Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эпидемиология оппортунистических инфекций и представление о вторичных иммунодефицитах (обзор литературы) 12
1.1. Эпидемиология актуальных оппортунистических инфекций 12
1.1.1. Герпетическая инфекция 14
1.1.2. Инфекция, вызываемая вирусом Эпштейна-Барр 17
1.1.3.Цитомегаловирусная инфекция 21
1.1 АТоксоплазмоз 23
1.2. Вторичные иммунодефициты (ВИД) 26
1.3.Эпидемиологический надзор за вторичными иммунодефицитами и оппортунистическими инфекциями 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Общая характеристика 33
2.2. Эпидемиологические исследования... 36
2.3. Лабораторные исследования 38
2.4. Статистические методы обработки результатов исследования 40
Глава 3. Эпидемиологическая и клинико - иммунологическая характеристика оппортунистических инфекций у пациентов с лимфаденопатиями 66
3.1. Этиологическая структура 45
3.2. Токсоплазмоз с синдромом лимфаденопатий у детей 57
3.3. Иммуноблот в комплексной диагностике токсоплазмоза 61
ГЛАВА 4. Клинико-иммунологическая характеристика пациентов с герпесвирусными инфекциями
4.1. Иммунологическая характеристика пациентов с герпетической инфекцией различной локализации 66
4.2. Изменение показателей иммунного статуса у пациентов с рецидивирующей герпетической инфекцией на фоне лечения Кагоцелом 85
4.3. Патогенетическая роль и клинико-иммунологическая значимость ВЭБ инфекции в формировании патологии у лиц молодого возраста 90
Глава 5. Совершенствование системы эпидемиологического надзора за оппортунистическими инфекциями на модели герпесвирусных инфекций 98
5.1. Цитомегаловирусная инфекция 99
5.2. Герпетическая инфекция (ВПГ-инфекция) 105
5.3. Эпштейна-Барр-вирусная инфекция (ВЭБ-инфекция)
5.4. Информационная подсистема 114
Заключение 117
Выводы 124
Список литературы
- Инфекция, вызываемая вирусом Эпштейна-Барр
- Эпидемиологические исследования...
- Токсоплазмоз с синдромом лимфаденопатий у детей
- Изменение показателей иммунного статуса у пациентов с рецидивирующей герпетической инфекцией на фоне лечения Кагоцелом
Введение к работе
Актуальность исследования. Неблагоприятная экологическая обстановка, снижение уровня социальной защиты, снижение иммунорезистентности в популяции, рост вторичных иммунодефицитов, в том числе ВИЧ-инфекции, способствуют росту оппортунистических инфекций (Прозоровский СВ., Тартаковский И.С., 1998; Покровский В.В., Каражас Н.В., 1998; Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г., 2003; Nissapatorn V., 2008). Среди оппортунистических инфекций важное патогенетическое значение имеют герпесвирусные инфекции, среди которых изучены цитомегаловирусная инфекция (ЦМВ-инфекция) и герпетическая инфекция, возбудителем которой является вирус герпеса человека 1 и 2 типов - ВПГ-1 и 2 (Исаков В.А., 2006; Волков А.Г., 2007; Калугина М.Ю., Бошьян Р.Е., Каражас Н.В. и др., 2007; Орджоникидзе Н.В., 2008; Kimberlin D.W., 2009) и токсоплазмоз (Гончаров Д.Б., 2005, 2006; Freeman К., Tan Н.К., Prasa A. et al. , 2008; Rodrigues I.M., Castro A.M. et al., 2009). В последние годы изучается вклад и других вирусов семейства Herpesviridae в индукции патологии: вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и вируса герпеса человека 6 типа (ВГЧ-6) (Калугина М.Ю., Каражас Н.В., Козина В.И. и др., 2009). На фоне сниженной иммунорезистентности герпесвирусные инфекции могут формировать тяжелую патологию различных органов и систем, приводить к инвалидности и летальному исходу (Лобзин Ю.В., 2001; Ермак Т.Н., Аляева М.Д., Шахгильдян В.И., Груздев Б.М., 2004; Андреева Е.И., 2006; Дудина К.Р., 2007; Pistorius L.R., 2008). Одним из наиболее распространенных синдромов инфекционного генеза являются лимфаденопатии. Однако эпидемиологические аспекты данного синдрома с этиологической верификацией в литературных данных не представлены.
