Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Классификация флавоноидов. Фармакогностические и фармакологические аспекты .
1.1. Основные положения биосинтеза фенилпропаноидных соединений, классификация и распространение флавоноидов 10
1.1.1. Общий биосинтез фенилпропаноидных соединений 10
1.1.2. Классификация, биосинтез и распространение флавоноидов 11
1.1.3. Классификация пренилированных флавоноидов и их распространение 17
1.2. Фармакогностическая и фармакологическая характеристика растения Humulus lupulus.
1.2 Л .Ботаническая характеристика семейства Cannabinaceae 24
1.2.2. Морфологические характеристики растения Humulus lupulus Хмель обыкновенный 25
1.2.3. Фармакогностическая характеристика растения Humulus lupulus 28
1.2.3.1. Внешние признаки 30
1.2.3.2. Микроскопия 30
1.2.4. Химический состав хмеля обыкновенного 30
1.2.4.1. Флавоноиды хмеля обыкновенного 31
1.2.4.1.1. Флавонолгликозиды 31
1.2.4.1.2. Пренилфлавоноиды 31
1.2.5. Фармакологическая характеристика флавоноидов хмеля 33
Глава II Физико-химические методы разделения, идентификация и количественное определение фенольных соединений .
2.1. Выделение, качественная и количественное определение фенольных соединений.
2.1.1. Физические свойства фенольных соединений 36
2.1.2. Химические свойства фенольных соединений 36
2.1.3. Выделение растительных фенолов 37
2.1.4. Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям 37
2.1.5. Физико-химические методы идентификации фенольных соединений..41
2.1.6. Количественное определение фенольных соединений 42
2.2. Методы анализа растительных компонентов хмеля по действующим нормативным документаціям (НД) в сырье и лекарственных препаратах 50
2.3. Анализ пренилированных флавоноидов 51
Экспериментальная часть Определение полифенольного состава хмеля обыкновенного Humulus lupulus.
1.1. Материалы и методы.исследования 54
1.1.1. Объекты анализа 54
1.1.2. Оборудование и реактивы 57
1.1.3. Определение суммы полифенольных соединений (по галловой кислоте) методом Фолина-Чокальтеу 60
1.1.4. Определение суммы флавоноидов в пересчете на рутин 61
1.1.5. Определение состава и концентрации флавонолов и дигидрофлавоно-лов в хмеле обыкновенном 62
1.1.6. Определение пренилированных флавоноидов (ксантогумол и изоксан-тогумол) в хмеле, БАД, лекарственных препаратах и пиве 63
1.1.7. Проведение твердофазного концентрирования образцов пива 63
1.1.8. Определение производных дигидроксикоричной кислоты 64
1.2. Результаты и их обсуждение 65
1.2.1. Установление полифенольного состава хмеля в различных сортах и экстракте 65
1.2.2. Выбор оптимальных условий экстракции пренилированных флавоноидов 68
1.2.3. Оптимизация условий ВЭЖХ для пренилированных флавоноидов 70
1.2.3.1. Выбор оптимальных условий разделения пренилированных флавоноидов 70
1.2.3.2. Выбор оптимальных условий детектирования пренилированных флавоноидов 78
1.2.3.3. Количественное определение пренилированных флавоноидов в растительном сырье и БАД на основе хмеля обыкновенного 79
1.2.3.4. Результаты анализа пренилированных флавоноидов в образцах хмеля 82
1.2.4. Определение пренилированных флавоноидов в образцах пива 91
Выводы 93
Список литературы 95
- Классификация, биосинтез и распространение флавоноидов
- Морфологические характеристики растения Humulus lupulus Хмель обыкновенный
- Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям
- Определение состава и концентрации флавонолов и дигидрофлавоно-лов в хмеле обыкновенном
Введение к работе
Актуальность темы
Хмель (Humulus lupulus, Cannabmaceae) - двудомное многолетнее растение, являющееся источником целого ряда биологически активных соединений, таких как эфирные масла, горечи и флавоноиды. Одними из наиболее интересных с фармакологической точки зрения являются флавоноиды хмеля, представленные флавонолгликозидами и пренилированными флавоноида-ми[90]. В то время как флавонолгликозиды повсеместно встречаются в зеленых растениях, распространенность пренилированных флавоноидов ограничивается незначительным числом видов, в первую очередь порядка крапиво-цветных Urticaceae, семейства тутовых Могасеае и коноплевых Cannabinaceae (последнее семейство включает растение хмель). Хмель является практически единственным существенным источником таких пренилированных флавоноидов, как ксантогумол и изоксантогумол.
