Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Систематика, ботаническая характеристика, ареал, местообитание, сырьевые ресурсы, районы заготовки аира болотного
1.2. Степень изученности химического состава аира болотного 10
1.3. Применение аира болотного в официнальной и народной медицине 16
1.4. Сведения об экспериментальном изучении биологической активности препаратов аира болотного 22
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 32
2.2. Методы исследования 33
2.2.1. Получение суммарных комплексов БАВ из растительного сырья 33
2.2.2. Методы химического исследования 33
2.2.3. Методы микроскопического анализа 40
2.2.4. Методы фармакологического исследования 40
2.3. Статистическая обработка 46
Глава 3. Химическое исследование биологически активных веществ аира болотного
3.1. Качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ
3.2. Исследование химического состава эфирного масла 48
3.3. Исследование химического состава полисахаридного комплекса... 63
3.4. Исследование элементного состава аира болотного 68
Глава 4. Разработка методик стандартизации сырья аира болотного
4.1. Качественные реакции 72
4.2. Определение числовых показателей 73
4.3. Разработка методики количественного определения полисахаридов в корневищах аира болотного
Глава 5. Получение экстракционных препаратов из корневищ аира болотного и оценка их биологической активности
5.1. Выбор рационального метода получения экстракта и его стандартизация . 82
5.2. Исследование противоязвенной активности экстрактов аира болотного 90
5.3. Изучение препаратов аира болотного в комплексной терапии злокачественных новообразований 99
5.4. Получение гранулированной лекарственной формы на основе спиртового экстракта и ее стандартизация 111
Выводы 116
Список литературы 118
Приложение:
- Степень изученности химического состава аира болотного
- Получение суммарных комплексов БАВ из растительного сырья
- Исследование химического состава эфирного масла
- Разработка методики количественного определения полисахаридов в корневищах аира болотного
Степень изученности химического состава аира болотного
Наибольшее число существующих публикаций, касающихся химического состава аира, связано с изучением эфирного масла из корневищ. Это обусловлено тем, что содержание эфирного масла в них достигает 5,8% [81,107]. В других органах растения содержание эфирного масла значительно ниже и составляет: надземная часть 0,2-3,0%, соцветия 0,04%, листья 0,66-2,5% [63]. В составе эфирного масла были обнаружены: а-пинен, камфен, каламеон, (+)-камфора, борнеол, Р-каламен, каламон, акороксид, акорон, изоакорон, каламенол, каламененол, каламенен, калакорен, Р-элемен, каларен, ar-куркумен, 5-кадинен, селинен, кариофиллен, гумулен, гвайен, изокаламендиол, калакон, р-мирцен, (+)-каламусенон, изомер каламусенона, тропой, (-)-кадалатриен-1,4,9, акорагермакрон, аколамон, изоаколамон, шиобунон, эпишиобунон, изошиобунон, акоренон, Р-пинен, каламин, каламол, цинеол, цис-оцимен, транс-оцимен, у-терпинен, аллооцимен, п-цимол, терпинолен, фенхон, транс-окись линалоола, цис-окись линалоола, ментон, 8-элемен, а-копаен, а-туйен, азулен, 1,7-диэпицедрен, а-гурыонен, ментилацетат, каларен, линалоол, а-цедрен, линалилацетат, изоментилацетат, борнилацетат, а-транс-бергамотен, камфенгидрат, Р-гурыонен, р-кариофиллен, терпинеол-4, хотриенол, ментол, Р-акорадиен, а-акорадиен, транс-пинокарвеилацетат, виридифлорен, а-терпинеол, а-селинен, 5-селинен, карвон, пиперитон, у-акорадиен.
