Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 13
3.1. Общая характеристика возбудителей 13
3.1.1. Вид N.meningitidis 14
3.1.2. Серотип b Н.influenzae 15
3.2. Эпидемиология 16
3.2.1. Особенности эпидемиологии менингококковой инфекции 17
3.2.2. Особенности эпидемиологии Hib-менингита 22
3.3. Метод МЛСТ 28
3.3.1. Применение метода МЛСТ для N.meningitidis 33
3.3.2. Применение метода МЛСТ для H.influenzae 34
4. Общая характеристика исследуемого материала 35
4.1. Штаммы Hib 36
4.2. Штаммы N.meningitidis 39
5. Методы исследования 41
5.1. Культивирование H.influenzae и N.meningitidis 41
5.2. Выделение ДНК 41
5.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 42
5.4. Детекция результатов амплификации 44
5.5. Определение нуклеотидной последовательности 45
5.5.1. Очистка продуктов амплификации 45
5.5.2. Секвенирующая амплификация 46
5.5.3. Очистка от не встроившихся дидезоксинуклеотидтрифосфатов 47
5.5.4. Детекция продуктов секвенирования 47
5.6. Программное обеспечение 48
5.7. Использованные инетернет-ресурсы 49
6. Собственные результаты 52
6.1. Предложенные праймеры 52
6.1.1. Праймеры для МЛСТ Hib 53
6.1.2. Праймеры для МЛСТ N.meningitidis 54
6.1.3. Праймеры для субтипирования N.meningitidis 56
6.2. Результаты типирования Hib 57
6.3. Результаты типирования N.meningitidis 59
6.4. Результаты секвенирования, отправленные в базы данных 60
7. Обсуждение результатов 64
7.1. МЛСТ Hib 64
7.1.1. Наблюдаемые аллели и СТ 64
7.1.2. Генетические взаимоотношения российских штаммов Hib 67
7.1.2.1. Результаты анализа методом BURST 68
7.1.2.2. Филогенетическая связь штаммов 71
7.1.3. Генетическая связь с иностранными штаммами 76
7.2. МЛСТ N.meningitidis 87
7.2.1. МЛСТ штаммов N.meningitidis серогруппы А 88
7.2.2. МЛСТ штаммов N.meningitidis серогрупп В, С и W-135 96
7.3. Субтиттроваяие N.meningitidis 102
8. Заключение 111
9. Выводы 124
10. Список литературы 126
- Особенности эпидемиологии менингококковой инфекции
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Результаты секвенирования, отправленные в базы данных
- Генетическая связь с иностранными штаммами
Введение к работе
Бактерии Neisseria meningitidis и Haemophilus influenzae серотипа b (Hib) наряду с Streptococcus pneumoniae являются самыми частыми возбудителями гнойных бактериальных менингитов (ГБМ). Результаты наблюдения за этиологической структурой ГБМ с 1981 по 2002 г. в Москве показывают, что наиболее часто ГБМ вызываются бактериями вида N.meningitidis (64,5%), S.pneumoniae (21,6%) и Hib (8,3%), реже -остальными возбудителями (5,6%) [4]. Качественная этиологическая структура возбудителей ГБМ на территории Москвы в последние годы не изменяется, в то время как количественное соотношение изолированных штаммов, принадлежащих разным возбудителям, может варьировать в зависимости от эпидемической ситуации с менингококковой инфекцией.
Для эффективного эпидемиологического мониторинга ГБМ необходимы данные, позволяющие анализировать популяцию возбудителя [12]. С целью характеристики патогенных штаммов, принадлежащих одному виду (серотипу, серогруппе), применяется широкий спектр микробиологических, биохимических, серологических и молекулярно-биологических методов типирования. Для полноценного и всестороннего наблюдения за эпидемическим процессом необходим инструмент, позволяющий выявлять гипервирулентные штаммы в популяциях патогенных бактерий, отслеживать их распространение и закономерности эволюции. Данные об эволюции и закономерностях распространения патогенных бактерий наиболее информативны, если они получены с помощью методов, позволяющих напрямую измерять генетическую связь между штаммами и оценивать степень филогенетического родства возбудителей, изолированных от разных источников. Охарактеризовать генетические и филогенетические взаимоотношения между штаммами можно с помощью молекулярно-биологических подходов, объектом которых является геном бактерии. Адекватная оценка эволюционных изменений и взаимосвязей в популяции бактерий может быть осуществлена только методами, в основе которых лежит определение нуклеотидной последовательности бактериальной ДНК.