Интерес к природным флавоноидам связан с их выраженными анти-оксидантными свойствами, ряду типов флавоноидов присущи антиаллергенные, противовоспалительные, антивирусные, антибактериальные свойства и другие типы биологической активности [69]. Кроме того, ксантогумол и изоксантогумол хмеля проявляют антипролиферативные и антиканцерогенные свойства [49]. По экспериментальным данным многих ученых, наличие изо-преноидных цепей приводит к разнообразным модификациям биологической активности, которая связана, в основном, с выраженным сродством с биологическими мембранами и более выраженными взаимодействиями с белками.
Хмель входит в состав ряда известных лекарственных препаратов и многих зарегистрированных биологически активных добавок (БАД) к пище.
В настоящее время становится все более актуальной проблема оценки качества сборов лекарственных трав и комплексных БАД, а также разработки достоверных критериев их идентификации.
Необходимость определения незначительных концентраций действующих веществ на фоне сложного матрикса БАД обуславливает высокие
требования к селективности и чувствительности методов анализа.
Решение этих задач тормозится отсутствием в большинстве случаев достоверных методов контроля действующих веществ в составе комплексных лекарственных препаратов и БАД. Большинство существующих традиционных нехроматографических методов определения индикаторных компонентов растительных БАД неселективны, трудоёмки и могут в отдельных случаях приводить к получению как ложноположительных результатов, так и к искажению количественных данных.
Одними из наиболее перспективных методов для решения этих задач являются хроматографические методы, сочетающие высокую эффективность разделения компонентов БАД с избирательностью и чувствительностью детектирования.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования являлась разработка методики идентификации и количественного определения индикаторных флавоноидных компонентов хмеля, пригодных для рутинного контроля качества БАД и лекарственных препаратов на основе соплодий и экстрактов хмеля.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
изучение физико-химических свойств флавоноидных компонентов хмеля с целью разработки новых методов анализа;
изучение индикаторных флавоноидных компонентов хмеля различных сортов, в том числе и пренилированных флавоноидов;
разработка доступного, достоверного и воспроизводимого метода количественного определения флавоноидных компонентов хмеля.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545.
Научная новизна результатов исследования
Разработана оригинальная методика идентификации и количественного определения индикаторных пренилированных флавоноидов (ксантогумол и изоксантогумол) в лекарственных препаратах и БАД. Экспериментально установлен полифенольный состав хмеля обыкновенного в нескольких сортах.
Практическое значение работы
Разработанные методики использовались при гигиенической экспертизе более 20 БАД к пище в ГУ НИИ Питания РАМН.
Разработанная методика внесена в проект второго издания «Руководства по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.
Классификация, биосинтез и распространение флавоноидов
Фенольными соединениями называются вещества, содержащие ароматические кольца с гидроксильной группой, а также их производные. Полифенолами называются вещества, которые содержат больше одной гидроксильной группы в ароматическом кольце. Число природных фенольных соединений растительного происхождения велико, и функции их многообразны. Считается, что почти все полифенолы являются активными метаболитами клеточного обмена и играют большую роль в различных физиологических процессах — фотосинтезе, дыхании, росте, устойчивости растений к инфекционным болезням [15].
