средства (таблетки «Флексиэктив») проводилось совместно с профессором Погорелым В.Е. и кандидатом фарм. наук Макаровой Л.М. (Пятигорская государственная фармацевтическая академия), профессором Тимченко Л.Д. (Ставропольский государственный университет) на базе питомника «Шелегор» г. Ессентуки, при участии ветеринарного врача Васильевой B.C. и к.ф.н. Компанцева Д.В.
Задачей данного исследования было сопоставить эффективность применения при травматическом остеоартрозе таблеток «Флексиэктив» в сравнении с зарегистрированным препаратом Аминоартрин - таблетками глюкозамина гидрохлорида. Противоартрозную активность таблеток «Флексиэктив» изучали на собаках одной возрастной группы (2-3 года) без признаков костно-суставной патологии. Для исследования использовали здоровых половозрелых собак самцов массой 10-15 кг, прошедших карантин.
Методом случайной выборки формировали группы лабораторных животных. В каждой группе находилось по 5 животных. 1 группа - животные контрольной группы, у которых моделировали патологический процесс, но лекарственное воздействие не осуществлялось. 2 группа - животные, у которых моделировали патологию и вводили таблетки «Флексиэктив». 3 группа — животные, у которых моделировали патологию и вводили препарат сравнения Аминоартрин - таблетки глюкозамина гидрохлорида.
Хондропротекторную активность таблеток «Флексиэктив» изучали в дозе 50 мг/кг (в пересчете на глюкозамин), т.е. собаке массой 10 кг вводили 1 таблетку. Выбор данной дозы определен расчетным путем с учетом литературных данных об эффективных терапевтических дозах глюкозамина [27,98] и коэффициента пересчета дозы на собак [10,74].
Препарата сравнения глюкозамина гидрохлорид изучали в дозе 50 мг/кг (в пересчете на глюкозамин), т.е. собаке массой 10 кг вводили 1 таблетку. Объекты исследования (таблетки «Флексиэктив» и глюкозамина гидрохлорида) вводили терапевтически (после моделирования патологии), в контрольной серии опытов вводили таблетки, не содержащие действующих веществ. Таблетки помещали животным на корень языка перед едой (10-15 мин). Животных содержали на стандартной диете, соответствующей действующим нормам [23]. Кормление проводили в фиксированное время. Факторы внешней среды (температура, влажность, освещенность и кратность воздухообмена воздуха) соответствовали требованиям по содержанию лабораторных животных [10]. Таблетки «Флексиэктив» и Аминоартрин (глюкозамина гидрохлорид) назначали в виде монотерапии курсом 1 месяц из расчета Г таблетка на 10 кг массы животного 2 раза в день (обоснование доз см. выше). 2.1.1 Моделирование остеоартроза
Изучение хондропротекторного действия объектов исследования проводили на модели посттравматического артроза у собак, который развивался в тазобедренном суставе после нанесения стандартного дефекта в виде круглого отверстия (диаметром 2 мм), проникающего через суставной хрящ в субхондриальную кость. [97].
Ветеринарным врачом Васильевой B.C. под хлоралгидратным: наркозом (300 мг/кг) посредством бокового доступа вскрывали тазобедренный сустав и кератомом проводили резкое надавливание на суставной хрящ головки до специальной отметки на кератоме; Извлекали кератом и.удаляли: содержимое. Рана послойно ушивалась, через 30 суток собаки были выведены из эксперимента.
Оценка клинических проявлений ОА у собак проводилось, по следующим критериям: подвижность сустава, болезненность сустава, наличие местной воспалительной реакции.
Оценка подвижности сустава проводилась по 5 балльной шкале, оценка болезненности проводилась по 4 балльной шкале, выраженность воспаления оценивали по наличию отека и гиперемии (градация по баллам указана в таблицах 1 и 2 соответственно). Оценку клинических проявлений ОА; проводили спустя 24 ч часа после моделирования патологии, а также спустя 7 и 30; дней после нанесения дефекта на головку бедренной кости в утренние часы (с 8 до 9 ч).