Наиболее впечатляющие результаты по идентификации гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) N.meningitidis и выявлению закономерностей их циркуляции были достигнуты с помощью метода мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) [64]. Метод МЛСТ был впервые применен в 1998 г. На протяжении последних лет МЛСТ активно внедряется в эпидемиологическую практику для типирования многих видов патогенных бактерий. Применение МЛСТ демонстрирует исключительную дискриминирующую способность, результаты МЛСТ часто согласуются с результатами типирования другими методами. МЛСТ имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с серологическими и некоторыми молекулярно-биологическими методами. Основным преимуществом МЛСТ является абсолютная сопоставимость результатов, полученных разными исследователями, а также возможность объединения результатов в глобальную базу данных (БД) с помощью интернета, что существенно облегчает работу эпидемиолога.
Метод МЛСТ позволил значительно расширить представления о клональной структуре бактерий видов N.meningitidis и H.influenzae, сформулированные на основании результатов типирования другими методами.
Применение МЛСТ для N.meningitidis успешно зарекомендовало себя в ряде работ по характеристике и анализу локальных вспышек, эпидемий и пандемий менингококковой инфекции. Было выявлено несколько гипервирулентных клональных комплексов и прослежены закономерности их распространения [19]. На сегодняшний день МЛСТ является наиболее подходящим инструментом для характеристики популяции штаммов N. Meningitidis, слежения за появлением (исчезновением) эпидемически значимых клональных комплексов и проведения глобального эпидемиологического анализа. Сотрудниками ГУ ЦНИИЭ, Института молекулярной генетики (Берлин), и университета Амстердама методом МЛСТ были проанализированы 103 штамма менингококков серогруппы А, выделенных в Москве в 1969-1996 гг., и показано совпадение эпидемического подъема в 1969-1975 гг. и вспышки менингококковой инфекции в 1996 г. с выявлением штаммов N.meningitidis, принадлежащих генетической субгруппе III [21]. На настоящий момент остается актуальным наблюдение за штаммами N.meningitidis серогруппы А и своевременное выявление штаммов, принадлежащих генетической субгруппе III. До настоящего времени не проводилось наблюдение за циркуляцией на территории Москвы гипервирулентных штаммов серогрупп С и W-135, не была проведена характеристика популяции штаммов серогруппы В, которые ответственны за большинство случаев менингококковой инфекции на территории Москвы.
Схема МЛСТ для H.influenzae разработано недавно, результаты применения МЛСТ для H.influenzae демонстрируют возможность детальной характеристики штаммов, принадлежащих разным серотипам, и эпидемиологическую обоснованность применения данного подхода [66]. На сегодняшний день существует возможность сравнительной характеристики российских и зарубежных штаммов Hib. Проведенное в 1999-2001 гг. исследование "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве", впервые позволило достоверно определить заболеваемость Hib менингитами, которая составила 5,7 случаев в год на 100000 детей до 5 лет [9]. Это ниже, чем в большинстве европейских стран (порядка 10-25 случаев на 100000 в аналогичной популяции) и существенно ниже, чем в странах американского континента (порядка 20-50 случаев на 100000) до введения вакцинопрофилактики [26, 81]. Данная ситуация может объясняться особенностями московской популяции, общей эпидемиологической ситуацией на территории или с господством на территории других, отличных от европейских, менее вирулентных штаммов Hib. Отсюда вытекает необходимость прояснения эпидемиологической ситуации с эпидемиологическими особенностями Hib-инфекции в Москве. Для ответа на вопрос о генетической связи российских и зарубежных штаммов целесообразно провести характеристику штаммов Hib методом МЛСТ.
Принципиальным является вопрос об антигенной структуре московской популяции штаммов N.Meningitidis. Предыдущие исследования субтипов N.meningitidis серологическим методом не позволили в полной мере охарактеризовать антигенную структуру менингококков, распространенных на территории Москвы [3], по причине отсутствия у исследователей полного набора моноклональных антител и невозможности дифференцировать эпитопы одного семейства с помощью серосубтипирования. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома бактерии, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты, позволяет избежать сложностей, связанных с типированием серологическим методом. Секвенирование дает возможность однозначно предсказать аминокислотную последовательность и расширить антигенную характеристику штамма за счет характеристики дополнительного эпитопа. Изучение антигенных свойств белков наружной мембраны менингококков может быть использовано в эпидемиологических целях, а так же при конструировании вакцины, что особенно актуально для штаммов N.meningitidis серогруппы В.
2.2. Цель работы
Молекулярно-эпидемиологическое исследование штаммов N.meningitidis и Hib, циркулирующих на территории Москвы, их генетическая характеристика в сопоставлении с зарубежными штаммами.
