Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние в области изучения хмеля обыкновенного 11
1.1. Ботанико-морфологическая характеристика, географическое распространение, сорта хмеля 11
1.2. Химический состав хмеля обыкновенного 16
1.3. Фармакологическая активность и применение хмеля обыкновенного в научной и народной медицине 22
Глава 2. Объекты и методы исследований 31
2.1. Объекты исследования, их характеристика 31
2.2. Методы фитохимических исследований 31
2.2.1. Приготовление водных извлечений экстрактов для проведения качественных реакций и хроматографического анализа 31
2.2.2. Изучение углеводных соединений 32
2.2.3. Изучение аминокислот 34
2.2.4. Изучение органических кислот 35
2.2.5. Изучение дубильных веществ 36
2.2.6. Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование фенольных соединений органическими растворителями 37
2.2.7. Изучение фенольных соединений 38
2.2.8. Изучение производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот). 41
2.2.9. Изучение эфирных масел 43
2.2.10. Выделение и идентификация основных групп биологически активных веществ из листьев хмеля обыкновенного 44
2.3. Методики стандартизации сырья 46
2.4. Статистическая обработка данных 47
2.5. Методы биологических исследований 47
Глава 3. Сравнительное изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ листьев и соплодий хмеля обыкновенного. Выделение и идентификация основных групп биологи чески активных веществ 50
3.1. Качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ 50
3.1.1. Углеводы 51
3.1.2. Аминокислоты 52
3.1.3. Органические кислоты 55
3.1.4 Дубильные вещества 59
3.1.5. Фенольные соединения 60
3.1.6. Производные ацилфлороглюцидов (горькие кислоты) 72
3.1.7. Эфирное масло 76
3.2. Выделение и идентификация основных групп биологически активных веществ из листьев хмеля обыкновенного 89
Выводы по главе 3 101
Глава 4. Стандартизация и разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье «Хмеля обыкновенного листья» 103
4.1. Разработка методики определения флавоноидов в листьях хмеля обыкновенного 104
4.1.1. Разработка методики качественного обнаружения флавоноидов в листьях хмеля обыкновенного 104
4.1.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях хмеля обыкновенного 105
4.2. Разработка методики определения суммы производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот) в листьях хмеля обыкновенного 112
4.2.1. Качественное обнаружение производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот) 112
4.2.2. Разработка методики количественного определения суммы производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот) в листьях хмеля 112
4.3. Установление числовых показателей качества и сроков годности сырья 115
4.4. Морфолого-анатомические исследования сырья листьев хмеля обыкновенного 121
4.4.1. Морфологическая характеристика лекарственного растительного сырья «Хмеля обыкновенного листья» 121
4.4.2. Микроскопическая характеристика лекарственного растительного сырья «Хмеля обыкновенного листья» 123
Выводы по главе 4 131
Глава 5. Разработка технологии и изучение параметров качества густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного, изучение его биологической активности 133
5.1. Выбор оптимальных условий экстракции листьев хмеля обыкновенного и разработка технологии получения фитопрепарата на его основе. 133
5.2. Стандартизация густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного 140
5.3. Изучение острой токсичности густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного 145
5.4. Исследование антиоксидантной активности густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного 146
Выводы по главе 5 153
Выводы 154
Литература 156
Приложения 171
- Фармакологическая активность и применение хмеля обыкновенного в научной и народной медицине
- Фенольные соединения
- Установление числовых показателей качества и сроков годности сырья
- Исследование антиоксидантной активности густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время все больше внимания уделяется поиску новых перспективных лекарственных растений и разработке препаратов из растительного сырья. Фитопрепараты, биологически активные добавки к пище, а также продукты питания, обогащенные растительными экстрактами, фитонутриентами, занимают значимую долю в структуре фармаковалеологических и парафармацевтических препаратов. Интерес к этой группе препаратов достаточно высок.
Поиск дешевых и доступных источников лекарственных растений для расширения сырьевой базы РФ является актуальной задачей. В этом аспекте заслуживает внимание изучение производственных отходов сырья хмеля обыкновенного – листьев, имеющих большую вегетативную массу.
Растения рода Humulus L. широко распространены во флоре РФ. Соплодия хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) изучены достаточно подробно и широко применяются в официнальной и народной медицине в качестве седативного, антимикробного, мочегонного, противовоспалительного средства при лечении гастритов, циститов, уретритов, заболеваниях почек, печени и желчного пузыря (Самылина И.А., Горошко О.А., 2005; Арзамасцев А.П., Алексеева М.А., Эллер К.И., 2006; Киселева Т.Л., 1993, 2010; Зузук Б.М., 2004). Используется сырье хмеля обыкновенного в пищевой и пивоваренной промышленностях, в пекарном производстве.
