Введение к работе
I.I. Актуальность проблеш
I.I.I. Структура и функции центросомы - краткий обзор литературных
данных
Центросома - это органелла эукариотической клетки, которой после длительной дискуссии в научной литературе било дано определение "структуры, которая организует клеточ;ше микротруСочки, находится в клетке, как правило, в единственном числе и удваивается в каждом цикле клеточного деления параллельно
УДВОеНИГО Генетического материала" (Paweletz et al., 19S'!. Exp.Cell
pgs., 152: 47-65). Под организацией микротрубочек при ЭТОМ понимают инициация их роста после экспериментального разрушения или при физиологических перестройках цитоскелета в ходе МИТ0ТИЧ8СК0ГО цикла, либо просто тот факт, что значительная часть клеточных микротрубочек сходится к центросоме.
Микротрубочки - наиболее лабильный компонент щітоскелета; они постоянно и с достаточно высокой скоростью разбираются на субъедшшцы - молекули тубу лина - и полимеризуются вновь. Сборка микротрубочек в клетке обычно происходит на специальных структурах. Любые клеточные компоненты, непосредственно инициирующие рост микротрубочек, называют центрами организации
МИКрОТрубОЧеК (ЦиМГ) (Pickett-Heaps. 1969. Cytobios, 1: 257-280).
ЦОМТ часто являются центросомами, однако могут и не бать тлкоиыми. Например, множественные ЦОМТ, евзяэнные с Сазалышми тельцами ресничек мультиресничшх клеток центросомами ке являются.
Структуры, отвечающие определению центросоми, в клетках животных и растений бывают различных типив. У многих зшзиих растений, грибов и простейших животных, тлевших закрытий митоп, это полярные шапочки яли полярные тельца - особые измененный участки ядерной оболочки. У жгутиковых оргаїшзмов это сложный комплекс соединенных коннективами базалышх телец, лежащих р основа?ли жгутиков (Онищенко, 1982.. Успехи совр. Оиол., 94: 360-375). Строение самих базальних телец кино- и стереоцилий очень сходно у всех изученных организмов, от динофлагеллят до млекопитающих. Их основу составляет цилиндр из девяти триплетов микротрубочек, служащих как бы матрицей для образования Э периферических дублетов микротрубочек зксонемц. Связанные же с базальними тельцами коге-гектиьы, сателлиты, корешки и т.п., г,Яыч!:;>
і -
являющиеся ЦОМТ для 'ідтоплазмагических микротру бочек, имеют
значительные ВИДОВЫе ОТЛИЧИЯ (Wheatley, D.N. 1982. "The Centriole: A Central Enigma of Coll Biology." Elsevier, Amsterdam. 232 p.).
Рис.1. Схема строения центросомы клетки позюночных. Ц -центриоли; показаны также микротруСочки, отходящие от различных структур перицентриолярного материала. Размеры центриолей - 0,2 мкм в диаметре и около 0,5 мкм в длину.
В клетках позвоночных животных, на которых в основном выполнено настоящее исследование, центросома (рисі) состоит из центриолей, точно таких же по своей ультраструктуре органелл, что и описанные выше Сазальные тельца жгутиков и ресничек, а также из перицентриолярного материала, от которого непосредственно растут клеточные микротрубочки. в мягких условиях центросома может Сыть выделена из клеток как единое целое. Количество и структура перицентриолярного материала в центросоме меняются в широких пределах в зависимости от физиологического состояния клетки, в частности, в мнтотнческом цикле; ценгриоли же остаются практически
Неизменными (Kurlyaraa, Borisy, 1981. J.Cell Biol., 91: 822-826; Vorobjev. Chentsov, 1982. J.Cell Biol., 93: 938-949; Brown et al.., 1985. Europ. J. Cell Biol., 37: 130-139). ЦвНТрОСОМЭ НаСвКОМЫХ
отличается от Центросомы позюночных некоторыми мелкими деталями ультраструктуры центриолей и перицентриолярного материала.