2.3. Задачи исследования
1. Отработка методик МЛСТ (для N.meningitidis и Hib) и субтипирования (для N.meningitidis) в соответствии с принятыми международными схемами.
2. Характеристика штаммов N.meningitidis и Hib, изолированных от больных ГБМ на территории Москвы с 1984 по 2003 гг. методом МЛСТ.
3. Антигенная характеристика штаммов N.meningitidis на основании секвенирования фрагментов гена рог А; сопоставление результатов генетического субтипирования и МЛСТ.
4. Поиск возможных закономерностей эволюционных изменений московских штаммов N.meningitidis и Hib. Характеристика генетического родства московских штаммов между собой, сравнение их с зарубежными штаммами.
5. Поиск на основании типирования гипервирулентных штаммов (клональных комплексов); оценка эпидемической опасности клональных комплексов N.meningitidis и Hib, распространенных на территории Москвы. 2.4. Научная новизна исследования
Впервые проведена генетическая характеристика московской популяции штаммов N.meningitidis и Hib с помощью не используемого ранее метода МЛСТ.
Результаты проведенного исследования позволяют достоверно оценить степень генетического родства российских и зарубежных штаммов, показать филогенетическую связь возбудителей и уровень генетической изменчивости в популяциях. Сопоставление полученных результатов с данными, содержащимися в международной БД, позволили охарактеризовать штаммы (клональные комплексы), циркулирующие на территории Москвы. Продемонстрирована возможность использования МЛСТ для детальной характеристики популяции возбудителей, принадлежащей одной серогруппе (серотипу). Показана эпидемиологическая обоснованность применения метода МЛСТ для выявления гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) и наблюдения за появлением новых генотипов.
Впервые на основании секвенирования фрагментов гена рогА проведено полное генетическое субтипирование московской популяции штаммов N.meningitidis по трем вариабельным фрагментам в соответствии с международной номенклатурой. Показаны преимущества данного подхода перед традиционным методом серосубтипирования, возможность детальной и расширенной характеристики антигенной структуры вида N. meningitidis.
2.5. Практическая значимость работы
Внедрение в эпидемиологическую практику метода МЛСТ ведет к повышению эффективности эпидемиологического надзора за возбудителями ГБМ. Накопление и интегрирование результатов, полученных методом МЛСТ, обеспечивает углубление и совершенствование знаний о клональной организации, закономерностях циркуляции и эволюции патогенных бактерий. Данные МЛСТ являются основой для разработки новых менее трудоемких и/или более доступных подходов для выявления и отслеживания распространения гипервирулентных штаммов (клональных комплексов) патогенных бактерий, слежения за появлением новых генотипов. Своевременное выявление гипервирулентных штаммов ведет к повышению эффективности эпидемиологического надзора за бактериальными менингитами.
2.6. Внедрение
Результаты диссертационной работы были использованы при принятии решений в период обострения эпидемиологической ситуации с мениногококковой инфекции на территории Москвы в первой половине 2003 г. (приказ Департамента здравоохранения г. Москвы и центра Госсанэпиднадзора в г.Москве от 30.09.03 №585/221 "Об организации проведения профилактических прививок против менингококковой инфекции").
Материалы диссертационной работы использованы в лекционном материале для слушателей Российской академии последипломного образования.
2.7. Апробация работы
Результаты работы были представлены на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-28 марта 2002 г.), 13th International Pathogenic Neisseria conference (Осло, 1-6 сентября, 2002), 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 22-24 октября 2002 г.), 5-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 19-21 октября 2004 г.), 1-й Российской конференции "Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов" (Москва, 16-18 ноября 2004 г.), а также на семинарах научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики заболеваний человека и животных ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (2001-2004 гг.) и ученом совете ГУ ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (4 ноября 2004 г.).
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.
Особенности эпидемиологии менингококковой инфекции
В эпидемический процесс менингококковой инфекции вовлекаются лица всех возрастных групп. Наиболее часто заболевание регистрируется среди детской части популяции, наибольшему риску заболевания подвержены дети до 5 лет [3, 13].
В этиологической структуре гнойных бактериальных менингитов, N.meningitidis занимает первое место в большинстве стран; исключение составляет Япония и некоторые эндемичные районы. По данным И.С.Королевой и соавт. N.meningitidis является этиологическим агентом в 64,5% случаях гнойного бактериального менингита среди жителей Москвы за период наблюдения с 1981 по 2002 гт. [4].