Фенилпропаноиды составляют большую группу фенольных соединений, которые синтезируются только в растениях. Вещества этой группы включают полимерные лигнины, кумарины, суберины, стильбены и флавоноиды. Фе-нольные полимеры лигнина входят в состав вторичной клеточной стенки в виде ксилемы с трахеидами и сосудистыми элементами, что дает возможность растениям противостоять ветру и устремляться вверх к солнечному свету [6], а также они защищают многие высшие растения от болезней. Для стильбенов описана антимикробная активность и фунгицидное действие по отношению к разрушающим древесину грибам. Флавоноиды являются антиоксидантами, УФ протекторами [88, 53, 96], обладают пропеллентными и антибиотическими свойствами во многих видах растений [60, 62, 63]. Синтез растениями по-лифенольных кумаринов и стильбенов, обладающих антибактериальными свойствами, является одним из механизмов защитного ответа на проникновение патогена. Цель защитного механизма состоит, во-первых, в ограничении доступа микроорганизмов к питательным веществам растения, во-вторых, в инактивации размножения и распространения патогена [85].
За последние несколько лет были рассмотрены многие аспекты биосинтеза фенилпропаноидньтх соединений. Например, Nicholson и Hammerschmidt [72], Dixon и др. [44], и Walter [101] описали роль фенольных соединений в резистентности растений к болезням; Hahlbrock и Scheel [53], Rhodes [80], Dooner и Robbins [46] рассмотрели физиологию и молекулярную биологию метаболизма фенилпропаноидов; Boudet и др. [37], Ebel и Hahlbrock [47] исследовали биохимию фенилпропаноидного биосинтеза и т.д.
Первоначальные стадии синтеза всех фенилпропаноидов называются «общий фенилпропаноидный путь» (см. рис. 1). Ароматическая аминокислота фенилаланин, претерпевая несколько превращений, переходит в высокоэнергетические эфиры гидроксициннамоил коэнзима А (СоА). Эти СоА-эфиры могут быть превращены либо в лигниновые предшественники, либо в растворимые гликозиды.
Лигниновые гликозиды могут быть превращены в полимерные лигни-ны через специфический лигниновый биосинтетический путь, в котором участвуют циннамоил — СоА-редуктаза и циннамоил - алкогольдегидрогеназа [100, 101]. 1,1,2, Классификация, биосинтез и распространение флавоноидов
К основным классам флавоноидов относятся флаваноны, дигидрохал-коны, халконы, антоцианидины, флаванонолы (дигидрофлавонолы), флаво-нолы, флавоны и. изофлавоноиды (см. рис. 2). Разнообразие флавоноидов обуславливается наличием большого числа гидроксилированных, метилированных, ацилированых, О- и С-гликозилированных производных в ароматических ядрах А и В, а также асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле [7].
Халконсинтетаза (ХС) является первым ферментом в биосинтезе флавоноидов. ХС катализирует высокоспецифичную реакцию, в которой три молекулы малонил-СоА и одна молекула 4-кумарол-СоА конденсируются с образованием халкона нарингенина, из которого потом получаются все другие флавоноиды и изофлавоноиды [81, 53]. Следовательно, в формировании халкона лежит реакция конденсация, в которой димерные ХС энзимы катализируют постепенное добавление трех остатков малонил-СоА с гидроксицинна моил-СоА эфиром [81]. Превращение халкона в флаванон катализируется халконизомеразой (ХИ). ХИ катализирует замыкание кольца С у халконов, образуя соответствующие флаваноны [51]. После образования флаванонов биосинтез флавоноидов идет по нескольким направлениям, а именно: образование флавонов, дигидрофлавононов, флавонолов, антоцианов и изофлава-нонов. Превращение флаванонов в флавоны катализируется флаванонсинте-тазой (ФС) [38]. Дигидрофлавонолы синтезируются из флаванонов при помощи фермента флаванон-3-гидроксилазы (ФзГ). Дигидрофлаваноны являются предшественниками для образования флаванонов и антоцианов. Реакция, которая катализируется изофлаванон-синтетазой (ИФС), превращает флаваноны в изофлаваноны.