Показано, что в центросоме всегда находятся минус-концы микротруОочек, а к периферии клетки обращены их шгос-конш
(Heldemann, Mcintosh, 1980. Nature (bond.), 286: 517-51У), И ЧТО
центросома обычно расположена в геометрическом центре клетки
(Euteneur, Schliwa, 1992. J. Cell Biol., 116: 1157-1166). Из ЭТОГО
следует, что если мембранная органелла, передвигающаяся по клеточным микротрубочкам, направляется специфическим транслокатором к минус-концу микротрубочки, то она попадает в центр клетки, а если к плюс-концу - то к плазмалемме. в этом, вероятно,-и состоит биологический смысл і существования во многих клетках центросомы как единственного ЦОМТ.
Микрургическое удаление центросома из клеток не слишком сильно влияет на систему уие существующих микротрубочек. Однако
ОНО ПРИВОДИТ К бЛОКУ МИГОТИЧеСКОГО ЦИКЛа (Maniotis, Schliwa, 1992. Cell, 67: 495-504). ЛОЛаГЭЮТ, ЧТО ЭТО ПРОИСХОДИТ ИЗ-ЗЭ ТОГО, ЧТО В
центросоме аккумулируются клеточные регуляторные белки, в частности, регулируйте события митоза протеинкиназа p34cdc2 и
ЦИКЛИЯ В (Baily et al., 1989. EMBO J., В: 3985т3995). МвхаНИЭЫ И
смысл их аккумуляции в центросоме непонятны. Возможно, что регуляторные белки, которым необходимо взаимодействовать друг с другом, концентрируются у минус-концов микротрубочек, расположенных в центросоме. Таким образом, центросома может содернать молекулярные компоненты, не относящиеся прямо к ее функционированию как ЦОМТ, а компартменгализованные в ней.
I.I.2. Актуальные вопросы в изучении центросомы
Важность центросомы как клеточной органеллы представляется очевидной. Тем не менее, многие вопросы, связанные с ней, остаются открытыми. Так, до сих пор не известен механизм полимеризации на центросома клеточных микротрубочек. Непонятно, и как образуется сама центросома - т.е. совокупность центриолей и перицзнгриолярного материала. Наконец, сложность строения центросош заставляет предполагать, что ее функции полимеризацией шкротрубочек и дает Еошгаргаентализацией регуляторних белков не ограничиваются. Поэтому необходимо исследовзть как возможные клеточные Функции центросош, так и ее структурную организацию на всех уровнях.
Полагают, что поыиио.шкротрубочек, центросома участвует в организации промокуточннх фнламентов клетки. При разрушении учкрогрусо^зк или irp'~ іс!ісїї:22 еэ іслзтісу некоторых кзгсболичзсіси: :їдоз про::з:5'течіі;.;.: Сдх^иїеті: с-;"аз;'::г оосирзкії оісолоядаркп. а^кгзі^ а пооло.о.?:;'.--:; ;;'і:с':-.:іС'-к..: е;-_: гііопь рэедрострэяг.гг:'..' .:""
цитоплазме. Центросома обычно расположена в агрегате, к возможно, что реагрегация промежуточных филаментов связана именно с ней
(Eckert et al., 1982. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 46:
40J-412). Необходимо найти экспериментальные .условия, в которых оОрэзовывался бы небольшой и динамичный агрегат промежуточных филаментов, чтобы проследить, как он будет соотноситься с центросомой.
Центросома, как правило, расположена возле ядра, и б движущихся по субстрату культивируемых клетках, где центросома быстро перемещается вслзд з? активным краем, расстояние между ней и ядром сохраняется минимальным. Это заставляет предположить, что центросома структурно связана с ядром. Ранее было показано
(Botnens, 1977. Nature (bond.), 270: CO-82; Nadezhdina at al., 1979. Europ. J.Cell Biol., 19: 109-115), ЧТО ДЄЙСТВИТЄЛЬНО В
изолированных фракциях клеточных ядер содержатся центросомы, структурно связанные с ядром. Однако остается недоказанным, что эта связь существует и в аивых культивируемых клетках. Непонятно также, какие элементы цигоскелега могут в ней участвовать.