Ранее проведенными исследованиями в Омской области установлена распространенность вирусов простого герпеса 1 и 2 типов - ВПГ-1,2 и цитомегаловируса - ЦМВ и показана их важное патогенетическое значение (Долгих Т.И., 2000; Гашина Е.А., 2003; Запарий Н.С., 2006). Публикации последних лет свидетельствуют о важной роли вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в формировании патологии в различных возрастных группах (И.В. Шестакова, 2010). Вместе с тем, эпидемиологические исследования в России по изучению распространенности этого вируса носят фрагментарный характер (Калугина М.Ю., Каражас Н.В., Козина В.И. и др., 2009).
В Сибири подобные исследования ранее не проводились, и отсутствие научных данных по данной проблеме снижает эффективность действующей системы эпидемиологического надзора за герпесвирусными инфекциями. Учитывая широкую распространенность и разнообразие клинических форм герпесвирусных инфекций, которое связывают с персистенцией вирусов, возникает необходимость установления активности инфекционного процесса
для адекватной терапии. Однако до настоящего времени лабораторные маркеры активности инфекции находятся в стадии поиска и уточнения их значимости.
Вышеизложенное послужило основанием для настоящих исследований с целью повышения эффективности системы эпидемиологического надзора за оппортунистическими инфекциями.
Цель исследования. Усовершенствование системы эпидемиологического надзора за оппортунистическими инфекциями в группах высокого риска на основе этиологической расшифровки и изучения иммунологических аспектов данной патологии.
Задачи исследования:
-
Представить эпидемиологическую характеристику лимфаденопатий на основе этиологической верификации и оценить роль герпесвирусов и токсоплазм в развитии данного синдрома.
-
Дать клинико-иммунологическую характеристику герпесвирусных инфекций у лиц групп высокого риска.
-
Изучить частоту инфицирования вирусом Эпштейна-Барр населения Омской области и определить его значимость в формировании патологии у лиц молодого возраста.
-
Разработать предложения по совершенствованию системы эпидемиологического надзора за оппортунистическими инфекциями в группах высокого риска.
Научная новизна. Эпидемиологическое изучение лимфаденопатий инфекционного генеза позволило установить ведущую роль герпесвирусов (вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус, вирус герпеса человека 6 типа, вируса простого герпеса 1 и 2 типов) в развитии данного синдрома. Показано, что герпетическая инфекция при наличии вторичного иммунодефицита протекает в виде микст-инфекции с активацией вируса простого герпеса 1 и 2 типов и цитомегаловируса (в 75% случаев) или вируса простого герпеса 1 и 2 типов и вируса Эпштейна-Барр (в 25% случаев), характеризуется повышением уровня маркера ранней активации Т-лимфоцитов - CD3+/CD25+ и резким снижением уровня Т-лимфоцитов, несущих маркеры апоптоза - CD3+/CD95+. Впервые изучена инфицированность населения Омской области ВЭБ и доказана его роль в формировании патологии гепатобилиарной системы и мозга у лиц молодого возраста, а также в индуцировании гибели плода. Новизна заключается в углублении знаний об иммунных механизмах развития герпесвирусных инфекций, выявление особенностей современных тенденций формирования эпидемического процесса, в том числе при микст-инфекциях.
Теоретическое и практическое значение работы. Рациональный подход к диагностике, основанный на выявление маркеров активности инфекции (ДНК или антигенов вирусов, IgM, IgA) в группах высокого риска позволит своевременно верифицировать диагноз и провести адекватные лечебно-профилактические мероприятия. Разработана методологическая основа для
совершенствования системы эпидемиологического надзора за оппортунистическими инфекциями в группах высокого риска. При герпесвирусных инфекциях целесообразно проводить иммунологический мониторинг на основе изучения уровня маркера ранней активации Т-лимфоцитов - CD3+/CD25+ и уровня Т-лимфоцитов, несущих маркеры апоптоза - CD3+/CD95+.
По результатам исследований подготовлены методические рекомендации:
1. «Герпесвирусные инфекции и перинатальная патология (клинико-
лабораторный мониторинг, прогнозирование риска)» регионального
уровня реализации (Омск, 2011);
2. «Стратификация риска развития внутриутробной инфекции» (Омск,
2011).