Материалом для исследования служили головки бедренной кости, которые после отбора фиксировали в 10 % нейтральном формалине. Декальцинация проводилась в 7,5 % азотной кислоте в течение 7 дней.
Резка осуществлялась, на микротоме «Техном МЗП-01» при помощи замораживающего устройства «ОМТ 0228» при температуре от минус 8 до минус 14С. Срезы наклеивались на стекла и окрашивались гематоксилин-эозином без депарафинирования. Окрашенные срезы заключались в бальзам и высушивались [50]. Окраску срезов проводили по методу Ван-Гизона. Полуколичественная визуальная оценка интенсивности гистохимических реакций по В.В. Соколовскому [79].
Оценка проводится по интенсивности реакции с помощью баллов. Слабая окраска оценивается одним баллом, умеренная - двумя, сильная - тремя. На препарате подсчитывается количество клеток или структур (количество квадратов окуляр-микрометра в поле зрения), окраска которых соответствует одной из градаций. Затем умножают эти цифры на соответствующий балл, а сумму трех производных делят на сумму исследуемых клеток или структур. Полученный результат является характеристикой средней интенсивности гистохимической реакции для изучаемого объекта. Для обработки результатов экспериментов использовали статистические методы с нахождением средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (т) и вероятности ошибки по таблицам Стьюдента. Достоверность различий двух совокупностей оценивали по критерию t [39,62].
Идентификация кальция аскорбата в противоартрозном средстве (таблетках «Флексиэктив»)
Многокомпонентный состав исследуемого лекарственного препарата (глава 2) вызывает определенные затруднения при его анализе. Таблетки содержат вещества с различной структурой и физико-химическими свойствами. С целью разработки методик количественного определения ингредиентов нами изучены возможности использования химических и физико-химических методов. Предварительно был проведен выбор оптимальных концентраций и объемов водных и спиртовых извлечений из препарата, дающих достоверно положительный результат проводимых реакций. Массу растертых таблеток для анализа рассчитывали, исходя из содержания каждого компонента прописи с учетом чувствительности реактивов (Таблица 5).
На этапе разработки состава и технологии таблеток «Флексиэктив» необходимо было изучить степень высвобождаемое ингредиентов. С этой целью использовался метод «вращающейся корзинки» (ГФ XI вып. 2 с. 154). Для определения содержания ингредиентов использовали методики, представленные в настоящей главе. Объем растворителя (вода очищенная) был взят в количестве 500 мл, так как некоторые ингредиенты невозможно было определить химическими методами в большем объеме растворителя. Температура воды поддерживалась с помощью термостата (37С). Время вращения корзинки 45 минут. Для анализа метилсульфонилметана поступали следующим образом: 20 мл диализата выпаривали досуха, полученную смесь растворяли в 1 мл спирт этиловом 95 % и далее поступали, как описано в пункте 3.2. Результаты исследования приведены в таблице 6.
Для количественного определения глюкозамина используют различные химические и физико-химические методы. Химические методы имеют ряд недостатков — длительность анализа, использование дорогостоящих реактивов, плохая воспроизводимость. Кроме того, большинство предложенных методик основано на" определении глюкозамина не по фармакологически активной части молекулы. Наиболее перспективным является спектрофотометрический метод. По нормативной документации для количественного определения глюкозамина в таблетках по 0,3 г (ФС 42-3513-99) и в препарате «Дона» используют методику Эльсона-Моргана, однако данная методика трудоемка и длительна по времени выполнения. Поэтому целью наших исследований явилась разработка менее трудоемкой спектрофотометрической методики количественного определения глюкозамина.