Флавоноиды широко распространены в растительном мире. Особенно богаты флавоноидами высшие растения, относящиеся к семействам розоцветных (различные виды боярышников, черноплодная рябина), бобовых (софора японская, стальник полевой, солодка), гречишных (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий), астровых (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма), яснотковых (пустырник сердечный) и др.
Также флавоноиды встречаются в тропических и альпийских растениях. Обнаружены и у низших растений: зеленые водоросли (ряски), споровые (мхи, папоротники), хвощи (хвощ полевой), а также у некоторых насекомых (мраморно-белая бабочка).
Встречаются флавоноиды в различных частях растений, но чаще в надземных: цветках, листьях, плодах [61]; значительно меньше их в стеблях и подземных органах. Наиболее богаты ими молодые цветки, незрелые плоды. Локализуются в клеточном соке в растворенном виде. Содержание флаво-ноидов в растениях различно: в среднем 0,5-5%, иногда достигается 20% (в цветках софоры японской). В растениях флавоноиды встречаются в виде гликозидов и в свободном виде. Под влиянием ферментов они расщепляются на углеводную часть и агликоны [10].
Морфологические характеристики растения Humulus lupulus Хмель обыкновенный
Растение хмель обыкновенный (Humulus lupulus) относится к семейству коноплевые (Cannabinaceae), род хмель (Humulus). Семейство коноплевые (Cannabinaceae) входит в порядок крапивоцветные (Urticales) [3, 31]. Представителями семейства коноплевые являются двудомные растения, которых насчитывается около 1500 видов, 60-80 родов [21]. В России выделено два вида хмеля: Humulus lupulus хмель обыкновенный и Humulus japonicus хмель японский.
Humulus lupulus хмель обыкновенный — двудомное растение, формирует многолетнюю подземную часть и однолетнюю надземную массу с вьющимися стеблями [1]. Околоцветник женских цветков после цветения плен-чато-односторонне разрастающийся, покрытый мелким пушком и железками. Корневище длинное, ползучее; стебли вьющиеся. Распространен по долинам рек, по оврагам, в сырых широколиственных лесах, по кустарникам и в ивняках [8]. В странах Дальнего Востока хмель известен только как культурное растение, возможно завезенное с Запада, частично культивируется народами Дальнего Востока как Humulus cordifolius [25]. Хмель обыкновенный подразделяется на три подвида: европейский, сердцевидный и американский.
Хмель обыкновенный европейский характеризуется пальчаторассечен-ными листьями с тремя-пятью лопастями; на верхних частях стеблей и боковых ветвей листья сердцевидные; соплодия средней и крупной величины с большим содержанием лупулина и приятным хмелевым ароматом. У хмеля обыкновенного сердцевидного все листья цельные, нерассечен-ные, сердцевидной формы. Соплодия мелкие, с низким содержанием лупулина, аромат хмелевый [14].
Хмель обыкновенный американский малооблиственный, имеет пальча-торассеченные листья, на концах плодоносящих ветвей — сердцевидные. У этого подвида соплодия крупные, с большим содержанием лупулина. Его отличительной особенностью является нетипичный аромат для хмеля - запах черной смородины. Произрастает в Северной и Южной Америке [1].
Humulus japonicus хмель японский - однолетнее декоративное растение со стелющимися или слабовьющимися стеблями. Околоцветник женских цветков после цветения неразрастающиися, острый, кожистый, снаружи и по краю щетинистый, с очень редкими железками. Распространен по долинам рек, на песчаных почвах, часто близ жилья, как сорное растение [24].