Неясно, к каким последствиям для клетки может привести искусственное смещение- центросомы из геометрического центра, в частности, смещение митотического веретена.
Иногда при терминальной дифференцировке клетки могут утрачивать ценгриоли; например, это происходит с поперечнополосатыми мышечными волокнами. В зрелых мышечных волокнах периценгриолярный материал ассоциируется с ядерной оболочкой, и в этих клетках содержится лишь небольшое количество
МИКрОТрубОЧеК (Connoly et al., 1985. Europ. J.Cell Biol., 39: 341-345). Неясно, как организована центросома (или ЦОЫТ) в клетках, где нет центриолей, но микрогрубочек много, например, в гигантских клетках слинных желез двукрылых насекомых.
Из-за крайне незначительного объема, который центросомы занимают в клетках, и хрупкости перицентриолярного материала их трудно выделить для изучения биохимического состава в виде чистой изолированной фракции в препаративных количествах. Единственная группа исследователей, которым это удалось, показала, что белковый
СОСТаВ ЦентроСОМ Крайне СЛОКеН (Bornens et el., 1987. Cell Motil. Cytoskeleton, i: 238-249). Вероятно. ЧТО раЗЛИЧНЫМ СубСТруКТУРЭМ,
входящим в состав центросомы и центриолярных цилиндров, ДОЛЖНЫ соответствовать различные белки. Поэтому было бы существенно научиться фракционировать центросомы на различные субструктуры,
чтобы в дальнейшем более точно определять принадлежность того или иного белка х той или иной субструктуре. Кроме того, из некоторых экспериментальных данных следует, что в центросоме, помимо белков, может содержаться РНК, играющая структурную роль или даже роль
аВТОНОМНСГО ГеНОМа ЦеНГРИОЛеЙ (Went, 1977. Exp.Cell Res., 108:
63-73). Однако однозначных данных о наличии или отсутствии в составе центросом нуклеиновых кислот нет. Их Сало бы попытзться получить, исследовав ' центросому цитохимическим методом Бернара, который позволяет выявлять НИ на ультратонких срезах.
Функциональным тестом на сохранность центросом при их выделении часто слузит их способность индуцировать поело микроинъекции в ооцит xenopus lasvis пзртеЕогенетическое дробление
(Heidemann, Kircchner, 1975. J.Cell »iol.( 67: 105-117; Xlotz et al., 1990. J.Cell Biol., 110: 405-415). НвСМОТрЯ ИЗ аКТИВНОе
использование этого теста, до сих пор не установлено, что именно происходит с центросомами после их инъекции в ооцит.
Наиболее перспективным методом в изучении белков центросош является метод получения шнеклояальяых антител: можно иммунизировать животных частично очищенным препаратом центросом и затем иметь моноклональные антитела к одному из белков. Существенным здесь является поиск функционально активных белков центросош, особенно участвующих в полимеризации микротрубочек. Антитела к таким белом должны блокировать сборку микротрубочек на центросоме.
1.2. Цель я задачи работы
Целью настоящей работы было исследование структуры, молекулярной композиции и клеточных функций центросомы. В работе были поставлены следущие задачи:
-
Изучить, существует 'Ли структурная связь центросош с Ентерфазным ядром в живых культивируешх клетках. Использовать для этого метод ультрацентрифугирования клеток.
-
Исследовать, как влияет на протекание митоза смещение митотического веретена (в том числе центросом) из центра клеток, вызванное ценгрифугированкем.
-
Еыявить датодом .ультрацентрифугирования в клетках центр организации промежуточных Орнаментов и установить, соответствует ли он по располоаанип в клетке центросоме.
4. Исследовать свойства системы микротрубочек в гигантских клетках
слюнных желез личинок chirononue и выявить структуры, являщиеся Г-
них центрами организации микротрубочек.