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований используются в деятельности Инфекционной клинической больницы №1 им. Д.М. Далматова, в Академическом центре лабораторной диагностики, в учебном процессе кафедры эпидемиологии, кафедры инфекционных болезней, пропедевтики детских болезней и поликлинической педиатрии, акушерства и гинекологии № 2 ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научной конференции молодых ученых и студентов Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» (г. Омск, октябрь 2009 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (г. Красноярск, март 2010 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Высокие технологии» (г. Москва, март 2011 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (г. Абакан, апрель 2011 г.); на XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге» (г. Санкт - Петербург, май 2011 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных положений диссертации.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах текста компьютерного набора, содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, иллюстрирована 13 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 159 источников на русском языке и 50 иностранных источников. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Омской государственной медицинской академии, номер государственной регистрации 0120.1151566.
Инфекция, вызываемая вирусом Эпштейна-Барр
В настоящее время большую медицинскую проблему представляют вялотекущие хронические воспалительные процессы, ассоциированные с персистенцией инфекционных агентов вирусной природы [40]. Герпетическая инфекция занимает одно из первых мест [3, 31, 90, 188], а вирус простого герпеса - наиболее типичный представитель семейства герпесвирусов [123, 149], имеющих широкое распространение: до 80-90% взрослого населения в популяции имеют антитела [40, 79, 191, 200].
Рост числа заболеваемости ВПГ связан с увеличением частоты иммунодефицитных состояний [78,123]. Рецидивы герпеса встречаются у 2-15% больных, у онкологических больных и пациентов старше 50 лет - в 50%, при СПИДе - в 100% случаев. Считают, что на территории России различными формами герпетической инфекции ежегодно страдают около 20 млн человек [56]. По данным ВОЗ, смертность от герпетической инфекции среди вирусных заболеваний находится на втором месте (15,8%) после гриппа (35,8%), что выдвигает герпетические инфекции в число первоочередных проблем 21 века [30, 49, 63, 70, 187]. Иммунные механизмы контролируют репродукцию ВПГ и обеспечивают его сохранение в организме человека в латентном состоянии [130]. Чем больше выражен иммунодефицит, тем тяжелее протекает болезнь: с генерализацией процесса, поражением ЦНС, легких, печени и других органов. Активация вируса из латентного состояния происходит под влиянием различных факторов: травматических, психогенных, гормональных [58, 195].
Секреция ВПГ продолжается значительное время при первичном инфицировании (ДНК выявляется в плазме в течение 4-6 недель), а при рецидивах вирус секретируется не более 10 дней. Формирование противогерпетического иммунитета происходит как при манифестном, так и при бессимптомном течении инфекции [207]. При первом контакте антигенов с клетками иммунной системы в течение 14-28 дней формируется первичный иммунный ответ, который у иммунокомпетентных лиц проявляется образованием интерферонов, выработкой специфических антител (IgM с последующим переключением на синтез IgA и IgG) и повышением активности естественных «киллеров» - NK-клеток и формированием мощного пула высокоспециализированных киллеров. В случае реактивации или реинфекции возникает повторный контакт клеток иммунной системы с антигеном, образуются антитела и Т-киллеры. Реактивация сопровождается продукцией ВПГ-IgM (редко и даже при наличии типичных высыпаний), ВПГ-IgA (чаще) и IgG. Особенностью иммунного ответа при данной инфекции является то, что иммунная система реагирует только на свободные вирусные частицы или антигенные детерминанты (внеклеточное расположение), а на «латентные» вирусы, локализованных в нервных клетках ганглиев и фагоцитах, реакции иммунной системы не наблюдается [24].
Поражение иммунокомпетентных клеток вирусом приводит к развитию вторичного иммунодефицита и создает условия для рецидивов болезни [23, 25]. Клинические проявления герпетической инфекции отличаются значительным разнообразием, чаще всего у лиц с иммунодефицитными состояниями встречаются атипичные формы герпеса: отечная, зостериформный герпес, язвенно-некротическая, геморрагическая, геморрагически-некротическая формы; герпетиформная экзема Капоши.
ВПГ в подавляющем большинстве случаев передается во время родов ( 90%) или в постнатальном периоде (5-10%) [20, 33, 129]. Сама беременность может быть причиной повышения титров антител к ВПГ, что повышает риск активизации самого вируса [77, 204]. Ряд авторов полагает, что активизация ВПГ представляет большую опасность для беременных, чем ЦМВ [14, 83, 140, 172]. В этиологической структуре инфекционной патологии перинатальных потерь ВПГ составляет 38,7% [118]. При беременности в связи с подавлением клеточного иммунитета возможна диссеминация вируса, происходящая как восходящим, так и гематогенным путем [56, 94, 96, 97, 209]. Инфицирование беременных женщин генитальным герпесом регистрируется в 2 раза чаще, чем у небеременных женщин репродуктивного возраста [126]. Риск передачи инфекции повышается до 50%, если первичный генитальный герпес у матери развивается в конце третьего триместра беременности или во время родов [69, 71]. Опубликованы данные о частоте обнаружения ВПГ и ЦМВ в эякуляте мужчин с нарушением фертильности, а также о влиянии вирусного инфицирования на основные показатели спермы [148].