В настоящее время в медицинской практике применяют соплодия культивируемых (независимо от сорта) или дикорастущих растений. В РФ товарное производство хмеля сосредоточено в Чувашской Республике, Республике Марий Эл, Алтайском крае, хмельники также заложены в Республике Башкортостан. Перспективными для изучения являются листья хмеля обыкновенного, которые из-за недостаточной изученности их химического состава и биологической активности используются ограниченно, например, для приготовления салатов, в народной медицине - в качестве седативного средства.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось фармакогностическое изучение листьев хмеля обыкновенного культивируемых сортов и дикорастущего вида для оптимизации переработки сырья хмеля, выявления возможности комплексного использования в медицинской практике и пищевой промышленности.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
–проведение анализа результатов современного состояния исследований по изучению биологических, химических и фармакологических свойств хмеля обыкновенного;
– проведение сравнительного изучения химического состава листьев и соплодий некоторых сортов культивируемого и дикорастущего вида хмеля обыкновенного;
– разработка методики количественного определения основных групп биологически активных веществ (БАВ) в листьях хмеля обыкновенного;
– проведение морфолого-анатомическое изучения сырья листьев хмеля обыкновенного с целью определения диагностических признаков;
– разработка характеристик подлинности и показателей качества сырья «Хмеля обыкновенного листья»;
–разработка технологии густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного (ГЭЛХО), методов стандартизации ГЭЛХО и проведение предварительных биологических исследований;
–разработка проекта НД на листья хмеля обыкновенного.
Научная новизна. Проведено фармакогностическое изучение листьев хмеля обыкновенного культивируемых сортов и дикорастущего вида, обоснована целесообразность комплексного использования сырья. Установлено наличие углеводов, аминокислот, органических кислот, фенольных соединений (дубильных веществ, кумаринов, флавоноидов, фенилпропаноидов), терпеноидов, производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот).
Впервые проведено сравнительное изучение листьев и соплодий хмеля обыкновенного по содержанию основных групп БАВ.
Методами хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ) в листьях хмеля обыкновенного идентифицировано 17 соединений фенольной природы, из которых 7 флавоноидов (рутин, цинарозид, гиперозид, лютеолин-7-гликозид, кемпферол, кверцетин, лютеолин), соединение кумариновой природы (кумарин), 7 производных фенолкарбоновых кислот и фенилпропаноидов (галловая, хлорогеновая, цикориевая, кофейная, неохлорогеновая, феруловая, коричная) и 2 соединения из группы дубильных веществ (танин, эпигаллокатехингаллат). Впервые в листьях хмеля обыкновенного установлено присутствие 15 веществ фенольной природы: флавоноидов (цинарозид , гиперозид, лютеолин-7-гликозид, рутин, лютеолин), кумарина, фенолкарбоновых кислот и фенилпропаноидов (галловая, хлорогеновая, цикориевая, кофейная, неохлорогеновая, феруловая, коричная), дубильных веществ (танин, эпигаллокатехингаллат). Из листьев хмеля обыкновенного впервые выделены и идентифицированы методами ЯМР1Н, ЯМР13С-спектроскопии вещества -ситостерол-3-О--D-глюкопиранозид, кверцетин, рутин и гиперозид.
Методом ВЭЖХ впервые в изучаемом сырье обнаружены свободные органические кислоты: щавелевая, лимонная, винная, аскорбиновая и янтарная; определено их суммарное содержание; определено наличие полисахаридов, дубильных веществ, производных ацилфлороглюцидов (горьких кислот). Перегонкой с водяным паром из листьев хмеля обыкновенного выделено эфирное масло, методом хромато-масс-спектрометрии определен его компонентный состав.
Впервые проведено морфолого-анатомическое изучение листьев хмеля обыкновенного. Установлены диагностические признаки для определения подлинности сырья, наибольшее значение имеют многоугольные, изодиаметрические клетки верхнего эпидермиса листа со слабоизвилистыми стенками и извилистостенные клетки нижнего эпидермиса. В эпидермисе обеих сторон листа отмечены волоски простые одноклеточные, головчатые и Т-образные; многочисленные железки тип «яснотковые», реже булавовидные. Разработаны критерии оценки и числовые показатели, регламентирующие качество сырья «Хмеля обыкновенного листья».
Впервые проведены исследования по стандартизации листьев хмеля обыкновенного, разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин (методом спектрофотометрии по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом) и суммы ацилфлороглюцидов методом неводного титрования. Проведена валидация методики спектрофотометрического определения по показателям линейности, воспроизводимости и повторяемости.
Впервые разработана технология получения густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного (ГЭЛХО), изучена токсичность ГЭЛХО и установлена антиоксидантная активность.
Практическая значимость. Полученные результаты позволят расширить спектр представлений о морфолого-анатомических признаках, химическом составе, биологической активности листьев хмеля обыкновенного. Результаты предварительных биологических исследований являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего углубленного изучения листьев хмеля обыкновенного с целью внедрения в медицинскую практику и пищевую промышленность, что позволит оптимизировать процесс комплексной переработки сырья хмеля.
Предложены методы стандартизация сырья по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы ацилфлороглюцидов. На основании морфолого-анатомического исследования выявлены макро- и микродиагностические признаки для определения подлинности сырья, установлены показателя качества сырья. Материалы аналитических и морфолого-анатомических исследований включены в проект ФС «Хмеля обыкновенного листья».