Р-сесквифелландрен, п-цимен-8-ол, а-куркумен, 2,6-диэпишиобунон, эпимеры шиобунона и изошиобунона, окись кариофиллена, у-эвдесмол, эпоксид гумулена, транс-неролидол, элемол, гвайенол, цедрол, спатуленол, изоспатуленол, эвдесмол, акоренол, т-кадинол, 10-а-кадинол, 10-эпи-а-кадинол, торреиол, гвайазулен, изомер гвайазулена, цис-изоэлемицин, гумуленол II, гидроксикаламенен, преизокаламендиол, оплопанон, ш/?ш/с-2-этокси-2(10)-пинен, 4-этокси-1-п ментен, эндо-изокамфанон, карвенон, п-ментадиен-1(7),2-ол-8, селинадиенол [55,57,63,64,80,81,90,107,117,118,119,124,125,140,144,145,146,165]. ароматические соединения (Рис.2): 4-метиленизопропилбензол, трансанетол, метиловый эфир цис-изоэвгенола, карвакрол, у-азарон, 4-изопропил-6-метил-1,2,3,4-тетрагидронафтален-1-он (I), 2,4,5-триметоксифенилацетон (II), азароновый альдегид, 2,4,5-триметоксипропиофенон (III), ацетофенон (IV), 2-фенилэтанол (V), бензиловый спирт (VI), 2,4,5-триметоксибензальдегид (VII), 1 -(2,4,5-триметоксифенил)-1 -этоксипропанол-2 (VIII), акорадин, (Z)-3-(2,4,5-тpимeтoкcифeнил)-2-пpoпeнaль (IX), азарон (X), эвгенол, пара-азарон, Р-азарон (до 82%), а-азарон, азариловый альдегид, метилэвгенол [63]; кислоты и их производные: уксусная, гептановая, пальмитиновая, метиловый эфир 2-гидрокси-З-метилвалериановой кислоты (XI) [63]. гетероциклические соединения: 2-пентилфуран (XII), 2-фуральдегид (XIII) [63]. В зависимости от места произрастания аира болотного состав его эфирного масла может варьировать, это сильно влияет на физические и фармако-токсикологические характеристики масла [72]. В связи с этим различают 4 хемотипа A. calamus [143,148,150,151]: 1. не содержащий азарон 2. с содержанием азарона в эфирном масле не более 10% 3. с содержанием азарона не более 25% 4. с содержанием азарона до 90% от массы эфирного масла. Последний произрастает в условиях тропического климата (Индия) и содержит 75-90% р-азарона в составе эфирного масла [72,92,147].
Некоторые авторы рассматривают его как самостоятельный вид - Acorus gramineus Soland., подтверждая это филогенетически, путем анализа и сравнения ДНК и РНК различных хемотипов аира [148]. Также в корневищах аира были найдены: углеводы: мальтоза 0,2%, глюкоза 20,7%, фруктоза [87]; органические кислоты и их производные: масляная, валериановая, капроновая, каприловая, этилизобутират [63]; стероиды: ситостерин [131]; флавоноиды: в корневище - галангин (XIV) [РР]; в надземной части -люценин, представляющий собой дигликозид лютеолина (XIV), содержание 0,048% [83]; хиноны: 2,5-диметоксибензохинон (XVI) [63]; гетероциклические соединения: 2,3-дигидро-4,5,7-триметокси-1-этил-2-метил-3-(2,4,5-триметоксифенил)инден, у-бутиролактон (XVII), 2-винил-2-метилтетрагидрофуранон-5 (XVIII) [63]; жирное масло (4,6%), в его составе кислоты: миристиновая 1,3%, пальмитиновая 18,2%), пальмитолеиновая 16,4%, стеариновая 7,3%, олеиновая 29,1%, линолевая 24,5%), арахидоновая 3,2% [63]. Липидный состав корневищ аира болотного описан Черненко Т.В. с соавт. (2001 г.)