Вирус также способствует развитию рака шейки матки и рака предстательной железы [121, 152]. Считается, что в этом случае ВПГ может выступать в качестве кофактора канцерогенеза, инициируя развитие дисплазии и поддерживая ее в состоянии стабилизации. Вирусы герпеса индуцируют процессы атеросклероза, где ВПГ выступает в ассоциации с ЦМВИ [56].
Установлено, что вирус простого герпеса является кофактором прогрессирования ВИЧ - инфекции и СПИДа и одной из СПИД- индикаторных инфекций. ВПГ может активировать геном вируса иммунодефицита человека, находящийся в стадии провируса [56, 104]. Геном ВПГ, с одной стороны, может интегрироваться с генами других вирусов (включая ВИЧ), вызывая их активацию, а с другой стороны, возможен его переход в активное состояние на фоне развития других вирусных и бактериальных инфекций.
При типичных клинических проявлениях диагноз герпетической инфекции трудностей не представляет, а при атипичных формах возникают большие сложности. Диагноз в таких случаях верифицируется на основании результатов лабораторных исследований. Активация инфекционного процесса при герпетической инфекции даже при наличии клинических проявлений в стадии обострения редко сопровождается выработкой IgM-ВПГ (чаще - при первичной инфекции либо реинфекции), но чаще при этом запускается продукция IgA к ВПГ [41].
Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) - лимфотропный вирус человека, особенностью которого является способность вызывать не гибель клеток, в которых происходит его репродукция, а, напротив, их патологическую пролиферацию. ВЭБ является представителем онкогенных ДНК-содержащих вирусов. Уровень инфицированности ВЭБ зависит от географической зоны и совокупности ряда социально-экономических факторов. По данным различных авторов, до 80-90% населения земного шара инфицировано ВЭБ [133, 164]. До 60% заболевших инфекционным мононуклеозом - это лица в возрасте 2-20 лет [53, 146]. Эпидемиологическое значение ВЭБ определяется широкой циркуляцией вируса среди населения. В мире ежегодно заражаются от 16 до 800, а в России 40-80 человек на 100 000 населения [101]. После первичного инфицирования вирус Эпштейна—Барр остается в организме пожизненно. 15-25% здоровых ВЭБ-позитивных взрослых выделяют вирус из ротоглотки [141]. Поскольку манифестные формы встречаются относительно редко, сложилось ошибочное мнение о невысокой заболеваемости и контагиозности ВЭБ-инфекции.
Вирус обладает тропизмом к В-лимфоцитам и способен к длительной персистенции в них, может инфицировать клетки эпителия рото- и носоглотки, низкодифференцированные клетки эпителия канальцев слюнных желез и тимуса, поражать моноциты периферической крови [156]. Его геном обнаруживается и в Т-лимфоцитах со способностью клеток к экспрессии ранних и мембранных антигенов. В процессе репродукции вируса синтезируются мембранные антигены (МА) и ядерные антигены (EBNA). Последние защищают копии генома вируса от деградации в клетке [62]. Отличием ВЭБ от других герпесвирусов является его способность вызывать не цитолиз, а размножение пораженных клеток В-лимфоцитов [88]. При этом формируется латентная инфекция, при которой в некоторых клетках макроорганизма пожизненно персистирует геном ВЭБ, а инфекционный характер вирус приобретает в периоды реактивации. Специфическое связывание вируса с мембраной клетки происходит посредством рецептора CD21+. Данный гликопротеид является еще и рецептором к СЗ 1-компоненту комплимента [72].
Эпидемиологические исследования...
С целью оценки иммунореактивности к различным возбудителям, для верификации диагноза, установления активности инфекционного процесса и выявления характера иммунной дисфункции были применены стандартизированные методики, представленные в табл. 2 и табл. 3.