Годовой показатель заболеваемости на 100000 населения генерализованными формами менингококковой инфекцией в годы эпидемического благополучия колеблется от 1-3 случаев в большинстве индустриально развитых стран до 10-25 случаев в развивающихся странах. Во время эпидемий заболеваемость может достигать 500 случаев на 100000 человек, с вовлечением в эпидемический процесс более 1% населения. Наиболее высокие показатели заболеваемости на протяжении всех лет наблюдения за менингококковой инфекции регистрируется в странах "менингитного пояса" (Африка). Показатели летальности сильно варьируют в зависимости от региона и возможности оказания адекватной медицинской помощи. Менингококки чувствительны к широко применяемым антибиотикам и сульфаниламидным препаратам, резистентность отдельных штаммов выражена незначительно, поэтому применение своевременной этиотропной терапии позволяет значительно снизить летальность. Колебания летальности от менингококкового менингита в Москве за последние годы в зависимости от сезона и года находятся в пределах 8-12% [3].
Менингококковую инфекцию отличают колебания годового показателя заболеваемости. Для эпидемического процесса характерно волнообразное течение: чередование подъемов заболевания с годами эпидемиологического благополучия. Выраженные периодические подъемы заболеваемости возникают реже, чем при других респираторных инфекциях. В прошлом веке были зарегистрированы эпидемии менингококковой инфекции на всех континентах, с периодическими подъемами заболеваемости каждые 8-30 лет, в зависимости от региона. Исключением являются страны менингитного пояса, где периоды подъема заболеваемости могут быть значительно меньше. Для эпидемических вспышек менингококковой инфекции характерны сдвиг в сторону взрослой части популяции, преимущественное выделение менингококков одной (ведущей) серогруппы, появление очагов с множественными заболеваниями генерализованными формами в организованных коллективах, снижение летальности [13].
Факторы риска менингококковой инфекции выяснены не до конца. В отдельных случаях показана роль состояния макроорганизма (целостность естественных барьеров, особенности специфического и неспецифического иммунитета), социально-экономических и природных факторов. Эти факторы могут быть ассоциированы с относительными показателями заболеваемости и летальности для конкретной популяции или территории, но не могут объяснить причины волнообразного характера течения эпидемического процесса. Волнообразный характер течения эпидемического процесса и закономерности распространения менингококковой инфекции убедительно объясняется концепцией смены популяции возбудителя на территории в периоды подъема заболеваемости.
Наблюдение за эпидемическим процессом менингококковой инфекции в XX веке позволило проследить ряд закономерностей на основании серогрупповой классификация N.meningitidis. Многолетние исследования по мониторингу популяций менингококков показали, что подъемы заболеваемости в большинстве континентальных стран сопровождаются увеличением выделения штаммов N.meningitidis серогруппы А, значительно реже - серогруппы С. На протяжении эпидемического подъема изменяется соотношение выделяемых штаммов разных серогрупп, но количество штаммов "неэпидемических" серогрупп существенно не изменяется. Штаммы серогрупп В, X, Y и W-135 способны вызывать эпидемические вспышки в изолированных (эндемичных) районах или популяциях. Наблюдение за эпидемическим процессом на территории Москвы во второй половине XX века демонстрирует связь эпидемического подъема заболеваемости с долей выделяемых штаммов серогруппы А [3].
Корреляция между серогруппой преобладающих на определенной территории штаммов и показателем заболеваемости в некоторых случаях может быть использована для перспективного анализа и планирования вакцинопрофилактических мероприятий. Серогрупповая характеристика бактерий вида N.meningitidis не позволяет следить за появлением и циркуляцией гипервирулентных штаммов (клональных комплексов): штаммы патогенных серогрупп изолируются независимо от интенсивности эпидемического процесса, изменяется только их соотношение. Для слежения за появлением и распространением эпидемически значимых клональных комплексов используют методы типирования, обладающие большей дискриминирующей способностью, способные выделять группы штаммов с повышенной вирулентностью. Серологические методы определения серотипов, субтипов и иммунотипов не всегда подходят для слежения за изменением популяции возбудителя, поскольку поверхностные антигены бактерии могут быстро изменяться под давлением популяционного иммунитета. Не всегда есть зависимость между принадлежностью бактерии к конкретному гипервирулентному клону и ее антигенной структурой. Кроме этого, появление штаммов с измененными антигенными свойствами часто не удается обнаружить известными (доступными) антителами.
