Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Адаптивный потенциал и стратегии его реализации в популяциях насекомых 19
1.1 Адаптивный потенциал особи и популяции. Оценка адаптивного потенциала 20
1.2 Стратегии реализации адаптивного потенциала. Адаптациогенез и его пусковые механизмы 20
1.3 Адаптации насекомых к различным стрессогенным воздействиям 30
1.4. Виды полиморфизма и их значение в процессах адаптациогенеза. Уровень полиморфизма как отражение адаптивного потенциала популяции 54;
1.5. Проблема выбора маркерных характеристик для оценки адаптивного потенциала. Реактивность и устойчивость, показатели их уровня... 62
1.6. Стресс-реакция и ее физиолого-биохимические параметры у насекомых 71
Результаты исследований 94
ГЛАВА 2. Объекты, методы и материалы исследований 94
2.1. Характеристика биологических объектов исследований 94
2.1.1. Медоносная пчела (Hymenoptera, Apidae: Apis mellifera L.) 94
2.1.2. Комнатная муха (Diptera, Muscidae: Musca domestica L.) 95
2.1.3. Колорадский жук (Coleoptera, Chrysomelidae: Leptinotarsa decemlineata Say) 96
2.2. Проведение экспериментов с воздействием стрессоров различного типа 98
2.2.1. Тепловой стресс 98
2.2.2. Холодовой стресе 98
2.2.3. Интоксикация 99
2.2.4.Старвация 100
2.2.5. Травма 100
2.2.6. Токсический стресе, вызванный бактериальным препаратом 101
2.3. Методика оценки адаптогенных эффектов биологически активных веществ 101
2.3.1. Оценка адаптогенных эффектов биосила 102
2.3.2. Оценка адаптогенных эффектов аскорбиновой кислоты 103
2.3.3. Оценка эффектов дисадаптантов 103
2.3.4. Отдаленный эффект действия биологически активных веществ (БАВ) 104-
2.4. Методика измерения фенолоксидазной активности 105
2.4.1. Измерение ДОФА-оксидазной активности 105
2.4.2.Мето дика электрофоретического изучения активности фенолоксидазы 106
2.5. Определение уровня содержания катехоламинов 108
2.6. Определение активности сериновых протеиназ и их ингибиторов... 108
2.7. Определение активности неспецифических эстераз, кислой и щелочной
фосфатазы 109
2.8. Методика определения концентрации белка ПО
2.9. Методы селекции лабораторных популяций комнатной мухи 110
2.10. Методы оценки уровня устойчивости в лабораторных популяциях комнатной мухи 111
2.11. Методы оценки биотического потенциала линий комнатной мухи. 113
2.12. Методы оценки популяционного полиморфизма колорадского.жука 114
2.12.1. Анализ фенетического полиморфизма 114
2.12.2. Анализ полиморфизма по уровню чувствительности к инсектицидам 115
2.13. Методы молекулярно-генетических исследований 116
2.13.1. Сбор, хранение и подготовка биоматериала 116
2.13.2. Выделение ДНК 117
2.13.3. Проведение ПЦР-амплификации ДНК 117
2.13.4. Определение содержания мРНК гена профенолоксидазы и генов антибактериальных пептидов у медоносной пчелы и комнатной мухи 118
2.13.5. Анализ полиморфизма локуса 980A>G гена ацетилхолинэстеразы (AChE) колорадского жука 121
2.14. Математическая обработка результатов 124
ГЛАВА 3. Физиолого-биохимические характеристики - стресс-реакции у насекомых 126
3.1. Изменения жизнеспособности насекомых при стрессах 126
3.2. Изменения локомоторной активности насекомых в ходе стресс-реакции 140
3.3. Динамика активности ферментов фенолоксидазнои системы в ходе стресс-реакции 147
3.4. Изменения транскрипционной активности генов профенолоксидазы у комнатной мухи и медоносной пчелы и антибактериальных пептидов медоносной пчелы при стрессах 157
3.5. Модели развития стресс-реакции при действии одного и нескольких стрессоров 166
3.6. Роль стресса и стресс-реакции в онтогенезе насекомых 175
ГЛАВА 4. Особенности стресс-реакции, связанные с процессами интродукции и внутривидовой гибридизации в семьях медоносной пчелы на территории республики башкортостан 188
4.1. Генетический внутривидовой полиморфизм Apis mellifera L. на территории Башкортостана 190
4.2. Особенности стресс-реакции в интродуцируемых семьях Apis mellifera 192
4.3. Особенности стресс-реакции в гибридных семьях Apis mellifera... 211