Для установления активности герпесвирусной инфекции и токсоплазмоза применялся прямой метод диагностики - выявление антигенов в лейкоцитах крови по наличию «ранних белков» вирусов в РИФ и детекция ДНК методом ГШР. С целью оценки специфического иммунитета наряду с IgM определяли антитела класса IgA к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов в сыворотке крови с использованием метода твердофазного ИФА. Для установления (или исключения) первичной инфекции определяли низкоавидные «ранние» специфические антитела класса IgG в сыворотке крови с помощью тест-систем производства ЗАО «Лабдиагностика» (г. Москва) и фирмы «Euroimmun» (Германия). Авидность выражали в соответствии с прилагаемой к тест-системам инструкцией как индекс авидности (ИА) в процентном отношении. Учет осуществляли на ридерах при длине волны 492-405 нм в зависимости от наборов.
В качестве подтверждающего метода для исключения неспецифического результата тестирования сыворотки крови методом ИФА в положительных случаях и при получении неопределенных результатов использовали метод Western-blot - стриповое иммуноисследование с антигенами, произведенными рекомбинантной техникой для детекции IgM, IgG, IgA - антител против ВПГ 1, 2 и ВЭБ, ЦМВ, Т. gondii. Набор содержит тестовые стрипы с электрофоретическими разделенными экстрактами антигенов.
Для оценки иммунного статуса изучались количественные и функциональные показатели клеточного, гуморального и фагоцитарного звеньев иммунитета, проводилась оценка системы комплемента и интерфероновой системы с определением уровня IFN-a, IFN-y (спонтанного и стимулированного ФГА) методом ИФА. Функциональную активность нейтрофилов оценивали по величине фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и индекса завершенности фагоцитоза со стафилококком. Активность фагоцитов определяли также с помощью проточной цитометрии - по уровню экспрессии HLA-DR на С014+-клетках. Определение уровня основных классов иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG проводили с использованием наборов «Orion Diagnostica» (Финляндия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями на иммунохимическом анализаторе белков «TURBOX PLUS». Циркулирующие иммунные комплексы выявляли методом селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 3,5%-м растворе полиэтиленгликоля с последующим фотометрическим определением плотности преципитата.
При обследовании пациентов с лимфаденопатией в качестве дополнительного лабораторного теста проводилось определение специфических антител класса IgA, IgG, IgM (тест-системы «PATHOZYME ТВ COMPLEX PLUS» и «PATHOZYME MYCO IgA, IgG и IgM»; производство компании «OMEGA DIAGNOSTICS LTD.», Великобритания). Бактериологические исследования проводили с использованием стандартных методов.
Показатели общего анализа крови оценивали на гематологическом анализаторе «EXCELL-22». Иммунофенотипирование лимфоцитов крови проводили методом проточной цитофлюориметрии на приборе «CYTOMICS FC-500». Методом проточной цитометрии с автоматической пробоподготовкой образцов на станции «TQ-Prep» определяли субпопуляционный состав лимфоцитов по маркерам клеточной дифференцировки (CD3+, CD3+/CD4 , CD3+/CD8+, CD20+/CD19+, CD16+/CD56+, CD3+HLA-DR+, CD3CD16+/56+, CD3+CD16+/56+, CD3+/CD25+, CD3+/CD95+, CD19+/CD5+, CD4+/CD25+, CD3+/CD50+, CD14+HLA-DR+) с использованием коммерческих моноклональных антител производства компании «Beckman Coulter» (США). Для более полной и объективной оценки клеточного звена иммунитета рассчитывали величину иммунорегуляторного индекса (ИРИ = CD4+/CD8+) и лейкоцитарно-Т-лимфоцитарного индекса (лТл-индекс-лейкоциты/СОЗ ) [84].
На следующем этапе работы было проведено проспективное когортное рандомизированное исследование, в которое были включены 23 пациента (18 женщин и 5 мужчин) в возрасте от 17 до 49 лет (средний возраст 28,9 ± 7,8 лет) с верифицированным диагнозом герпетической инфекции с проявлениями лабиального герпеса (п=8) и генитального герпеса (п=15) с давностью заболевания от 1 года до 14 лет. Для устранения нарушений в интерфероновой системе у данных пациентов и целесообразности назначения кагоцела (ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», Россия; per. уд. P/N 002027/01 от 19.11 2007) была проведена описательная статистика параметров, характеризующих иммунный статус пациентов с герпетической инфекцией с анализом распределения признаков, и с помощью корреляционного анализа установлены взаимосвязи между показателями иммунитета и клинической картиной.
Критерии включения: а) пациенты в возрасте от 16 лет до 52 лет с диагнозами: герпетическая инфекция, ЦМВИ и токсоплазмоз, в том числе в сочетании с хламидиозом; б) согласие пациента на обследование и лечение. Критерии исключения из исследования: а) возраст пациентов до 16 лет; б) тяжелая соматическая патология; в) злоупотребление алкоголем; г) наркотическая зависимость; д) отказ от участия в предлагаемом обследовании.