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
морфолого-анатомический анализ листьев хмеля обыкновенного (Акт внедрения в работу кафедры фармации ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» от 14 мая 2013 г.);
методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях хмеля обыкновенного (Акт внедрения в работу ОКК ООО «Травы Башкирии» от 25 мая 2013 г.);
методика количественного определения суммы ацилфлороглюцидов в листьях хмеля обыкновенного (Акт внедрения в работу ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» от 6 июня 2013 г.);
материалы диссертационного исследования в работу кафедры фармакогнозии и ботаники (Акт внедрения ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России от 25 марта 2013 г.)
результаты диссертационного исследования в работу кафедр фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии, фармацевтической химии, управления и экономики фармации (Акт внедрения ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России от
3 июня 2013 г.)
материалы диссертационного исследования в работу кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии (Акт внедрения ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России от 5 июня 2013 г.)
проект ФС «Хмеля обыкновенного листья» включен в план развития предприятия ОАО «Агрофирма «Ресурсы», г. Чебоксары;
патент РФ на изобретение №2372931 от 20.11.2009 «Антиоксидантное средство растительного происхождения».
Положения, выдвигаемые на защиту:
результаты сравнительного изучения фитохимического состава
листьев и соплодий хмеля обыкновенного;
результаты разработки методик количественного определения суммы
флавоноидов и суммы ацилфлороглюцидов;
результаты морфолого-анатомических исследований листьев хмеля
обыкновенного с установлением диагностических признаков сырья;
результаты исследований и обоснование показателей качества с целью
стандартизации сырья «Хмеля обыкновенного листья»;
результаты предварительных биологических исследований ГЭЛХО и
обоснование возможности комплексной переработки сырья.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и доложены на итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов, итоговых научных сессиях БГМУ и отделениях медико-биологических наук Уфимского филиала НЦ РАМН «Химия и медицина» (Уфа, 2006, 2008); на 3-й международной научной конференции «Актуальные проблемы регионоведения» (Курск, 2008); на научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2011); на научно-практической конференции молодых ученых-медиков, организованной Воронежским, Курским, Казанскими медицинскими университетами (Казань, 2012); на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (Владикавказ, 2013).
Личный вклад автора. Автор принимал участие в выборе направления исследования, постановке цели и задач. Диссертантом проведен информационно-аналитический поиск результатов современных исследований по изучению объектов; выполнены фитохимические, микродиагностические и биологические исследования. Под руководством научного руководителя осуществлен анализ полученных экспериментальных данных, статистическая обработка результатов, сделаны выводы. Доля автора в сборе, анализе и обобщении информации является определяющей. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведено научное обоснование и обобщение полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует форме специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты диссертационной работы соответствуют области исследования специальности, конкретно – пунктам 3 и 6 паспорта фармакогнозии.
Связь задач исследования с планами научной работы. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России по проблеме «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» (государственная регистрация № 01200707996).
Публикации. Основные результаты исследования отражены в 15 научных работах, из них 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК, и одном патенте на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей объекты и методы исследования, экспериментальной части (трех глав), общих выводов, списка литературы и приложений. В тексте содержится 38 таблиц, 46 рисунков. Список цитируемой литературы включает 155 источников, из них 32 – на иностранных языках.
Фармакологическая активность и применение хмеля обыкновенного в научной и народной медицине
Хмель - ценное лекарственное растение. Установлен широкий спектр фармакологической активности соплодий хмеля обыкновенного, что обусловливает его использование в медицинской практике [13, 17, 18, 90, 97, 108, 123].
Горечи хмеля влияют на деятельность ЖКТ, повышают секрецию желудочного сока, возбуждают аппетит, обладают седативными свойствами.
Горькие кислоты обусловливают антимикробную и антибиотическую активность хмеля, угнетают грамположительную и грамотрицательную микрофлору. При кипячении водных извлечений антимикробная активность снижается вследствие разрушения горьких кислот.
Известно, что лупулиновый порошок проявляет антимикробную активность (MIC) in vitro в отношении Bacillus subtilis и Вас. cereus составляет 1 мкг/мл; Вас. anthracis, Micrococcus lysodeicticus, Streptococcus pneumoniae и Mycobacterium phlei — 3 мкг/мл, Str. faecalis - 2 мкг/мл, Staphylococcus aureus -2,5 мкг/мл, Corynebacterium dyphtheriae var. gravis, Mycobacterium tuberculosis и Sarcina lutea - 10 мкг/мл. У гумулона антимикробная активность менее выражена [40, 144, 149].
Исследования показали, что лупулон (9-62 мкг/мл) и гумулон (20-800 мкг/мл) угнетают развитие дерматомицетов, но они не действуют на грибы рода кандида.
Полученные результаты говорят о связи между структурой и антибиотической активностью, а также о том, что все а- и Р-кислоты хмеля являются антибиотиками.