Популяция N.meningitidis была исследована широким спектром молекулярно-биологических методов в работах по анализу спорадической заболеваемости и эпидемических вспышек на конкретных территориях. Был проведен ряд исследований по сравнению различных подходов типирования и сопоставлению полученных результатов. Результаты применения молекулярно-биологических методов типирования свидетельствуют о том, что популяция штаммов N.meningitidis крайне неоднородна, за большую часть заболеваний ответственно незначительное число клональных комплексов. Несмотря на все многообразие применяемых молекулярно-биологических методов, далеко не все из них способны однозначно выделить группы гипервирулентных штаммов (эпидемические клональные комплексы) и пригодны для глобального мониторинга эпидемически значимых клональных комплексов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Детекция продуктов секвенирования проводилась в автоматическом режиме методом капиллярного электрофореза на приборах ABI Prism 310 Genetic Analyzer и ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). В использованных приборах предусмотрено применение двух типов капилляров для проведения электрофореза. Для детекции продуктов секвенирования всех МЛСТ-локусов были использованы длинные капилляры, рассчитанные на чтение фрагментов длиной 600-650 п.о. Короткие капилляры (300-350 п.о.) были использованы для чтения вариабельных участков гена рог А.
Перед электрофорезом проводилась предварительная подготовка очищенного осадка. Осадок растворялся в 25 мкл буфера для электрофореза, денатурировался при 95С в течение трех минут и охлаждался на льду.
Результат электрофореза регистрируется в виде хроматограммы, на которой каждому пику флуоресценции определенного цвета соответствует один из четырех нуклеотидов. Первичную последовательность ДНК определяют по порядку расположения пиков. После компьютерной обработки полученных данных с помощью программы Chromas 1.55 хроматограмма имеет вид, пригодный для анализа полученной последовательности.
Для выбора праймеров, работы с нуклеотидными последовательностями, обработки данных, анализа и визуализации результатов в данной работе были использованы следующие программные средства.
Конструирование и вычисление температуры плавления праймеров проводилось с помощью программ Oligo 4.0 и Primer Premier 5.00. Обработка первичных данных секвенирования и редактирование хроматограмм осуществлялось программой Chromas версия 1.55 или 2.21. Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей выполнялось программами EditSeq 4.03, SeqMan II 4.03 (модули пакета DNAStar) и BioEdit 5.0.6. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводилось программой ClustalX 1.8 и системой для работы с интернет-БД GenBank (NCBI) Blast [22, 23]. На различных этапах работы для редактирования данных секвенирования, объединения нуклеотидных последовательностей в базы данных по исследуемым фрагментам, выравнивания и прикидочной оценки филогенетического родства отдельных аллелей были использованы широкие возможности соответствующих приложений пакета Vector NTI6.
Анализ сиквенс-типов и построение филогенетических деревьев по принципу МЛСТ сделаны с помощью программы START 0.9.0 [56] по алгоритму UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages). Построение филогенетических деревьев на основе анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводилось программой Mega 2.1 [60, 61], построение сплит-графов (бескорневых деревьев) - программой Splits Tree 3.1 [55]. Для перевода данных из формата MEGA в nexus-формат применялась программа Splits Tree File Editor 1.0.3.
Для редактирования и отправки нуклеотидных последовательностей впервые обнаруженных аллелей в базу данных GenBank была использована программа Sequin 3.32.
Выбор и анализ специфичности использованных праймеров проводился на основании нуклеотидных последовательностей, представленных в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.govA. Последовательности некоторых аллелей, впервые полученные при выполнении данной работы, были отосланы в эту же БД.
Общая информация о подходе МЛСТ, методики для обработки данных и часть программного обеспечения были взяты с главного интернет-портала, посвященного МЛСТ http://www.mlst.net/. Присвоение номеров аллелей полученным нуклеотидным последовательностям, определение СТ и клональных комплексов (для N. meningitidis), сравнение полученных данных с уже имеющимися, было реализовано через интернет-ресурсы http://haemophilus.mlst.net/ и http://pubmlst.org/neisseria/ для Hib и N.meningitidis, соответственно. Указанные интернет-ресурсы позволяют осуществлять доступ к открытым международным БД по МЛСТ исследуемых микроорганизмов. По мере накопления данных, БД по МЛСТ обновляются. Для характеристики изучаемых штаммов в данной работе использовались только те данные, которые были доступны на завершающем этапе исследования (февраль-апрель 2004 г.).
БД для Hib содержит данные МЛСТ бактерий вида Н. influenzae всех серотипов, а также данные типирования бескапсульных штаммов. На момент обработки данных, БД для Н. influenzae содержала 163 штамма, из них 57 штаммов принадлежали серотипу Ь, этому количеству соответствовало 14 вариантов СТ.
Использованная БД для менингококков объединяет данные МЛСТ некоторых других представителей рода Neisseria {N.lactamica, N. gonorrhoeae, Ncinerea). На момент исследования, эта БД содержала 4905 изолятов, соответствующих 3462 СТ, из них 4663 изолята принадлежали бактериям вида N. meningitidis (соответствуют 3222 СТ).