Главное корневище хмеля - это много- j _ годичные кольца; 2- основа-летний подземный орган побегового происхо- ние скелетных корней, ждения с расположенными на нем почками, образуется из вегетативных частей растения (рис. 8.). В главном корневище, как и в корнях, ежегодно осенью накапливается большое количество пластических веществ (крахмала, Сахаров, белков и др.), которые способствуют образованию из почек однолетних побегов, дающих впоследствии урожай соплодий. От главного корневища отходят в глубь почвы до Зм хорошо развитые скелетные корни. На глав ном корневище часто образуются боковые корневища, которые представляют собой видоизмененные побеги, растущие в почве в горизонтальном направлении [1].
В процессе вегетации молодые побеги превращаются в плодоносящие стебли, которые представляют собой вьющиеся лианы длиной 8-9м, толщиной 13-18мм. По всей длине стебля в местах прикрепления листьев образуются узлы, а из пазух листьев развиваются боковые ветви. Стебли у основания имеют заполненную сердцевину, выше — полые.
Поверхность листовой пластинки хмеля пальчатораздельная, а на концах боковых ветвей - сердцевидной формы. По длине стебля листья по форме и величине размещаются неодинаково: в нижней части стебля формируются крупные трех-, пятидольные; в средней части - наиболее крупные четырех-, пяти-, реже семидольные; в верхней части главного стебля и на боковых побегах - трехдольные или цельные. Края листовой пластинки неравно-пильчато-зазубренные, а жилкование листьев сетчатое. На нижней стороне листа жилки выступают, образуя ребра, на которых имеются шипы. Вся по верхность листовой пластинки, особенно верхняя ее сторона, покрыта жесткими волосками.
При изучении анатомического строения листа под микроскопом можно обнаружить, что верхняя поверхность листовой пластинки покрыта эпидермисом, который защищен слоем плотной кутикулы, предохраняющей лист от излишнего испарения воды. Под верхним эпидермисом находится слой палисадной паренхимы, содержащей хлоропласты, обеспечивающие фотосинтез. Ниже палисадной паренхимы имеется губчатая паренхима из рыхлосоеди-ненных между собой клеток. К ней примыкает эпидермис нижней поверхности листа с множеством устьиц и выростов в виде волосков и щетинок.
Идентификация фенольных соединений по цветным реакциям
Фенольные соединения со структурой, приведенной на рис. 13, образуют хелаты с различными металлами [96]. Распространенным реактивом-для определения фенольных соединений, основанным на реакции образования хелатов, является хлорид железа (III), при действии которого образуются красные, синие или сине-зеленые ком плексы большинства фенолов. Широко используются также соли ряда других металлов — хлорид алюминия, оксихлорид циркония, ацетат магния [96]. Образование ж-комплексов
Другой тип цветных реакций основан на образовании -комплексов. Данная реакция может быть использована для фенольных эфиров, ароматических углеводородов, для некоторых ароматических гетероциклов и других ненасыщенных соединений. Тетрацианоэтилен является самым используемым реагентом для образования яг-комплексов. Тетрацианоэтилен реагирует с фенольными соединениями в щелочной среде с образованием насыщенно окрашенных/?-трициановинилфенолятов .
Эта реакция протекает только при свободном пара-положении по отношению к фенольному гидроксилу, или, если пара-положение занято легкоподвижной группой, такой как карбоксил или гидроксиметил [98]. Реакция азосочетания фенолов с солями диазония
При взаимодействии фенолов с солью диазония образуется азокраси-тель. Сочетание идет в о- и и- положениях у С-5 и С-8 молекулы флавонола по отношению к фенольному гидроксилу в щелочной среде (рН 9,0-10,0) (рис. 15). Легче сочетание происходит в п- положении из-за образования длинной цепи сопряженных связей. В нейтральной среде выпадает осадок азокрасителя красного цвета. При рН 10,0 реакция азосочетания протекать не будет из-за перехода соли диазония в соль (диазотат) [20]. С флавонолами реакция протекает быстро, с флавононами — со средней скоростью, с флавонами - медленно [12]. Существует широкий спектр солей диазония: р-диазонийбензенсульфонат, диазотированная сульфаниловая кислота, р-нитрофенилдиазониятетрафторборат и другие [98].