Последние исследования показали наличие противовирусной активности ксантогумолов. Пренилированные фенолы угнетают вирус диареи крупного рогатого скота (модель вируса гепатита С человека HCV, ТІ = 6,0), вирус простого герпеса типа 2 HSV-2 (ТІ 5,3) и риновируса (ТІ = 4,0), менее активны они в отношении вируса простого герпеса типа 1 HSV-1 (ТІ 1,9). Не проявили противовирусную активность сесквитерпены и бета-кислоты.
В связи с вышеизложенным пренилированные фенолы (ксантогумол и изоксантогумол) могут быть предложены как источники для создания новых эффективных противовирусных.средств [36, 128].
Терпеноиды хмеля обладают широким спектром фармакологической активности: бактерицидным, противовоспалительным, спазмолитическим, диуретическим при лечении мочекаменных и почечных заболеваний. Выраженная успокаивающая активность эфирных масел хмеля обусловливает широкое применение препаратов на его основе в качестве седативных средств. Обладая приятным запахом и имея специфический вкус, эфирное масло и производные ацилфлороглюцидов хмеля могут быть предложены для создания средств, воздействующих наЖКТ [41,90, 131].
Во множественных исследованиях доказана противовоспалительная активность полифенольных веществ хмеля обыкновенного. Механизм их действия заключается в ингибирование таких важных медиаторов воспаления как простагландины (циклооксигеназы-1 и циклооксигеназы-2). Также доказана ингибирующая роль ксантогумола в отношении NO-синтазы, продуцируемой макрофагами и эндотелиоцитами.
Ингибиторами продукции окиси азота являются также содержащиеся в экстрактах хмеля олигомерные проантоцианидины, что доказано в тестах с нейронной NO-синтетазой. Самым активным среди проантоцианидинов является процианидин В2) а процианидин В3, катехин и эпикатехин на продукцию N0 вообще не влияют [3,36,124].
Препараты из хмеля обладают капилляропротективной, антиульцероген-ной, противоаллергической активностью.
В литературе имеются данные по изучению антиоксидантной активности Humulus lupulus L.. Описывается подавление окисления ЛГШП, вызванное CuS04, флаванонами и халконами изопренилированного ряда [22, 36, 83, 129, 130].
Проведенные сравнительные исследования показали, что изопренилфла-ваноны являются более слабыми антиокислителями по сравнению с изопре-нилхалконами, а ксантогумол активнее, чем витамин Е [141].
Известно положительное воздействие различных препаратов на основе хмеля на обменные процессы организма человека.
О гормональной активности хмеля было известно еще в прошлом веке.
Эстрогеноподобное действие соплодий хмеля обусловлено наличием пренилированных флавоноидных соединений, активным из которых является 8-пренилнарингенин (8-ПН), 8-изопренилнаренгини (8-ИПН) [88, 126, 137, 140, 148, 150, 151].
Гормоноподобным действием обладают также 6,8-диизопренил-нарин-генин, 6-изопренилнарин-генин и 8-геранилнарин-генин, по своей активности они уступают 8-ИПН в 100 раз. В настоящее время эстрогенная активность 8-ПН изучена как в опытах на животных, так и в клинике. В эксперименте in vitro на эстрогеновых рецепторах матки крыс установлено, что 8-ПН активнее связывается с а-рецепторами, чем с (3-рецепторами. По активности 8-ПН в 100 раз превосходит эстрогенную активность генистеина. Эстрогенный эффект 8-ПН полностью блокируется антагонистом эстрогеновых рецепторов С. 182.780. [88]. Установлено, что 8-ПН в опытах in vitro обладает антиандрогенной активностью. В опытах на крысах было отмечено, что 8-ПН угнетает половое поведение животных [6, 88,155].
Эффективность применения 8-ПН при лечении симптомов менопаузы доказана в плацебоконтролируемых исследованиях у 67 женщин, наблюдаемых в течение 6-12 недель. 8-ПН назначали в капсулах по 100 и 250 мкг. Активность определяли по индексу Куппермана, который включает более 10 симптомов менопаузы («приливы», субдепрессия, сухость слизистой влагалища, тахикардия и др.). Исследования показали, 8-ПН выражено ослабляет симптомы менопаузы, причем эффект зависел от дозы препарата. В дозе 250 мкг эффект 8-ПН отличался от действия такового в дозе 100 мкг на 5%-10% [88].
В опытных моделях in vivo - в тесте повышения проницаемости сосудов матки определена большая активность 8-ИПН [140]. Добавление 8-ИПН в питьевую воду мышам с удаленными яичниками обусловило эстрогенную стимуляцию влагалищного эпителия. Однако эффект достигался в концентрации не менее 100 мкг/мл, которая в 500 раз превышает содержание 8-ИПН в пиве [36].
Говоря об андрогенной активности соплодий хмеля известно, что некоторые вещества ксантогумол, 8-ИПН, 6-ИПН, изоксантогумол, 3-геранилхалконарингенин, 6-геранилнарингенин, 8-геранилнарингенин, 4-0-метил-3-изопренилхалконарингенин и 6,8-диизопренилнарингенин ею не обладают, не обладают они и прогестагенным действием. Однако у СОг экстрактов из соплодий хмеля экспериментально выявлена андрогенная активность. Так, установлено, что водно-спиртовые экстракты из хмеля повышали выработку тестостерона у животных, массу придаточных желез и семенников у крыс. Но структура соединений хмеля обусловливающих андрогенное действие не установлена [36].