В работе использован алгоритм обработки данных МЛСТ BURST (Based Upon Related Sequence Types) и его on-line версия eBURST [47], доступная через инетернет-сайт http://eburst.mlst.net/loci.asp.
Идентификация и присвоение номеров вариабельным участкам VR1 и VR2 белка Рог А N.meningitidis проводилась согласно общепринятой номенклатуре через интернет-сайт http://neisseria.org/nm/tvping/pora/. Идентификация и обозначение эпитопа VR3 была сделана "вручную" при помощи вышеописанных программных средств для редактирования нуклеотидных последовательностей, в соответствии с опубликованной Clarke и соавт. [32] номенклатурой, представленной также на интернет-сайте http://www.show.scot.nhs.uk/smprl/pora.html. Все интернет-БД по современным схемам типирования N.meningitidis доступны через основной инетрнет-ресурс, посвященный типированию менингококков http://neisseria.org/nm/.
Результаты секвенирования, отправленные в базы данных
На основании происхождения исследуемых штаммов материала, исследуемую совокупность штаммов целесообразно разбить на 3 группы. Первая группа (выборка 1) включает все типированные штаммы. Вторая группа (выборка 2) состоит из штаммов, изолированных на территории Москвы. Третья группа (выборка 3) включает только те московские штаммы, которые изолированы в период с 1997 по 2002 гг. Как видно из таблицы 12, СТ-6 встречается у большинства исследованных штаммов (22), что составляет 45% штаммов для всей выборки и 48% - выборки, состоящей только из московских штаммов. Остальные СТ в рассматриваемых группах наблюдаются у нескольких штаммов или встречаются в единичном случае. Наиболее репрезентативной можно считать выборку 3, составленную только из московских штаммов, изолированных в относительно короткий период времени (1997-2002). Большинство (36, 90%) московских штаммов выборки 3 принадлежат четырем СТ, остальные 4 СТ встречаются в единичных случаях. На основании имеющихся данных, не удалось выявить какие-либо характерные клинико-эпидемиологических особенности штаммов, имеющих отличный от 6-го СТ, за исключением СТ-93 (будет объяснено ниже).
Для всех выборок характерно присутствие однократно встречающихся СТ. Выбороки 2 и 3 отличаются меньшим разнообразием СТ, что вероятно связано с эпидемиологическими особенностями включенных в них штаммов. Возможные объяснения присутствия штаммов, имеющих неповторимый СТ, следующие: СТ-81 выявлен у штамма из Екатеринбурга, т.е. территории, представленной в данном исследовании только двумя штаммами; СТ-110 обнаружен у штамма, изолированного в 1984 г. Для штамма с СТ-94 (Москва, 1999 г.) никаких эпидемиологических особенностей выявить не удалось.
Были рассмотрены генетические взаимоотношения между изученными штаммами Hib и связь российских штаммов с штаммами H.influenzae, типированными за рубежом. Данные секвенирования обрабатывались двумя способами: методами кластерного анализа, принятыми для описания данных МЛСТ, и методами оценки филогенетического родства штаммов, основанными на сопоставлении секвенированных участков генома.
Наиболее распространенными и наглядными подходами для обработки данных МЛСТ являются алгоритмы BURST и UPGMA. Оба алгоритма оценивают генетическое расстояние между штаммами по матрице попарных расстояний, построенной на основании аллельных профилей. Генетическое расстояние между штаммами с одинаковым аллельным профилем равно 0; между штаммами с отличными СТ -генетическое расстояние равно количеству несовпадений в аллельных профилях. В данном случае генетическое расстояние между штаммами принимает значения от 0 до 7.
Результаты МЛСТ, обработанные по этим алгоритмам, представляются в виде связанных между собой кластеров (клональных комплексов). Визуально генетические взаимоотношения штаммов представляются в виде рисунка, изображающего взаимоотношения штаммов внутри клонального комплекса (алгоритм BURST), или генетического дерева (алгоритм UPGMA). Для эпидемиологически "ограниченной" выборки (штаммы, изолированные на одной территории в один и тот же период времени у "однородной" популяции) "близкородственных" штаммов, наиболее удобным и наглядным методом является BURST. При оценке и визуализации генетических взаимоотношений большой выборки эпидемиологически неоднородных штаммов целесообразнее использовать метод UPGMA.