Колориметрические методы! основаны на измерении оптической плотности окрашенных растворов в видимой области спектра. Для колориметрии флавоноидов используются: реакция взаимодействия с хлоридом алюминия (оптическую плотность окрашенного раствора измеряют при длине волны 400-430 нм); реакция с хлоридом циркония (IV) в буферном растворе (максимум оптической плотности для рутина при длине волны 400 нм, для квер-цитрина - 402 нм и для кверцетина — 468 нм); реакция с сернокислым раствором белого стрептоцида с нитритом натрия в щелочной среде (флавоноиды образуют азокрасители, оптическая плотность измеряется при 430-435 нм). Суммарное содержание полифенольных соединений (обычно в пересчете на галловую кислоту) определяют методом Фолина-Чокальтеу, основанным на образовании раствора окислов вольфрама и молибдена, с абсорбционным максимумом при 750 нм [19].
Флуориметрический метод основан на измерении естественной флуоресценции или флуоресценции продуктов реакций, в результате которых об разуются соединения, способные флуоресцировать. Например, кемпферол, кверцетин, изорамнетин, мирицетин дают комплексы с солями алюминия с максимумами возбуждения при длинах волн от 420 до 430 нм и максимумами эмиссии - от 470 до 500 нм.
В УФ-спектрофотометрии (УФ-СФМ) для подтверждения структуры флавоноидов используют поглощение при двух основных абсорбционных максимумах: первая полоса в области от 320 до 385 нм, соответствующая поглощению кольца В, и вторая полоса в области от 250 до 285 нм, соответствующая поглощению кольца А (см. формулу на стр. 13). Сдвиг в длинноволновую область вызывается увеличением числа гидроксильных групп, например, до 367 нм для кемпферола, до 371 нм для кверцетина и 374 нм для ми-рицетина [26]. Производные флавана — флаваноны, флаван-3-олы и др. имеют максимумы поглощения только в области от 250 до 280 нм.
Полифенолы, как слабые кислоты, ионизируются в щелочных условиях, что дает возможность применения различных видов капиллярного электрофореза в анализе флавоноидов [77, 64, 66], танинов [39] и фенольных ки слот [86, 36, 57]. В отдельных случаях фенольные соединения могут быть определены методом кислотно-основного титрования в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде и ацетоне [12].
Для определения суммы флавоноидов чаще всего используют спек-трофотометрический метод, который основан на реакции с хлоридом алюминия. Принцип метода заключается в том, что реагент образует кислотоустойчивые комплексы с С-4 кетогруппой и или с С-3 или С-5 гидроксильной группой флавонов и флавонолов. Кроме того, хлорид алюминия образует ки-слотонеустойчивые комплексы с дигидрокси-группами в ортоположении А и В колец флавоноидов. Максимумы поглощения комплексов флавонолов с С-3 и С-5 гидрокси-группами (галангин, морин, кемпферол) и с дигидрокси-группами в ортоположении (рутин, кверцитрин и мирицетин) составляют 415-440 нм. Максимум абсорбции комплексов, образованных хризином и апигенином (флавоны), у которых есть только Є-5 гидроксил- и С-4 кето-группы, составляет 395 и 385 нм соответственно [41].
Принцип взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином основан на его реакции с кетонами и альдегидами с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Следовательно, флавоны, флавонолы и изофлаво-ны с С2-СЗ- двойной связью не способны реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином, в то время как флаваноны (нарингин, нарингенин, гесперидин) и флаванонолы (дигидрокверцетин, дигидрокемпферол) образуют соединения, имеющие максимум поглощения при 495 нм [19].