Производные ацилфлороглюцидов и пренилированные фенольные соединения проявляют противоопухолевое действие, причем не только за счет цито-токсической активности. Данные биологически активные вещества губительно воздействуют на клетки лейкоза человека HL-60 (IC50 8,67 мкг/мл) за счет индукции Fas-опосредованного апоптоза, однако, при воздействии на клетки гисто-литической лимфомы U937 проявляют меньшую активность. Производные ацилфлороглюцидов. индуцируя протеолитические ферменты про-каспазы, активирующие раннюю стадию апоптоза клеток, проявляют цитотоксическое действие [152]. 8-ИПН и другие производные ацилфлороглюцидов ингибируют канцерогенез на различных стадиях. В дозе 10 мкМ производные ацилфлороглюцидов подавляют I фазу метаболической активации проканцерогенов, в частности аф-латоксина В1, цитохромами Р-450 (CYP1A1). Изоксантогумол и 8-изопренилнарингенин уменьшают уровень ковалентного связывания радиоактивно меченого афлатоксина В1 с микросомальными белками [36]. Исследование в культивируемых клетках гепатомы мышей Нера 1с1с7 показало, что ксан-тогумол проявляет свойства индуктора хинон-редуктазы - фермента II печеночной фазы детоксикации химических канцерогенов [69]. Кроме того, ксанто-гумол и другие изопренилированные халконы выступают как скавенджеры свободных радикалов кислорода (гидроксила, пероксила, пероксинитрила) и, таким образом, тормозят процессы свободно-радикальной модификации проканцерогенов. В культуре ткани молочной железы мышей продемонстрирована способность ксантогумола в наномолярных концентрациях, предупреждать развитие индуцируемых канцерогенами пренеопластических изменений [36, 69].
Исследования по ксантогумолу показали наличие антипромоторного потенциала, в основе которого находится противовоспалительное действие, также выявлены свойства ингибитора циклооксигеназы-1 и циклооксигеназы-2 и антиэстрогенное действие (при отсутствии внутреннего эстрогенного потенциала).
Фенольные соединения
Весьма перспективной для изучения группой БАВ является класс поли-фенольных соединений. Он включает в себя фенолкарбоновые кислоты, фе-нилпропаноиды, фенологликозиды, кумарины, флавоноиды, изофлавоноиды и широко представлен в природе. Данный класс соединений обладает широким спектром фармакологической активности, что определяет широкое применение препаратов на их основе в медицинской практике [55, 56]. Лекарственные средства гепатозащитного, желчегонного, антикоагулянтного, нефропротек-торного действия (иберогаст, легалон, гепабене, хофитол, канефрон, монурель) созданы на основе полифенольных соединений [28, 38, 41, 54]. Для данного класса БАВ также характерны: капилляропротективное, антиоксидантное, диуретическое, спазмолитическое, антисклеротическое, антимикробное и иные виды действий [46, 68, 71]. Низкая токсичность, высокая биологическая активность полифенольных соединений, делает данный класс БАВ перспективным для научных исследований, а также практической медицины и фармации [60, 62, 75]. В связи, с чем поиск дополнительных и дешевых источников их получения, каковыми могут быть листья хмеля обыкновенного, является актуальной задачей. Поэтому следующим этапом нашего исследования явилось установление качественного состава и определение количественного содержания их в листьях и соплодиях хмеля обыкновенного. 3.1.5.1. Кумарнны
Наличие этой группы соединений выявляли в хлороформных фракциях из сырья листьев и соплодий хмеля обыкновенного методом ТСХ [глава 2, раздел 2.2.7.1.] (рис. 6).
В ходе выполненных исследований в листьях и соплодиях хмеля обыкновенного был идентифицирован кумарин (пятно зеленой флуоресценции с Rf 0,91). Умбеллиферон (пятно ярко-голубой флуоресценции с Rf 0,25) был идентифицирован только в соплодиях хмеля обыкновенного, а в листьях - нет.
Определение фенолкарбоновых кислот и фенилпропаноидов проводили в спиртоводных извлечениях и этилацетатных фракциях из листьев и соплодий хмеля обыкновенного методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Silufol» [глава 2, раздел 2.2.7.2.] в системе гексан - ацетон - кислота ледяная уксусная (20:10:0,1) без насыщения.