Получение суммарных комплексов БАВ из растительного сырья
Для исследования были взяты корневища и надземная часть аира болотного (Acorus calamus L.), собранные в различных местах естественного произрастания, а так же образец, культивируемый в условиях ботанического сада. Характеристика исследуемых образцов представлена в таблице 2. Сбор материала производили в период 2000-2003 гг. Частично материал для исследования был предоставлен сотрудниками Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН, а так же сотрудниками лаборатории терпеноидов Института органической химии СО РАН, за что выражаем им искреннюю благодарность. Суммарные комплексы БАВ для химических и фармакологических исследований выделяли, используя различные технологические методики [14,30]. а) Эфирное масло, первичное и вторичное (эмульгированное), получали методом перегонки с водяным паром [18,19]. б) Гексановые, хлороформные и метанольные экстракты получали в аппарате Сокслета и холодным настаиванием [30,50]. в) Водные экстракты получали методом мацерации [30,50]. г) Экстракты на 40% и 70% этаноле получали методом реперколяции по Чулкову [29]. 2.2.2. Методы химического исследования Для очистки экстрактов, разделения суммы и выделения индивидуальных соединений применяли методы избирательной жидкостной экстракции, адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле и полиамидном сорбенте, бумажной и тонкослойной хроматографии, ГЖХ и ВЭЖХ [6,7,14,17,18,19,30,34,35,40,89,128]. Для колоночной хроматографии использовали силикагель L40/120 и L40/100 мкм фирмы Chemapol; полиамидный сорбент марки Woelm. и полиамид для колоночной хроматографии ТУ 6-09-10-82-83 Фракция 0,1-0,25 мм. Для бумажной хроматографии применяли бумагу марки FN-3 и Ленинградской фабрики № 2 имени Володарского, марки "С" и "М". Для тонкослойной хроматографии использовали пластинки Сорбфил (ПТСХ-АФ-А-УФ, ПТСХ-П-А-УФ), Silufol UV-254 (Kavalier). Химическую структуру индивидуальных веществ устанавливали с помощью физико-химических методов: а) Спектры ЯМР Ни С записывали на спектрометрах Bruker АС 200 (200 и 50 МГц), АМХ-400 (400 МГц и 100 МГц), DRX 500 (500 МГц и 125 МГц), внутренний стандарт - ТМС, растворители - CDCb, ацетон-о!6, ССЦ. б) Масс-спектры (ЭУ) получали на спектрометре «Finnigan 8200». в) Элементный анализ осуществляли с использованием прибора Е.А. 1106 Carlo ErbaCHNS-O. г) Хромато-масс-спектры регистрировали на газовом хроматографе «Hewlett Packard 5890/П» с квадрупольным масс-спектрометром (HP MSD 5971) в качестве детектора (ЭУ, 70 эВ). д) ВЭЖХ-масс-спектрометрический анализ проводили на жидкостном хроматографе с диодно-матричными и масс-селективными детекторами (Agilent 1100 Series LS/MSD). Диодно-матричный детектор (модель G 1315В) позволил провести детектирование и запись спектров поглощения в диапазоне 230 - 500 нм, а масс-селективный детектор позволяет определять молекулярный вес компонентов с точностью 0,1 а.е. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой Zorbax XDB-C8 (4,6x150мм), наполнитель с диаметром частиц 5 мкм и размером пор 80 А. Колонка термостатировалась при 30С. Диодно-матричным детектором велось одновременное детектирование на длине волны 290 нм при ширине полос 40 нм и контрольной длине волны 560 нм, ширина 100 нм. Масс-селективный детектор (модель G1946C) был использован в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), сканирование проводили для отрицательных и положительных ионов в диапазоне m/z от 100 до 1000. Напряжение на фрагментаторе для положительных ионов - 40 вольт, для отрицательных - 70 вольт. Поток газа - осушителя (азота) - 7 л/мин, его температура - 340С, давление на распылителе - 60 psi (фунтов на квадратный дюйм), температура испарителя - 400С е)
Углеводы исследовали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Bruker LC-21» с рефрактометрическим детектором. Использовали колонку Zorbax NH2 (4,6/150mm). Содержание химических элементов определяли методом нейтронно-активационного анализа (НАА). Высушенное растительное сырьё предварительно озоляли в фарфоровых тиглях при температуре 300-350С до постоянного веса. Затем навеску золы (не менее 100 мг) упаковывали в алюминиевую фольгу и анализировали. Пробу облучали потоком нейтронов при плотности 2x1013 нейтр/см2-с в течение б часов. Наведенный у-спектр исследовали дважды: среднеживущие изотопы определяли через 7 суток, долгожпвущие - через 25 суток. Выбор анализируемых элементов, прежде всего, определялся возможностью метода НАА. Исследование суммы фенольних соединений Хроматографическое определение [75]: 1мл водно-спиртового извлечения на 40 % этаноле упаривали до объёма 0,2 мл и наносили на хроматографическую бумагу марки «ЛМ», хроматографировали в двух направлениях: 1 - 15% уксусная кислота; 2 - в системе : бутанол : уксусная кислота : вода (БУВ) (4:1:2). Фенольные соединения на хроматограммах обнаруживали по флуоресценции в фильтрованном УФ-свете до и после обработки парами аммиака, раствором алюминия хлорида, 10% спиртовым раствором натрия гидрооксида. Обработка 2%-ным спиртовым раствором железа хлорида (III) вызывает окрашивание компонентов, содержащих гидроксильную группу в темно-синий или черный цвет [7,43,46,58,89]. Количественное содержание фенольных соединений в сырье определяли перманганатометрическим методом [19].