Наиболее распространенным методом в настоящее время для идентификации и количественного определения флавоноидов является ВЭЖХ. Ввиду относительно высокой полярности полифенольных соединений практически не используется нормально-фазовая НФ-ВЭЖХ на силикагеле. Наиболее широко используется обращенно-фазовая ОФ-ВЭЖХ, т.е. хроматогра-фический процесс, при котором неподвижная фаза (НФ) менее полярна, чем подвижная (ПФ) [100]. При ОФ-ВЭЖХ вещества выходят по мере снижения их полярности, причем увеличение полярности ПФ увеличивает времена удерживания, т.е. замедляет выход вещества из колонки. В ОФ-ВЭЖХ часто используется химически модифицированный длинноцепочечными (С 18, С16, С8) алкилсиланами силикагель (химически привитая обращенная фаза), поверхность которого становится малополярной в результате образования устойчивых к гидролизу Si-O-Si-C- связей. Силикагель переводят в обращенно-фазовый сорбент путем реакции с алкилтрихлорсиланом, чаще всего октаде-цил-трихлорсиланом. В результате поверхность силикагеля модифицируется химически связанными С18 - углеводородными цепями [65]. В отличие от НФ-ВЭЖХ на силикагеле, при ВЭЖХ на химически привитых фазах механизм разделения основан не только на явлениях адсорбции (за счет гидрофобных взаимодействий между разделяемыми компонентами и углеводородными цепями сорбента), но включает и ЖЖР между ПФ и слоем растворителя, удерживаемого неполярной поверхностью сорбента. Силикагель может быть модифицирован не только неполярными углеводородными остатками, но и полярными группами (полярные привитые фазы). Такой тип НФ получают при реакции силикагеля с органическими хлорсиланами, содержащими цианопропильную или аминопропильную группы. При разделении на полярных привитых НФ имеют место как распределительный, так и адсорбционный механизмы. В зависимости от полярности подвижной фазы на адсорбентах этого типа можно осуществлять как НФ-ВЭЖХ, так и ОФ-ВЭЖХ [17].
Определение состава и концентрации флавонолов и дигидрофлавоно-лов в хмеле обыкновенном
Подготовка проб для хроматографического анализа. 3,0г измельченного сырья соплодий хмеля помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 80 мл смеси метанол-вода-соляная кислота (60:20:8). Экстракцию проводят на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1-1,5 часов. Гидролиз проводят в присутствии 0,1 г аскорбиновой кислоты. Экстракт охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через целлюлозный или тефлоновый фильтр с размером пор до 0,45 мкм в мерную колбу объемом 100 мл. Объем экстракта доводят дистиллированной водой до 100 мл.
Условия ВЭЖХ. Подвижная фаза: метанол-водный раствор о-фосфорной кислоты (53:47), рН 2,6. Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Кверцетин, кемпферол, мирицетин и изорамнетин детектируются при длине волны 370 нм; дигидрокверцетин 270 нм. Пробоподготовка образцов хмеля для хроматографического анализа. 2,0г соплодий хмеля или БАД на основе соплодий хмеля экстрагируют хлороформом 50 мл (или ацетоном) в течение 1 ч при. встряхивании. Экстракт фильтруют и упаривают в вакууме на ротационном испарителе. К остатку добавляют 50 мл метанола, кипятят с обратным холодильником. Мета-нольный раствор центрифугируют, супернатант отделяют и фильтруют. Пробоподготовка образцов БАД и лекарственных препаратов на основе экстрактов хмеля для хроматографического анализа. 1,0 г экстракта или содержимое капсул или растертых таблеток (эквивалентное этому количеству сырья или экстракта) помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят объем до метки метанолом, после чего тщательно перемешивают.