В.Н. Бубенчиковой и И.Л. Дроздовой предложена методика определения инулина или суммы фруктозанов в корнях лопуха, которая основана на кислотном гидролизе фруктозанов до образования 5-гидроксиметилфурфурола [12]. Авторы использовали чувствительную спектрофотометрическую методику определения фруктозы и сахарозы, ранее предложенную Е Гарреттом [108].
По литературным данным известно, что в щелочной, кислой среде, а также при нагревании растворы глюкозамина приобретают желтый цвет. Это связано с образованием продуктов деструкции, одним из которых является 5-гидроксиметилфурфурол. До настоящего времени 5-гидроксиметилфурфурол рассматривался как возможный продукт деструкции в растворах глюкозамина и глюкозы [17,80, 86]. Методика основана на том, что продукты деструкции имеют максимум электормагнитного поглощения в области 278-280 нм, в то время как ни глюкоза; ни глюкозамин не имеют выраженных полос поглощения в этой области. В ходе предварительных исследований было выяснено, что в щелочной среде деструкция глюкозамина протекает намного быстрее. Исходя из этого, для количественного определения глюкозамина мы попытались использовать реакцию щелочной деструкции.
Как следует из рисунка 8, продукт превращения глюкозамина имеет выраженную полосу электро-магнитного поглощения с максимумом при 273 ± 2 нм. Это значение несколько отличается от приведенного в литературе значения, однако в условиях наших исследований оно хорошо воспроизводится.
Для разработки методики предварительно были изучены условия проведения щелочной деструкции [70,95]. Зависимость величины светопоглощения раствора и ее стабильность во времени изучали следующим образом. В мерные колбы вместимостью 25 мл вносили равные объемы 0,01% раствора глюкозамина гидрохлорида (по 17 мл) и добавляли 0,01М раствор натрия гидроксида до необходимого значения рН. Растворы нагревали на водяной бане в течение 10 минут, охлаждали и доводили раствор до метки водой очищенной. Измеряли величину светопоглощения растворов при длине волны 273 нм. Растворами сравнения были растворы натрия гидроксида соответствующих концентраций. Результаты исследования приведены в таблице 7. В таблице приведены средние значения оптических плотностей, измеренные через 60 минут после начала эксперимента. Из таблицы следует, что в результате реакции деструкции глюкозамина образуются продукты, светопоглощение которых стабильно не менее 60 минут и оптическая плотность которых не зависит от рН среды раствора в области от 8 до 10. Зависимость скорости образования продукта реакции, от рН среды изучалось таким же образом, как указано выше.
Валидационная оценка методики определения глюкозамина по продуктам деструкции
Задачей данного исследования явилось проведение валидационной оценки методики Эльсона - Моргана [13]. Для определения линейности данной методики строили градуировочный график.
Построение градуировочного графика. 0,5 г (точная масса) глюкозамина сульфата переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в небольшом количестве воды, доводили объём раствора водой до метки и перемешивали (раствор А). 5 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили водой до метки и перемешивали (раствор Б).
Из раствора Б отбирали в пробирки со шлифом 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 мл, доводили объём раствора в каждой пробирке до 2 мл водой, прибавляют по 2 мл раствора ацетилацетона в каждую пробирку.
Пробирки закрывали пробками и помещали на водяную баню (96-98С) на 20 минут. Уровень воды в бане лишь немного должен превышать уровень раствора в пробирках. Во избежание испарения ацетилацетона верхний конец пробирок должен быть значительно выше уровня воды. Быстро охлаждали растворы до комнатной температуры и прибавляли по 20 мл спирта 95%, тщательно перемешивали и прибавляли по 2 мл реактива Эрлиха.