На основании исходной эпидемиологической характеристики выбранных для исследования штаммов с целью оценки генетической связи по результатам типирования был выбран алгоритм кластеризации BURST. Принцип кластеризации BURST заключается в объединении в один клональный комплекс штаммов, имеющих ограниченное количество несовпадений в аллельных профилях. В данном случае (для семи локусов), в клональный комплекс объединяются штаммы, отличающиеся друг от друга не более чем по двум локусам. Данный подход обеспечивает включение штамма только в один клональный комплекс. В качестве центрального СТ, в алгоритме кластеризации BURST выбирается СТ, объединяющий в один клональный комплекс максимальное количество штаммов, отличающихся от него не более чем по одному локусу [47]. Этот СТ в терминологии BURST обозначается как "центральный" (founding genotype), а комплекс штаммов, отличающихся от него не более чем по одному локусу будем называть "ядром" клонального комплекса.
При изучении взаимоотношений российских штаммов методом кластеризации BURST выяснилось, что исследуемые штаммы разбиваются на два клональных комплекса. Первый клональный комплекс (клональный комплекс СТ-6) объединяет 47 (96%) штаммов, распределенных по девяти СТ (см. рис. 2). Второй клональный комплекс (клональный комплекс СТ-93) включает 2 штамма с одинаковыми СТ.
Наиболее распространенным СТ среди изучаемых штаммов является СТ-6, образующий ядро первого клонального комплекса. Остальные СТ встречаются менее часто (см. табл. 12), но подавляющее большинство всех обнаруженных СТ образуют один клональный комплекс. Ядро первого клонального комплекса включает 5 СТ, отличающиеся от основного (СТ-6) не более чем по одному локусу (СТ-78, 81, 92, 94, 95). Из 27 штаммов, имеющих отличный от СТ-6 СТ, ядро первого клонального комплекса образует 18 (37%) штаммов.
Клональный комплекс СТ-6 объединяет штаммы, изолированные в нескольких регионах РФ в течении двух временных периодов (1984 г. и 1997-2002 гг.). Из 6 штаммов, изолированных в 1984 году, 5 принадлежат этому клональному комплексу, из них 3 штамма принадлежат СТ-79 и по одному СТ-95 и СТ-110. СТ-95 и 79 обнаружены у двух московских штаммов, изолированных в 2001 и 1999 годах. Ограниченность выборки штаммов, выделенных в 1984 году, не позволяет с уверенностью выделить преобладающий СТ у штаммов, циркулирующих на территории Москвы в 1984 году и направление его генетических изменений. Тем не менее, поскольку эти штаммы принадлежат одному клональному комплексу, логично предположить, что штаммы, циркулирующие на территории Москвы, с 1984 года не претерпели существенных генетических изменений. Отсутствие в 1984 году штаммов с СТ-6 и принадлежность трех (из шести) штаммов к СТ-79, позволяют предположить тенденцию к смене доминирующих СТ внутри одного клонального комплекса, у штаммов, изолированных в разные временные периоды на одной территории.
Генетическая связь с иностранными штаммами
Бескапсульные и капсульные штаммы имеют разную клональную организацию. Для бескапсульных штаммов характерно наибольшее разнообразие СТ и клональных комплексов, для них не удается выявить закономерности клональной организации, что согласуется с данными, полученными ранее [75, 83]. Для штаммов серготипов с, d, е и f характерно образование единственного клонального комплекса: ветви D/E, Blf/Blg, F/G и K/L, соответственно. Подобная клональная организация штаммов этих серотипов была показана ранее другими методами типирования: МЛЭЭ и методом гель-электрофореза в пульсирующем поле [74, 76]. Штаммы серотипа а образуют 4 клональных комплекса: II, HI, В2 и В4. Штаммы серотипа b распределяются по двум клональным комплексам А1/А2 и Bib, за исключением СТ-61 (клональный комплекс J3).
Интенсивные исследования по типированию H.influenzae методом МЛЭЭ, показали что большинство изолятов Hib, выделенных от больных с генерализованной формой инфекции, принадлежат только трем клональным комплексам (Ala, А2а и Bib) и 70% штаммов Hib, изолированных на протяжении более 20 лет в различных регионах мира распределены только по четырем электрофоретипам (клонам) внутри этих трех клональных комплексов [74, 76, 77]. Согласно данным типирования методом МЛЭЭ, кластер А1/А2 объединяет 90% штаммов Hib, изолированных от больных с генерализованной формой НіЬ-инфекции, большинство остальных штамов входят в клональный комплекс В1 [74]. Применение метода МЛСТ для капсульных штаммов H.influenzae выявило те же клональные комплексы, что и МЛЭЭ, и позволило более детально охарактеризовать штаммы, принадлежащие этим клональным комплексам [66]. Из рисунка 6 следует разделение всех СТ, обнаруженных у штаммов Hib, на три группы. Все типированные на момент исследования штаммы Hib, за исключением штамма с СТ-61 (изолирован в США, 1947 г.), распределены между двумя клональными комплексами. Как было показано в выше (см. раздел "Генетические взаимоотношения российских штаммов Hib"), на основании генетического расстояния между аллельными профилями, оцененного по алгоритму BURST, исследованные российские штаммы Hib, аналогично зарубежным распределены по двум клональным комплексам. Выделеенным нами с помощью алгоритма BURST первому и второму клональным комплексам соответствуют отмеченные иностранными авторами клональные комплексы А1/А2 и Bib, соответственно. Клональные комплексы А1/А2 и Bib объединяют штаммы, принадлежащие только серотипу Ь, они заметно сепарированы от штаммов других серотипов и бескапсульных штаммов.