-
Изучить устойчивость различных компонентов центриолей и центросом in vitro к экстрагирующим агентам.
-
Цитохимическим методом Бернара исследовать, есть ли в центросомо или в центриолях РНК.
V. Исследовать ультраструктуру цитастеров, образующихся в ооцитах xenopus laevis после. инъекции в них препаратов центриолей или Оазальных телец.
8. Получить панели, моноклональных антител к центросоме культивируемых клеток и использовать полученные антитела для идентификации новых белковых компонентов центросомы, важных для ео функционкровашм.
1.3. Научная новизна работы
В работе впервые продемонстрировано, что в живых культивируемых клетках существует структурная связь центриолей с ядром, которая нарушается при действии цитохалазина В, повреждающего актиновый цитосквлет. Получено уникальное явление блокирования митоза на стадии метафази без разрушения микротрубочек веретена, возникающее при искусственном смещении веретена.
С помощью ультрадантрифугировання живых клеток впервые убедительно показано, что центросома является центром организации не только микротруОочвк, но и црокежуточных фйламентов клетки.
Впервые изучена система мшеротруоочек в гигантских клетках слюнных желез личинок cbironomus и показано, что ати клетки содержат множественные бесцентриоляряне ЦОМТ, часть которых связана с ядерной оболочкой.
ИсследоЕэна устойчивость выделенных центриолей и центросом культивируемых клеток к экстрагирующим воздействиям и впервые установлено, что структурной основой центриолей является их матрикс, а не микротрубочки триплетов.
Впервые показано, что инъецированные в ооцит xenopus laevis экзогенные центриоли замещаются центриолями из собственного материала ооцита. Это меняет существовавшее ранее представление о том, что экзогенные центриоли в яйце только аккумулируют на себе существущий там в диспергированном виде перицентриолярный материал.
Получены уникальные панели моноклональных антител к цитоскелегныи клеточным структурам, в том числе к центросомам.
Выявлены свойства ранее не известного антигена, узнаваемого моноклональными антителами sn-зсв, который располагается п микротрубочках, непосредственно отходящих от центросомы. Обнаружен антиген интерхроматиновых районов клеточного ядра, доступность которого для антител меняется при действии на клетку агентов, разрушающих микротруОочхи, что является первым экспериментальным доказательством существования структурных изменений клеточных ядер в ответ -на изменения, происходящие в цитоскелете. С помощью моноклональных антител rn-cs выявлен высокомолекулярный фосфопротеин и впервые показано, что он участвует в связывании ДНК с ядерным матриксом в ядре и в сборке микротрубочек на центросоме. Эти данные раширяют представления о молекулярном устройстве центросомы и о механизме полимеризации на ней микротрубочек.
1.4. Научно-практическая ценность работы
Данная работа относится к числу фундаментальных научных исследований. Полученные результаты, значительная часть которых является щзинцшшально новой, расширяют представления о биологии клетки и могут быть использованы при написании учебников, в чтении' курсов лекций и разработке новых научно - исследовательских программ. Разработанные методы, в частности, метод ультрацентрифугирования яивых прикрепленных к субстрату клеток или метод выделения базальних телец из молоки рыб, а также полученные даяоклональнне антитела к центросоме,'цитоскелетным структурам и клеточному ядру могут применяться и укв применяются в практической исследовательской работе других лабораторий.
1.5. Алробзвдя работа
Материалы диссертации были представлены на xvl конференции ФЕБО (Москва, 1984), на рабочем совещании по молекулярным аспектам цигоскелэта (Тбилнса, 1987). яз Iv и v Всесоюзных совещаниях и II школе по нэмшечвш формам подвижности (Чернигов, 1984, 1988, Лосево, IS89), на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, IS9I), на х Всесоюзном симпозиуме "Структура я функции клеточного ядра" (Гродно, 1990) и на 12 Европейском рабочей совещании по клеточному ядру (Ле-Дьяблорв, І99Г).
Похожие диссертации на Исследование структурной организации центросомы и ее взаимосвязи с другими клеточными компонентами