Картридж СПС регенерируют 10 мл этилацетата, кондиционируют 5 мл ацетонитрила и 5 мл воды. 20 мл пива дегазируют и пропускают через картридж с объемной скоростью 3 мл/мин, затем картридж промывают 5 мл воды. Воду вытесняют из картриджа током азота, флавоноиды элюируют 10 мл этилацетата. Этилацетат отгоняют в токе азота, сухой остаток перерастворяют в 300 мкл ацетонитрила. Приготовление рабочих стандартных растворов Точные навески 1 мг стандартных образцов ксантогумола и изоксанто-гумола растворяют в 10 мл метанола. Концентрации стандартов 0,1 мг/мл. Условия ВЭЖХ. Неподвижная фаза: Zorbax Eclipce XDB С8 (USA). Подвижная фаза: ацетонитрил-метанол-1% -водный раствор муравьиной кислоты (35:32:33), скорость потока 1 мл/мин. Детектирование: для халконов (ксантогумол) детектирование по УФ-поглощению при длине волны 370 нм; для флаванонов (изоксантогумол) детектирование по УФ-поглощению при длине волны 290 нм; Детектирование с помощью флуориметрического детектора при максимумах возбуждения 290 нм и эмиссии 440 нм (для флаванонов). Приготовление пробы 1,0г измельченного сырья соплодий хмеля помещают в колбу вместимостью 100 мл и прибавляют 50 мл смеси метанол — вода (7:3). Экстракцию проводят при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 20 минут. Экстракт охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Объем экстракта доводят водой до 100 мл. Приготовление рабочего стандартного образца
По 5 мг феруловой и хлорогеновой кислот вносят в мерные колбы вместимостью 50 мл. Добавляют метанол до метки. Концентрации кислот 0,1 мг/мл. Условия проведения ВЭЖХ. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05М NaH2P04 рН2,6 (15:85). Неподвижная фаза 150x4,6 мм Zorbax Eclipce XDB С8. Скорость потока 1,0 мл/мин. Детектирование при 330 нм. Экспериментально определено суммарное содержание и состав полифенольных соединений хмеля обыкновенного в трех сортах (хмель «Сборный», хмель «Сумерь» и хмель «Крылатский») и сухом экстракте хмеля — образец № 21 (данные представлены в таблице № 5). Сумма полифенольных соединений составила 1,4-1,9% от сырого веса соплодий хмеля. Сумма фла-вонолгликозидов находится в пределах 0,9-1,2%.
Халконы: в соплодиях хмеля обнаружен пренилированный халкон — ксантогумол. Его содержание составило 0,2-0,27% в различных сортах хмеля и 0,02% в экстракте хмеля. Такое низкое содержание ксантогумола в экстракте может быть связано с использованием высоких температур в процессе производства, так как ксантогумол под воздействием температуры изомери-зуется в изоксантогумол. Содержание пренилированного флаванона — изо-ксантогумола является минорным и составляет 0,004-0,005% для различных сортов хмеля и 0,01% для экстракта хмеля (см. примечание выше). В соплодиях хмеля идентифицирован ряд флавонолов: кверцетин, кемпферол и ми-рицетин (рис. 19); упоминающийся в ряде статей как компонент экстрактов хмеля изорамнетин не был обнаружен. Общее содержание данных соединений относительно невелико, их сумма составляет 0,16-0,3%, (в пересчете на сырой вес), в то время как содержание флавонолов в сырье, например гинкго билоба, составляет около 0,9%. По сравнению с соцветиями эхинацеи, где суммарное количество производных дигидроксикоричной кислоты оценивается в 5-6%, в хмеле содержится относительно небольшое количество полифенольных дигидроксикоричных кислот — на уровне около 0,03-0,2% (рис. 20).
Пренилированный халкон ксантогумол 0,2-0,27% и флаванон-3-ол-дигидрокверцетин 0,2-0,6% являются основными флавоноидами хмеля. Ксантогумол может рассматриваться как индикаторный флавоноид, и его со держание может служить критерием качества сырья, БАД и лекарственных препаратов на основе хмеля.