Содержимое пробирок вторично перемешивали для удаления пузырьков углекислого газа. Через 45 минут измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 530 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, приготовленный следующим образом: в пробирку с притертой пробкой помещали по 2 мл воды и 2 мл раствора ацетилацетона. Пробирку закрывали пробкой и помещали на водяную баню (96-98С) на 20 минут. Быстро охлаждают растворы до комнатной температуры и прибавляют по 20 мл спирта этилового 95%, тщательно перемешивают и прибавляют по 2 мл реактива Эрлиха. Содержимое пробирок вторично» перемешивают для удаления пузырьков углекислого газа. Через 45 минут измеряют оптическую плотность» раствора: на спектрофотометре прис длине волны 530 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный, еледующим образом: в. пробирку с притертой пробкой помещают по 2 мл водьи и 2 мл раствора ацетилацетона. Пробирку закрывают пробкой, и помещают на водяную, баню (96-98С) на 20 минут.
Градуировочный график, представленныйша рисунке411, строили, откладывая по оси ординат оптическую плотность, пооси абсцисс — концентрацию глюкозамина гидрохлорида в граммах в пробе.
Как следует из, представленного» рисунка4 11, линейная зависимость для оптимальных значений оптической плотности- наблюдается в интервале концентрации от 0,12 до 0,60 мг в пробе. Коэффициент корреляции равен- 0,999 .
Проверку правильности методики проводили на трехуровневом эксперименте по 9 последовательным определениям точно известной концентрации глюкозамина, сульфата, находящейся в пределах аналитической зоны. Для, этого были приготовлены растворы модельных смесей таблеток с содержание глюкозамина сульфата соответственно 0,4500; 0,5000; 0,5500т. Далее поступали так, как описано в пункте 3.1.2 «Количественный анализ глюкозамина сульфата методом Эльсона Моргана». Результаты определений представлены в таблице 11.
Результаты определения глюкозамина сульфата в модельных смесях таблеток позволяют говорить о том, что данная методика не отягощена систематической ошибкой, т.к. соблюдается неравенство tebl4 t (P,f). Данная методика позволяет определить содержание глюкозамина сульфата в таблетках с относительной погрешностью определения ±1,01%.
Для проведения дальнейших исследований была приготовлена модельная смесь таблеток «Флексиэктив». Определение количественного содержания глюкозамина сульфата проводили по следующей методике.
Методика определения глюкозамина сульфата в модельной смеси таблеток. Около 0,1 г (точная масса) модельной смеси таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, взбалтывают с 50-60 мл воды в течение 10 минут, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», отбрасывая первые 10 мл фильтрата. По 0,5 мл полученного раствора переносят в 3 пробирки со шлифом П-2-25-14/23 или пробирки биологические П-21-200, доводят водой до 2 мл, прибавляют по 2 мл раствора ацетилацетона в каждую пробирку. Пробирки закрывают пробками и помещают на водяную баню (96-98 С) на 20 минут. Далее проводили определение как описано выше.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца (СО) глюкозамина сульфата. где Ах, Аст - оптическая плотность анализируемого раствора и раствора СО глюкозамина сульфата; ах, аст — масса модельной смеси таблеток и СО глюкозамина сульфата, г; Р - средняя масса одной таблетки, г. Содержание глюкозамина в таблетках должно быть от 0,475 до 0,525 г, считая на среднюю массу одной таблетки, т.е. ± 5% (ГФ XI вып. 1 с. 156).
Методики приготовления растворов ацетилацетона и реактива Эрлиха описаны в главе 2 в пункте 2.1
Приготовление СО глюкозамина сульфата: Около 0,05 г глюкозамина сульфата (точная масса) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, взбалтывают с 50-60 мл воды в течение 10 минут, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», отбрасывая первые 10 мл фильтрата. По 0,5 мл полученного раствора переносят в пробирки со шлифом П-2-25-14/23 или пробирки биологические П-21-200, доводят водой до 2 мл, прибавляют по 2 мл раствора ацетилацетона в каждую пробирку. Пробирки закрывают пробками и помещают на водяную баню (96-98 С) на 20 минут.
![Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс]](/i/i/4381/176171.png "Совершенствование методов стандартизации лекарственных средств на основе корневищ радиолы розовой [Электронный ресурс] Петрова Елена Сергеевна")