На стартовую линию хроматографических пластинок наносили по 30 мкл исследуемых растворов водно-спиртовых извлечений из сырья и по 10 мкл 1 % растворов в 70% спирте этиловом рабочих стандартных образцов фенольных соединений. Хроматографические пластинки подсушивали в течение 5 минут на открытом воздухе. Хроматографирование проводили восходящим способом. После прохождения фронтов элюентом 12 см пластинки извлекали и высушивали. Далее пластинки рассматривали в видимом и в УФ-свете при длине волны 254 нм. В видимом свете обнаружено 4 зоны желтого цвета с Rf: 1-0,30; 2-0,35; 3-0,42; 4-0,48, в УФ-свете они проявляются в виде пятен различного цвета: 1,3 — светло-желтого; 2 - темно-зеленого; 4 - сиреневатого. Затем пластинки опрыскивали 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, нагревали 1—2 мин в сушильном шкафу при 100—105 С. Пятна приобретают ярко-желтую окраску в видимом свете и желто-зеленую (за исключением 4 пятна - светло сиреневую) флюоресценцию различной интенсивности в УФ-свете (рис.7).
Для подтверждения результатов идентификации фенолкарбоновых кислот и фенилпропаноидов методом тонкослойной хроматографии нами проведено исследование методом ВЭЖХ [глава 2, раздел 2.2.7.4]. Результаты проведенных исследований фенолкарбоновых кислот и фенилпропаноидов изучаемых образцов представлены в табл. 9 и на рис. 8 и 9.
В результате проведенных исследований методами ТСХ и ВЭЖХ в исследуемых образцах идентифицированы следующие фенилпропаноиды и фе-нолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, цикориевая, кофейная, не-охлорогеновая, феруловая, коричная кислоты.
Анализ качественного состава флавоноидов проводили в спиртоводных извлечениях и этилацетатных фракциях из листьев и соплодий хмеля обыкновенного. Для чего использовались характерные качественные реакции. Например, при проведении цианидиновой реакции в бутанольном слое наблюдалось характерное окрашивание, что выявило присутствие в листьях и соплодиях хмеля обыкновенного агликонов флавоноидов. Другим доказательством присутствия флавоноидов служили: появление желто-зеленого окрашивания с 2% спиртовым раствором АІСІз, желтого окрашивания - с 10% спиртовым раствором NaOH. Наличие флавонолов было доказано реакцией с солями железа (III), появлялось зеленой окрашивание. Использование борно-лимонной реакции с реактивом Вильсона показало наличие ярко-желтого окрашивания с желто-зеленой флюоресценцией, что также доказывало наличие флавоноидов.
Кроме качественных реакций для идентификации флавоноидов нами был использован метод ТСХ на пластинках «Sorbfil» (марки ПТСХ-П-А и ПТСХ-АФ-А-УФ, Россия), «Silufol» (марки UV-254 и UV-366, Чехия) этилацетатных, эфирных фракциях и водно-спиртовых извлечениях исследуемых образцов сырья.
Нами были использованы следующие подвижные системы: этилацетат-муравьиная кислота-вода (10:4:1), этилацетат-ледяная уксусная кислота-вода (5:1:1), н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:1), гексан-ацетон-ледяная уксусная кислота (20:10:0,1). Зоны флавоноидов проявляли опрыскиванием пластинки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида и с последующим рассмотрением зон в дневном и УФ-свете.
В результате исследований установлено, что подвижная фаза: этилацетат - кислота ледяная уксусная - вода (5:1:1) явилась наиболее оптимальной для идентификации флавоноидов. Для хроматографирования использовали 70% водно-спиртовые извлечения из листьев и соплодий хмеля обыкновенного. Результаты приведены в таблице 8.
На стартовую линию хроматографических пластинок наносили по 30 мкл исследуемых растворов и по 10 мкл 1% растворов в 70% спирте этиловом рабочих стандартных образцов фенольных соединений. Хроматографиче-ские пластинки подсушивали на открытом воздухе до высыхания нанесенных веществ и помещали в хроматографические камеры с растворителем. Хрома-тографирование выполняли восходящим способом до прохождения фронтов элюента 12 см. Затем пластинки извлекали и подсушивали в течение 5 минут, рассматривали в видимом и в УФ-свете при Х,= 254 нм. В видимом свете обнаружено 4 зоны желтого цвета с Rf: 1 - 0,33; 2 - 0,47; 3 - 0,48, 4 - 0,59. В УФ-свете они проявляются в виде желто-коричневых и темно-коричневых пятен. Затем пластинки опрыскивали 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, нагревали 1-2 мин в сушильном шкафу при 100-105 С. После чего в видимом и УФ-свете проявились еще пять пятен с Rf: 5 - 0,16; 6 - 0,30; 7 - 0,34; 8 -0,42; 9 - 0,72 (рис. 10).
С целью отделения флавоноидов от сопутствующих фенолкарбоновых кислот нами был использован метод двумерной хроматографии, основанный на различных скоростях перемещения по пластинкам в потоке растворителя анализируемых веществ. Для чего использовали пластинки «Sorbfil» в двух системах [глава 2, раздел 2.2.7.3.]. Пластинки проявляли 5% спиртовым раствором А1СЬ, затем проводили нагревание при t=100—105 С в течение 3 мин. В ходе проведенного анализа обнаруживались зоны адсорбции идентичные РСО рутину с Rf 0,28 в первой системе желтого цвета и во второй системе с зоной адсорбции с Rf 0,90. Зоны адсорбции в извлечениях из листьев хмеля обыкновенного, идентичны РСО рутина (рис. 11).