Полученные в работе данные обработаны с помощью общепринятых в медико-биологических исследованиях методов системного анализа с использованием программ "Microsoft Excel" и "Statistica 6.0", согласно современным требованиям к проведению анализа медицинских данных. Для статистической обработки использовали также программу первичной обработки и анализа данных "R_MED", которая написана на языке программирования свободно распространяемого программного продукта R (R Development Core Team (2010). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org/) и адаптирована для статистического анализа клинико-лабораторных данных, а также для решения задачи прогнозирования риска развития патологии с построением в итоге «дерева решений» (Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2011614225, программа для ЭВМ «Статистический анализ клинико-лабораторных данных для прогнозирования риска развития патологии»).
Нормальность распределения показателей определяли с помощью одновыборочного критерия Колмогорова - Смирнова [13]. Полученные данные представлены в виде М ± s, где М - это среднее значение, s - стандартное отклонение (при нормальном распределении) или с указанием медианы (Р50) и верхнего (Р75) и нижнего квартилей (Р25) (при распределении, отличном от нормального) [27]. Для выявления статистических различий между двумя выборками использовали U-критерий Манна-Уитни. Различия величин признавали статистически достоверными при уровне значимости р 0,05. Для сравнения качественных показателей использовали %2 и точный критерий Фишера. Корреляционный анализ данных проводили с помощью определения коэффициента корреляции Спирмена и коэффициента Гамма (Gamma, G) [116, 144].
Таким образом, мы считаем, что сформулированный нами комплексный подход с учетом современных методов исследования позволил нам решить поставленные задачи и оптимизировать диагностику и лечение герпесвирусных инфекций у пациентов с вторичными иммунодефицитами.
Токсоплазмоз с синдромом лимфаденопатий у детей
Следующий фрагмент исследований по токсоплазмозу был посвящен анализу результатов применения подтверждающего теста - Westernblot при положительных и неопределенных результатах ИФА [32], поскольку ИФА, направленный на выявление антител, мог давать ложноположительный результат. Это было необходимо для принятия решения о проведения специфической и иммуномодулирующей терапии. С этой целью обследовано 415 пациентов, из них 280 женщин (67%) и 135 мужчин (33%). Средний возраст составил 34,6 ± 9,9 лет. При обращении выявлялись симптомы длительной интоксикации: слабость (83%), быстрая утомляемость (81%), головная боль (45%), миалгии (43%), артралгии (57%). Лимфаденопатия наблюдалась в 45% случаев, а субфебрилитет встречался у 53% обследованных.
Результаты иммуноблота подтвердили наличие специфических антител у 266 человек (в 64,1% случаев). При этом отмечалось сочетание IgG+ IgM - у 49 человек (11,8%), IgG+IgA - у 21 человека (5,1%), а одновременный синтез TOKco-IgG+ IgM+ IgA - у 11 человек (2,6%). Наличие IgA было подтверждено у 50 пациентов (12,0%), а токсо- - у 68 человек (16,4%), причем изолированно IgM встречались у 4 больных (1%), a IgA - у 14 больных (3,4%). Это подтверждает наше мнение о необходимости включения в диагностический алгоритм трех тестов: IgM, IgA и IgG.
Поскольку тест на IgM может давать ложноположительный результат в ИФА (чаще - у беременных и лиц с аутоиммунной патологией) за счет перекрестного реагирования, а для адекватной терапии необходимо определить фазу инфекции, то образцы крови 75 пациентов были протестированы в иммуноблоте для выявления антител к отдельным белкам T.gondii. Результаты показали (табл. 5), что наиболее часто встречались белки ROPIH rSAGl. Аналогичные данные получены и при тестировании сыворотки крови от 53 пациентов этим методом на IgA и от 250 больных - на IgG. Таблица 5
Комплексная оценка данных показала, что у пациентов с отрицательным результатом обследования методом ПЦР выявлено присутствие IgG ко всем белкам: ROP1, MAGI, rSAGl, GRA7, GRA8, что свидетельствовало о возможной реактивации токсоплазмоза, и наличие токсо- IgA подтверждало (либо исключало) активность процесса. У двух пациентов с детектированной ДНК T.gondii присутствовал полный комплекс белков: IgM к белкам ROP1, MAGI, rSAGl; IgA к белку rSAGl; IgG к белкам ROP1, MAGI, rSAGl, GRA7, GRA8. У одного пациента при отрицательном результате на наличие ДНК одновременно обнаружены IgG к белкам ROP1, MAGI, rSAGl, GRA7, GRA8; IgM к белкам ROP1, rSAGl, GRA7, GRA8; IgA к белку ROP1, MAGI, GRA7.
