Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из важных фундаментальных проблем современной молекулярной и клеточной биологии является определение структурных механизмов функционирования генома и выяснение функциональных особенностей компартментализации ядер эукариот
Структурные механизмы играют важную роль в обеспечении функционирования ДНК в клетке В настоящее время общепризнано, что в интерфазном ядре гены расположены стратегически упорядоченно и иерархически сегрегированы в пространстве ядра ДНК из разных хромосом занимают разные, непересекающиеся между собой «хромосомные территории» в ядре Во многих работах было показано, что существует корреляция между активностью гена и его расположением в «хромосомной территории»
Для экспрессии одиночных или небольших групп генов определяющее значение имеют низшие уровни компактизации ДНК (нить ДНК - нуклеосомные фибриллы - фибриллы толщиной 20-30 нм) и структурные переходы между ними С другой стороны, структуры высших уровней организации (хромомеры -хромонемы - хромосомы) и их пространственное расположение в ядре играют важную роль в упорядочении транскрипции и репликации больших групп генов, влияющих на фенотипическую экспрессию Дискретные структуры петельного уровня организации - хромомеры - рассматриваются некоторыми авторами как основной структурный мотив, определяющий как функционирование хроматина в интерфазных ядрах, так и структуру хромосом
Особый интерес для проведения исследований структурных аспектов функционирования генома и выяснения функциональных особенностей компартментализации ядер представляют макронуклеусы - соматические ядра инфузорий Они широко используются в качестве модельных объектов для изучения взаимодействия гистонов с ДНК в составе хроматина, структурных перестроек нуклеосомного уровня хроматина при его активации и т п В то же время макронуклеусы имеют ряд отличий от ядер высших эукариот Размер молекул ДНК в них гораздо меньше, чем в ядрах высших эукариот, при делении макронуклеусов хроматин не образует структуры типа метафазных хромосом, нет веретена деления, а само деление происходит путем так называемого амитоза
На светооптическом уровне в макронуклеусе некоторых инфузорий, например В truncatella, были описаны зоны с разной плотностью хроматина, причем распределение таких зон в макронуклеусе имеет характерный паттерн для разных стадий клеточного цикла Возможно, что такие зоны являются
аналогами "хромосомных территорий" в ядрах эукариот В связи с этим важно выяснить, как организованы высшие уровни хроматина в макронуклеусах, и как особенности соматических ядер разных инфузорий отражаются на организации хроматина в пространстве макронуклеуса и на работе структурных механизмов
В нашей работе мы исследовали организацию хроматина в соматических ядрах инфузорий Bursana truncatella, Paramecium caudatum и Didimum nasutum на разных стадиях клеточного цикла и в разных функциональных состояниях
Исследования по пространственной организации хроматина в ядре сейчас чаще всего проводятся с использованием конфокальной лазерной микроскопии и флуоресцентных меток Несмотря на впечатляющие возможности такого подхода, он имеет определенные недостатки Процедуры гибридизации in situ очень жесткие, что может приводить к искажениям в распределении ядерного материала, а разрешение конфокального микроскопа значительно меньше, чем в электронной микроскопии Поэтому в данной работе анализ ядерных структур базировался на данных электронной микроскопии В связи с тем, что одиночные срезы не дают полного представления о пространственной организации изучаемых объектов, мы использовали трехмерное моделирование на основе серийных срезов Важным направлением исследований была разработка программного обеспечения и анализ условий, позволяющих получить трехмерные модели (3D модели) структур хроматина с наибольшей точностью
Таким образом, методической особенностью данной работы является комплексный подход, сочетающий (1) электронную микроскопию, обеспечивающую высокое разрешение получаемых изображений, (2) дифференцировку различных структур на ультратонких срезах цитохимическими методами, (3) трехмерную реконструкцию объектов на основе серийных срезов с помощью современных компьютерных методов
В связи с вышеизложенным целью представленной работы было изучение пространственной организации компонентов соматического ядра инфузорий во взаимосвязи с их функциональным состоянием, а также структуры хроматина высших уровней в них путем трехмерной реконструкции на основе серийных срезов
В ходе исследования надо было решить следующие конкретные задачи 1 Определить параметры культивирования и стадии клеточного цикла инфузории В truncatella, на которых картина распределения структур хроматина в макронуклеусе имеет стабильный воспроизводимый характер, сравнить структуру хроматина в разных участках макронуклеуса
Разработать алгоритм для трехмерной реконструкции сложных структур на основе серийных ультратонких срезов, выяснить влияние различных параметров на точность получаемых 3D моделей
Исследовать пространственную организацию хроматина в разных зонах макронуклеуса В truncatella Построить 3D модели структур хроматина в разных зонах макронуклеуса
Сравнить организацию хроматина в макронуклеусах разных видов инфузорий с субхромосомным размером молекул ДНК В ttuiicatella, Р caudatum и D nasutum
5 Изучить на ультратонких срезах динамику процессов декомпактизации
хроматиновых телец при гипотонической обработке и формирования
хромонемоподобных фибрилл в присутствии ионов Mg++ in vitro в
макронуклеусах В truncatella и Р caudatum
Научная новизна работы.
Впервые определена пространственная структура и построены 3D модели организации хроматина в соматических ядрах инфузорий с субхромосомным размером молекул ДНК Для построения 3D моделей разработано программное обеспечение и определены условия и факторы, влияющие на точность построения трехмерных моделей Показано, что при снижении синтеза рРНК в условиях голодания и при переходе к стадии цисты хроматиновые тельца увеличиваются в размере, сближаются и образуют анастомозирующие хромонемоподобные фибриллы толщиной 100-300 нм
Впервые на ультратонких срезах инфузорий В tiuncatella и Р caudatum изучена динамика декомпактизации хроматиновых телец при гипотоническом воздействии, обратимость этого процесса, а также формирование в макронуклеусах инфузорий m vitro хромонемоподобных фибрилл при воздействии бивалентных катионов Полученные данные доказывают, что во всех исследованных видах инфузорий хроматин макронуклеусов организован по хромомерно- хромонемному принципу Практическое значение работы
Полученные данные имеют большое значение для понимания структурных механизмов регуляции экспрессии генома и организации генома в пространстве клеточного ядра Полученные результаты могут быть использованы в работе институтов биологического отделения РАН, в лекционных курсах биологических факультетов высших учебных заведений Разработанное программное обеспечение может быть использовано для построения 3D моделей
структур на основе серийных ультратонких срезов, а в перспективе и для математического моделирования функционирования клеточного ядра Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на XVIII, XIX, XX и XXI Российских конференциях по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000, 2002, 2004 и 2006 г), 2-м Международном симпозиуме "Информационные технологии в исследовании биоразнообразия" (Санкт-Петербург, 2001г), XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Пегербург, 2002г), 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003г), 43-й и 44-й ежегодных конференциях американского общества клеточной биологии (Сан-Франциско, 2003г, Вашингтон, 2004г)