Таким образом, методом хроматографии в тонком слое сорбента установлено, что водно-спиртовые извлечения из листьев и соплодий хмеля обыкновенного, имеют одинаковый качественный состав флавоноидов. В листьях хмеля обыкновенного впервые идентифицированы рутин, кверцетин, цинаро-зид, лютеолин, гиперозид.
С целью доказательства результатов анализа по изучению качественного состава полифенольных соединений в листьях и соплодиях хмеля обыкновенного, полученных методом ТСХ, нами был также использован метод ВЭЖХ [глава 2, раздел 2.2.7.4]. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 9 и рис. 12 и 13.
Из таблицы 9 видно, что состав исследуемых образцов из листьев и соплодий хмеля обыкновенного приблизительно одинаков. Однако, в образцах листьев хмеля обыкновенного, полученных от ООО «АгроРесурсы», г. Чебоксары (п.г.т. Урмары), содержатся 17 фенольных соединений, в соплодиях хмеля - 19 фенольных соединений.
Установление числовых показателей качества и сроков годности сырья
Числовые показатели качества сортов хмеля и дикорастущего вида определяли в аналитических пробах образцов, изготовленных в лабораторных условиях в трех повторностях. Образцы хранили в сухом, чистом, хорошо вентилируемом помещении, без прямого попадания солнечных лучей, не зараженном амбарными вредителями. Определение всех числовых показателей проводили для различных образцов цельного, измельченного и порошкованного сырья (приложения 2—4).
Определение влажности хмеля обыкновенного, золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, проводили по методикам ГФ-ХІ издания [глава 2, раздел 2.3.3]. Результаты представлены в таблицах 26, 27 и приложениях 2-7.
По результатам анализа влажность исследуемых образцов сырья листьев хмеля составляла от 9,40 до 12,01%. Предлагаем установить норму по этому показателю не более 13%.
По результатам анализа исследуемых образцов сырья листьев хмеля общая зола - составляла от 8,98 до 11,57%, предлагаем установить норму по этому показателю не более 12%. Содержание золы, нерастворимой в 10% хлористоводородной кислоте в исследуемых образцах составляла от 0,98 до 1,69%. Предлагаем установить норму по этому показателю - не более 3,5%.
Нами также определялись такие показатели как органическая примесь, минеральная примесь, содержание других частей растения. Исходя из полученных результатов, предложено установить следующие нормы содержания в сырье: органической примеси не более 0,5%, минеральных примесей не более 0,5%, других частей растения не более 10%. Результаты анализов представлены в таблице 28 и приложениях 2-4.
Нами также определялись все числовые показатели для измельченного и порошкованного сырья листьев хмеля обыкновенного, которые включены в проект ФС «Хмеля обыкновенного листья» (приложения 2-А).
Для установления норм измельченности нами проведен ситовой анализ для измельченного и порошкованного сырья согласно требованиям общей статьи «Определение подлинности, измельченности и содержания примесей в лекарственном растительном сырье» по ГФ XI. По результатам анализа 5 образцов (среднее из 5определений) установлены нормы измельченности. Результаты исследований представлены в таблице 29.
По результатам анализа для измельченного сырья предложена норма содержания частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм, не более 10%, а частиц, проходящих сквозь сито диаметром отверстий 0,5 мм, не более 10%. Для порошкованного сырья предложена норма содержания частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, не более 10%, а частиц, проходящих сквозь сито диаметром отверстий 0,25 мм, не более 10% (приложения 11, 12).
Микробиологическая чистота. Исследования проводились в соответствии со статьей ГФ XII «Микробиологическая чистота». Во всех исследуемых образцах сырья содержание микроорганизмов находится в пределах: аэробных бактерий не превышает 1,0 105 в 1 мл настоя, дрожжевых и плесневых грибов не превышает 1,3 102 в 1 мл настоя, Escherichia coli не превышает в 1 мл настоя. Представителей Семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella в изучаемых образцах сырья не обнаружено (табл. 30).
Полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные образцы сырья листьев хмеля обыкновенного отвечают установленным требованиям, по показателю чистота микробиологическая ЛРС, подвергающегося обработке и нагреванию для приготовления лекарственной формы, категория 4 А [27] (приложения 8-Ю). ЛРС в условиях проведения испытания (1:10) не обладает антимикробным действием.
Установление содержания радионуклидов в ЛРС проводилось в ЦНИЛ ГБОУ ВПО БГМУ. Затем проводили регистрацию и последующую обработку с использованием специальных компьютерных программ сцинтилляционных спектров у-излучения, испускаемого сырьем. Измерения и анализ спектров проводили с использованием у-р спектрометрического комплекса «Прогресс». Образцы сырья, представленные на анализ, соответствуют требованиям Сан-ПиН 2.3.2.1078-01 с изменениями 1, 2, 5 пп.1.6.10 [91]. Результаты определений представлены в проекте ФС «Хмеля обыкновенного листья» (приложения 2-4).