Исследование химического состава эфирного масла
Эфирное масло является одной из основных групп БАВ, входящих в состав корневищ аира болотного (разд. З.1.). Оно обладает выраженной биологической активностью и принимает участие в механизме противоязвенного действия аира (разд. 1.4.). Ранее был изучен химический состав эфирного масла аира [55,57,63,64,80,81,90,107,117,118,119,124, 125,140,144,145,146,165], однако для исследования использовались образцы растения, собранные в Европейской части СНГ и странах дальнего зарубежья. Согласно данным ботанико-географических источников [63,72] и наблюдениям научно-исследовательских экспедиций (Алтайский край, Томская область) в некоторых районах Сибирского региона и Р. Казахстан имеются заросли аира болотного, представляющие интерес для промышленной заготовки этого растения (разд. 1.1.). Сведения о химическом составе эфирного масла хемотипов аира, произрастающих в данном регионе, в том числе и по содержанию токсичного р-азарона (разд. 1.2.), в литературе отсутствуют. В связи с этим нами детально исследован химический состав эфирного масла аира болотного, произрастающего на территории Сибири и Р. Казахстан.
Материалом для исследования служили образцы № 1, 2, 3, 6, 9, 10 (разд. 2.1.). Эфирное масло из корневищ аира представляет собой маслянистую жидкость светло-желтого цвета с характерным приятным запахом. Масло, полученное из надземной части, представляет собой маслянистую жидкость светло-желтого цвета с зеленоватым оттенком и травянистым запахом (выход эфирного масла из надземной части - 0,20 % от массы воздушно-сухого сырья).
Всего в эфирном масле обнаружено 144 компонента, из которых методом хроматомасс-спектроскопии идентифицировано 103 вещества, составляющих 70,03% от цельного масла. Преобладающими компонентами масла являются сесквитерпеноиды (84,19%), большую часть из которых, удалось идентифицировать по времени удерживания и масс-спектру (64,18 %). Также в эфирном масле обнаружены изомеры ароматического терпена азарона — гамма-азарон (0,198%) и Z-азарон. (3,64%). Монотерпены составляют 11,79% от массы целого масла. Из них идентифицировано 29 веществ и неидентифицировано 2 вещества, составляющих 0,112% от массы масла. Компонентный состав эфирного масла представлен в таблице 4.
Для установления химической структуры неидентифицированных компонентов, содержащихся в эфирном масле в значительных количествах (0,404-10,93%) - Вещества А-Т, нами было проведено разделение эфирного масла методами вакуумной перегонки и колоночной хроматографии. Структуру веществ, после их выделения в чистом виде, исследовали спектральными методами анализа (разд. 2.2.).
На основании данных масс-спектроскошш и ЯМР-спектроскопии показано, что Вещества А-Т имеют структуру, показанную на рисунках 4-10.
Разработка методики количественного определения полисахаридов в корневищах аира болотного
В настоящее время для определения содержания полисахаридов в растительном сырье используют различные методы, основанные либо на проведении предварительного гидролиза полисахаридов, либо без него. Методы, требующие предварительного гидролиза, основаны на использовании восстанавливающих свойств моносахаров. Определение образовавшихся в процессе гидролиза моносахаров проводят титриметрическими или физико-химическими методами. При фотоколориметрическом определении содержания полисахаридов используется способность моносахаров восстанавливать в щелочной среде пикриновую кислоту до пикрамовой, которая окрашивает раствор в желтый цвет [27]. Также существует методика, основанная на способности продуктов гидролиза полисахаридов взаимодействовать с ароматическими фенолами (фенолом, антроном, резорцином) в присутствии концентрированной серной кислоты [27,101]. Из методов количественного определения полисахаридов, не требующих предварительного гидролиза, используется фотоколориметрический метод, основанный на способности полисахаридов давать окрашенные соединения с этил гидразином в щелочной среде (рН = 8-9) [66]. Гравиметрический метод количественного определения полисахаридов в растительном сырье, предлагаемый Фармакопеей, не является достаточно точным.