Для оценки значимости того или иного белка нами проведены клинико-лабораторные параллели. Наличие IgM к белку ROP1 наиболее часто сочеталась с лихорадкой, при сочетании же с IgG к белкам ROP1, MAG1, rSAGl, GRA7 характерными проявлениями явились слабость, головная боль, жжение в глазах. Интерес и тот факт, что наличие миалгий и артралгий у пациентов характеризовалось обнаружением в сыворотке крови полного комплекса белков IgG, что подтверждало реактивацию токсоплазмоза.
Резюме. Использование современных методов лабораторной диагностики позволяет установить этиологию до 88% лимфаденопатий инфекционного генеза. Лимфаденопатия зачастую является проявлением инфекционного заболевания вирусной или паразитарной природы, которое может протекать как в виде моно-, так и микст-инфекции, при которой происходит вовлечение в патологический процесс различных органов и систем в зависимости от ассоциации возбудителей и выраженности иммунодефицита. Установленные различия в частоте клинических форм у детей и взрослых при лимфаденопатиях следует учитывать при разработке алгоритма обследования пациентов с данным синдромом с целью верификации диагноза и установления факторов риска развития патологии.
Использование современных методов лабораторной диагностики позволяет проводить эффективный мониторинг врожденного и приобретенного токсоплазмоза, при этом показано важное значение прямых методов - ГЩР и РИФ и серологических (ИФА для выявления IgA к T.gondii). IgM однозначно является важным маркером острой (первичной) инфекции, однако его определение в динамике при врожденной форме и при хронической форме приобретенного токсоплазмоза с целью установления активности инфекционного процесса имеет низкую эффективность, дополнительным серологическим маркером активности следует рассматривать IgA. Использование иммуноблота (в варианте лайн-блота) целесообразно для подтверждения диагноза, в том числе при исследовании ликвора. В случае серопозитивности по отношению к токсоплазмам для подтверждения (исключения) поражения мозга паразитарной природы приоритетным является исследование ликвора с целью выявления ДНК или антигенов («ранних белков») возбудителя, IgA. Установлена важная роль вирусно-паразитарной микст-инфекции (токсоплазмоз и ЦМВИ) в развитии патологии у детей (с преимущественным поражением ЦНС и органа зрения), особенно при врожденном токсоплазмозе, что обосновывает необходимость проведения тестов, направленных на выявление маркеров активности ЦМВИ (ДНК, антигены CMV и CMV- IgA). Выявленные различия в частоте клинических форм при врожденном и приобретенном токсоплазмозе, в том числе при сочетанном инфицировании T.gondii и CMV следует учитывать при разработке алгоритма обследования пациентов с токсоплазмозом для установления факторов риска развития сопутствующей патологии. Все вышеперечисленное подтверждает целесообразность определения фазы инфекционного процесса с использованием современных методов лабораторной диагностики, в том числе и иммуноблота. Несмотря на высокую стоимость, использование в диагностическом алгоритме Westemblot вполне оправдано, поскольку результаты определяют проведение дальнейшей этиотропной терапии.
Изменение показателей иммунного статуса у пациентов с рецидивирующей герпетической инфекцией на фоне лечения Кагоцелом
Выявленная диссоциация функционирования систем неспецифической резистентности, естественной цитотоксичности и интерфероногенеза, обусловливающая, по-видимому, известные трудности в поиске рациональных подходов к коррекции иммунодефицита, по результатам проведенного исследования наиболее выражена у больных герпесом генитальной локализации и офтальмогерпесом. В свою очередь наблюдаемый дисбаланс компонентов иммунной системы приводит к дальнейшему прогрессированию и развитию рецидивирующих форм герпеса.
Известно, что ведущая роль в формировании противовирусного иммунитета принадлежит клеточным механизмам защиты при их взаимодействии с гуморальными факторами [8, 107]. Именно состояние Т-клеточного звена, играющего ключевую роль в формировании противогерпетического иммунитета, и эффективность межклеточного взаимодействия во многом определяют частоту, степень выраженности и продолжительность рецидивов инфекции [85, 106]. Качество иммунного ответа непосредственно связано с активностью различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, а их определение позволит проводить оценку способности иммунной системы отвечать на антигенную стимуляцию инфекции [179].