Филогенетический анализ на основании совокупности всех нуклеотидных последовательностей для каждого СТ H.influenzae, представленный в работе E.Meats и соавт. [66] четко демонстрирует разделение штаммов Hib на 2 клональныех комплекса, включающие те же СТ. Генетическое расстояние между обоими клональными комплексами Hib относительно других клональных комплексов, оцененное на основании расстояния между нуклеотидными последовательностями, оказывается меньше, чем при кластеризации аллельных профилей по алгоритму UPGMA [66]. В данной работе взаимоотношения российских и зарубежных штаммов оценены только на основании несовпадений в аллельных профилях, филогенетический анализ на основании нуклеотидных последовательностей не проводился, поскольку нам не удалось выделить новые клональные комплексы Hib, и однозначно показана принадлежность всех СТ, наблюдаемых у российских штаммов к уже описанным клональным комплексам. Большинство (7) СТ, обнаруженных у российских штаммов можно объединить ветвью "R" (см. рис. 6). Клональный комплекс R помимо российских штаммов включает 3 иностранных штамма, которым соответствуют следующие СТ: СТ-24 (Швеция, 1985 г.), СТ-55 (США, 1984 г.) и СТ-83 (Чехия, 2001 г.). Доступные на момент исследования эпидемиологические данные об иностранных штаммах Hib клонального комплекса А1/А2 отличаются достаточно большим временным и географическим разнообразием (см. интернет-БД). На момент исследования было типировано 53 иностранных штамма Hib этого клонального комплекса, которым соответствовало 12 СТ (включая 3 отмеченных). Клональный комплекс Bib, помимо двух российских штаммов (СТ-93), включает 3 штамма с СТ-45 (США 1999-2000 гг.) и один штамм с СТ-50 (Кения, 1980-е г.). На основании представленной в БД информации, не удается показать какие-либо закономерности циркуляции штаммов Hib и выявить эпидемически значимые СТ.
В целом, клональное распределение российских штаммов Hib повторяет структуру клональных комплексов Hib, показанную при типировании выборки большего объема зарубежными коллегами [66]. Несмотря на типичную для штаммов Hib клональную организацию, 9 из 10 СТ, выявленных у российских штаммов уникальны (см. выше), что говорит об эпидемиологических особенностях штаммов Hib, циркулирующих в нашей стране, а также демонстрирует высокую дискриминирующую способность метода МЛСТ.
На основании данных о заболеваемости и сопоставлении результатов МЛСТ московских штаммов с зарубежными, можно отметить некоторые аспекты эпидемиологи Hib-менингитов в Москве. В исследовании "Эпидемиологический, на популяционной основе, надзор за Hib-менингитами у детей до 5-летнего возраста в Москве", проведенном в ГУ ЦНИИ эпидемиологии (1999-2001 гг.) при поддержке Всемирной Организации Здравоохранения, была впервые достоверно определена заболеваемость Hib-менингитами, которая составила 5,7 случаев в год на 100000 детей до 5 лет [9]. Это ниже, чем в большинстве европейских стран (порядка 10-25 случаев на 100000 в аналогичной популяции) и существенно ниже, чем в странах американского континента (порядка 20-50 случаев на 100000) до введения вакцинопрофилактики [26, 81]. Более низкую заболеваемость вряд ли можно объяснить циркуляцией на территории Москвы отличных от европейских и американских, менее вирулентных штаммов Hib, поскольку большинство (48%) московских штаммов принадлежат СТ-6, так же обнаруженному у штаммов, изолированных в Европе и США. Остальные СТ, наблюдаемые у московских штаммов, генетически очень близки к СТ-6: из 8 СТ, наблюдаемых у штаммов выборки 3, 5 входят в клональный комплекс R. Штаммы, входящие в клональный комплекс СТ-6, и имеющие отличный от него СТ составляют 37,5%. Невысокая заболеваемость Hib-менингитами на территории Москвы скорее всего связана с социально-биологическими и эпидемиологическими особенностями московской популяции.