Для количественного определения полисахаридов в корневищах аира болотного нами предложен спектрофотометрический метод. Выбранный нами способ основан на измерении оптической плотности продуктов взаимодействия моносахаров, образовавшихся после гидролиза полисахаридов, с кислотой пикриновой в щелочной среде. В качестве стандартного образца использовали субстанции глюкозы (РСО). Спектры поглощения глюкозы и очищенного извлечения из корневищ аира болотного, после проведения комплексообразующей реакции с пикриновой кислотой, совпадают. Максимум поглощения спектров наблюдается при длине волны 470 нм.
Содержащиеся в корневищах аира фенольные соединения (флавононды, кумарпны, сапонины) и свободные сахара мешают определению полисахаридов. Для их удаления нами проводилась предварительная исчерпывающая экстракция сырья 80% этанолом. В водноспиртовом растворе такой концентрации полисахариды не растворимы [47], однако, хорошо растворимы свободные сахара и фенольные соединения. Исчерпывающее извлечение балластных веществ достигается при трехкратной экстракции сырья 80% этанолом, при соотношении сырья и экстрагента 1:50, 1:30 и 1:20, соответственно. Контроль их содержания проводили общепринятыми качественными реакциями [14,75] и методом ТСХ с использованием в качестве детектирующих реагентов специфические реактивы [75] и растворы серной кислоты. В качестве экстрагента для извлечения полисахаридов использовали воду. В таблице 11 приведены сведения о влиянии различных факторов на выход полисахаридов из корневищ аира болотного.
Максимальное извлечение полисахаридов достигается при использовании сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм и при следующих условиях экстракции: нагревание на кипящей водяной бане в течение 45 мин, соотношение сырья и экстрагента 1:100. Исследования показали, что при двукратной экстракции сырья (1-я экстракция - 45 минут и 2-я экстракция - 15 минут) происходит полное извлечение полисахаридов из корневищ аира болотного. Контроль содержания полисахаридов в извлечениях проводили, используя качественные реакции с тимолом и серной кислотой концентрированной и с реактивом Феллинга [19,20].
Для проведения цветной реакции, положенной в основу методики количественного определения полисахаридов, необходим гидролиз последних. Гидролиз полисахаридов полностью проходит при кипячении их в 8% растворе кислоты хлороводородной в течение 15 мин. Затем полученную смесь необходимо нейтрализовать до рН = 4,0-4,5 что является условием проведения цветной реакции с пикриновой кислотой.
При определении оптимального количества 1% спиртового раствора пикриновой кислоты, необходимого для проведения реакции комплексообразования, установлено, что наиболее стабильные результаты получаются при соотношении извлечения и раствора пикриновой кислоты 1:2. Так же нами установлено, что в течение 20 минут после прибавления раствора реактива оптическая плотность продуктов реакции растет, в течение 10-12 минут остается на прежнем уровне, а затем снижается. Поэтому, при определении полисахаридов в корневищах аира, оптическую плотность растворов измеряли после 20 мин. протекания цветной реакции с пикриновой кислотой.
Приготовление 1% раствора пикриновой кислоты. 1,00 г пикриновой кислоты помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в горячей воде и доводили объем раствора до метки. Срок хранения реактива 3 месяца.
Методика определения полисахаридов. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл 80% этанола и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Горячее извлечение осторожно сливают, следя за тем, чтобы частицы сырья оставались в колбе. Колбу с сырьем промывают, используя 10 мл спиртоводной смеси. Операцию экстрагирования повторяют еще 2 раза, последовательно с 30 и 20 мл 80% этанола, время нагревания 15 и 10 мин соответственно. После третьей экстракции сырье трижды промывают, используя по 10мл 80% этанола. Далее в колбу с сырьем прибавляют 40 мл воды. Смесь нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником 45 минут, охлаждают при комнатной температуре в течение 5 мин. Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. Промывают колбу с сырьем 10мл воды и фильтруют в ту же колбу. Экстракцию повторяют с 30 мл воды, время нагревания 15 минут. Переносят сырье на фильтр, промывая колбу, в которой проводилась экстракция, 2 раза, используя по 10 мл воды. Доводят объем извлечения в колбе водой до метки (раствор А). 10 мл раствора А помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты, смесь нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут. Раствор охлаждают, полученное извлечение нейтрализуют 40 % раствором натрия гидрооксида до рН 5 - 6 по универсальной индикаторной бумаге. Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят водой до метки. Затем фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 15 мл фильтрата (раствор Б).
![Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс]](/i/i/4374/196937.png "Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс] Файзуллина Рената Ринатовна")
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