Срок годности сырья листьев хмеля обыкновенного проверялся на образцах, хранившихся в течение 3 лет в сухом, хорошо проветриваемом, защищенном от прямых солнечных лучей месте, в бумажных мешках по ГОСТ 17768-90 в условиях лаборатории. В образцах растительного сырья каждые полгода определялось содержание суммы флавоноидов и производных ацил-флороглюцидов. На основании проведенных исследований предлагаем установить срок годности надземной части хмеля обыкновенного - 3 года (приложения 5-7).
С целью оптимизации переработки сырья хмеля обыкновенного нами изучена динамика накопления основных групп БАВ (суммы флавоноидов и производных ацилфлороглюцидов) в зависимости от фазы вегетации растений. Количественное определение флавоноидов и производных ацилфлороглюцидов проводили по вышеописанным методикам. Результаты накопления групп действующих веществ приведены в табл. 31.
Таким образом, максимальное содержание суммы флавоноидов и производных ацилфлороглюцидов в листьях хмеля обыкновенного отмечено в фазу неполного созревания соплодий. В фазу полного созревания соплодий содержание указанных групп БАВ меняется незначительно, поэтому для оптимизации производственного процесса рекомендуем проводить заготовку лекарственного растительного сырья в указанный период.
Исследование антиоксидантной активности густого экстракта из листьев хмеля обыкновенного
Согласно данным литературы соплодия хмеля обыкновенного обладают антиоксидантной активностью, -это свойство сырья используется в пищевой и пивоваренной промышленности для стабилизации пищевых продуктов. В связи с этим представляло интерес выявить данный вид активности у нового вида сырья - листьев хмеля обыкновенного. С этой целью был использован ГЭЛХО, содержащий в своем составе богатый состав полифенольных соединений, являющихся перспективным классом природных антиоксидантов.
Нами использовались тест-системы, где инициировались: образование свободных форм 02 - СРО и ПОЛ, данные процессы непрерывно протекают в организмах живых существ [68,103,104].
Экспериментальные исследования проводились по методике, описанной в главе 2, раздел 2.5.2.
Для определения результатов ХЛ нами были использованы следующие показатели: светосумма свечения (SL) и максимальная интенсивность свечения (HL), значение которых определялось за определенный промежуток времени [105]. О результатах исследований судили по показателям ХЛ, пересчитывая в % от контроля.
ГЭЛХО растворяли в 0,9% растворе NaCl, дозу фитопрепарата определяли с учетом профилактической и лечебной дозы флавоноидов, определенных Интитутом Питания РАМН (MP 2.3.2.2432-08). Растворы ГЭЛХО в количествах от 0,05 мл до 0,1 мл вносили в тест-системы, описанные в главе 2.
Для проведения хемилюминесценции брали 1 мл пробы (20 мг/мл белка), разводили в 19 мл охлажденного буфера с цитратом натрия; густой экстракт из листьев хмеля вводили в изучаемую модельную систему за одну минуту до добавления сульфата железа (II). Контролем служили модельные системы без включения, исследуемого фитопрепарата (в тех же количествах добавляли 0,9% раствор NaCl).
В 20 мл модельных систем вносили 1% растворы ГЭЛХО в различных дозах (0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 и 1,0 мл), что в пересчете на густой экстракт соответствует: 0,5 мг; 1,0 мг; 2 мг; 3 мг; 5 мг и 10 мг. Число опытов для каждой модельной системы составляло 6.
Результаты влияния ГЭЛХО на показатели хемилюменесценции в модельной системе, генерирующей АФК, представлены нарис. 45 и в табл.37.
Как видно из результатов исследований, представленных в таблице 37 и на рисунке 45, при добавлении раствора ГЭЛХО в дозах от 0,05 мл до 1 мл наблюдалось уменьшение светосуммы SL И амплитуды свечения HL во всех дозах, а максимальное их уменьшение отмечается при дозе 1 мл раствора ГЭЛХО.
Результаты влияния ГЭЛХО на показатели хемилюменесценции в модельной системе с желточными липопротеидами представлены на рис. 46 и в табл.38.
Результаты исследований в модельной системе с желточными липопро-теидами также показали уменьшение светосуммы (SL) и амплитуды свечения (HL) при добавлении раствора ГЭЛХО во всех дозах от 0,05 мл до 1 мл, а максимальное уменьшение данных показателей - при дозе 1 мл исследуемого раствора густого экстракта.
Проведенные исследования показали, что в обеих модельных системах отмечался статистически значимый антиоксидантный эффект при введении раствора ГЭЛХО в дозах 0,05-1 мл по сравнению с контрольными образцами. При этом, в модельных системах с увеличением дозы раствора густого экстракта антиоксидантный эффект усиливался.
Таким образом, на основании полученных результатов следует, что в различных модельных системах раствор ГЭЛХО оказывал прямое антиокси-дантное действие, что дает основание рекомендовать его в качестве эффективного антиоксидантного средства для профилактики и лечения патологических состояний, сопровождающихся активацией свободнорадикальных процессов.