В настоящее время до конца не изучен иммунопатогенез герпесвирусных инфекций. Для изучения иммунофенотипа лимфоцитов у пациентов с микст-инфекцией, вызванной вирусами семейства Herpesviridae, более углубленно на наличие микст-инфекции обследованы 32 человека с хронической инфекцией, вызванной вирусами герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1/2) в сочетании с цитомегаловирусом (ЦМВ) или вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ). Средний возраст пациентов составил 31,9 ± 12,2 лет. Длительность заболевания колебалась от 1 года до 14 лет, средняя длительность заболевания составила 6,1 ± 3,6. У всех пациентов имела место вирусная микст-инфекция в фазе активации вируса, доказанной с использованием комплекса прямых (полимеразная цепная реакция, реакция иммунофлюоресценции) и непрямых (иммуноферментный анализ, иммуноблот) лабораторных методов. Преимущественно наблюдалось сочетание инфекций, вызванных ВПГ-1/2 и ЦМВ - в 24 случаях (75%), ВПГ-1/2 и ВЭБ - в 8 случаях (25%). В дальнейшем для оценки влияния микст-инфекции на формирование иммунного ответа все пациенты, включенные в исследование, были разделены на две группы. В IA группу вошли пациенты с герпетической инфекцией, сочетающейся с ЦМВ-инфекцией, в ІБ группу - пациенты с герпетической инфекцией в сочетании с ВЭБ - инфекцией. II группу (контроль) составили 40 практически здоровых людей, сопоставимых по возрасту и полу.
При анализе клинических данных показано наличие у пациентов следующих клинических проявлений: лабиальный герпес (41%), генитальный герпес (23%), офтальмогерпес (33%), сиаладенит (37%), лимфаденопатия (83%) и субфебрилитет (78%). У включенных в исследование больных герпетическая инфекция протекала в виде легкой и среднетяжелой формы с частотой рецидивирования от 4 до 8 раз в год (в среднем 6,2 ±1,5 раз в год). Результаты сравнительного исследования относительного содержания субпопуляций иммунокомпетентных клеток у пациентов в сравнении с контролем представлены в табл. 8. У больных с герпесвирусными инфекциями было выявлено высокое содержание CD3+- лимфоцитов, при этом имело место статистически значимое повышение процентного числа CD4+- клеток по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров. В тоже время количество лимфоцитов с цитотоксической активностью (CD8+) и В-клеток (CD20+) не отличалось от показателей в контрольной группе. Показано достоверное увеличение процентного содержания исследуемых субпопуляций NK-клеток (CD16+/CD56+, CD3"CD16+/56+) и увеличение числа маркера ранней активации Т-лимфоцитов - CD3+/CD25+ на фоне уменьшения CD3+/CD95+T-клеток (рис. 14, рис. 15). При сравнительном анализе количества CD4+/CD25+ достоверных различий не установлено.
При обследовании мы не получили отличий процентного числа CD3+/CD50+ (ICAM-3) и CD19+/CD5+ от контрольных значений. Но следует отметить, что результаты проведенного исследования позволили выявить положительную корреляционную связь средней силы между процентным содержанием лимфоцитов и CD19+/CD5+ (г=0,52, р=0,05), а также CD20+/CD19+ и CD19+/CD5+ (г=0,57, р=0,03). В тоже время наблюдалась отрицательная корреляция между возрастом и процентным содержанием CD19+/CD5+ (г=-0,59, р=0,02). Так, с увеличением возраста пациентов отмечалось более низкое содержание CD19+/CD5 . Интересен и тот факт, что у пациентов с микст-инфекцией, вызванной вирусами семейства Herpesviridae, снижение количества моноцитов и повышение уровня CD3+/CD50+ коррелировали между собой (г=-0,51, р=0,04). Отмечена тенденция к снижению по сравнению с контрольными значениями процентного содержания CD14+HLA-DR+, являющимся одним из основных маркеров миелоидных клеток. Снижение экспрессии CD 14 сопровождалось повышением экспрессии CD 16 с последующим приобретением моноцитами свойств тканевых макрофагов с выраженной провоспалительной активностью, что является характерным в фазу репликации вируса. Процентное содержание CD14+HLA-DR+ отчетливо коррелировало с количеством лимфоцитов (г=0,54, р=0,05), моноцитов (г=0,56, р=0,04), а также с уровнем CD3+CD16+/56+ (г=0,54, р=0,05).