ГЛАВА 5. Модели формирования устойчивости к стрессогенным воздействиям в лабораторных линиях комнатной мухи 218
5.1. Выявление фенотипической структуры исходной лабораторной линии 219
5.2. Результаты селекции на устойчивость к разнотипным стрессогенным воздействиям 224-
5.3. Изменения активности фенолоксидазной и гидролазной систем, сопровождающие формирование устойчивости к стрессам 240
5.4. Изменения демографических характеристик в селектируемых линиях комнатной мухи 243
5.5. Динамика фенотипической структуры лабораторных линий в процессе формирования устойчивости 250
ГЛАВА 6. Генетический и фенотипическии полиморфизм в популяциях leptinotarsa decemlineata say на территории республики башкортостан и реализация адаптивного потенциала вида 256
6.1. Формирование популяции Leptinotarsa decemlineata Say на территории Башкортостана и эколого-климатические адаптации вида к
региональным условиям Предуралья Башкирии 256
6.2. Формирование резистентности к инсектицидам в локальных популяциях вида 262
6.3. Генетический и фенотипический полиморфизм в популяциях колорадского жука 269
6.4. Экспансия вида как выражение стресс-индуцируемых эволюционных процессов 299
Заключение 305
Выводы 307
Список литературы
- Стратегии реализации адаптивного потенциала. Адаптациогенез и его пусковые механизмы
- Проведение экспериментов с воздействием стрессоров различного типа
- Изменения локомоторной активности насекомых в ходе стресс-реакции
- Особенности стресс-реакции в интродуцируемых семьях Apis mellifera
Введение к работе
Актуальность проблемы. В основе биологического разнообразия, характеризующего благополучие живого мира, лежит генетический полиморфизм - необходимое условие сохранения обилия видов и базис микроэволюционных процессов (Лобашев, Инге-Вечтомов, 1976; Тимофеев-Ресовский и др., 1977; Снегин, 2007).
Изменения природной среды, носящие как эколого-климатический, так и антропогенный характер, предъявляют повышенные требования к способности видов, составляющих виды популяций и индивидов приспосабливаться к новым условиям, а также сохранять и расширять границы ареалов (Сергиевский, 1985; Васильев, Васильева, 2005). Эта способность определена как адаптивный или биоэкологический (Завадский, 1968) потенциал.
От адекватности способов оценки адаптивного потенциала зависит точность и своевременность прогнозов - как долгосрочных, определяющих направленность микроэволюционных процессов, так и краткосрочных, позволяющих оценить сиюминутное состояние популяции и принять решение о мерах воздействия (Яблоков, 1987). Актуальность исследований в области прогноза состояния популяций очевидна. На сегодняшний день недостаточность методологии стала причиной непредсказуемости темпов расселения ряда видов-инвадеров, к которым относят американскую белую бабочку, вредную черепашку и колорадского жука (Reznick, Ghalambor, 2001; Lee, 2002; Павлюшин и др., 2005; Фасулати, 2005). Не соответствуют прогнозам скорости формирования резистентности к средствам контроля численности в популяциях вредителей (Сухорученко, 2005), а также падения численности во многих аборигенных и эндемичных популяциях, к числу которых принадлежит и популяция среднерусской расы медоносной пчелы на территории Башкортостана (Косарев, 2006).
Адаптивный потенциал как сумма возможностей приспособления, заложенная в генофонде популяции и геноме особи, реализуется в ходе формирования онтогенетических адаптации (Уоддингтон, 1970; Васильев, 2007). Генетический полиморфизм обеспечивает многообразие путей адаптациогенеза, обуславливая полиморфизм адаптационный, или функциональный (Лобашев, Инге-Вечтомов, 1976).
Быстрое развитие молекулярно-генетических методов позволяет ускорить исследования генетического полиморфизма, однако для исчерпывающей оценки адаптивного потенциала этого недостаточно. Требуется комплексный подход, сочетающий современные методы и многосторонний анализ динамики жизненных показателей на клеточном, организменном и популяционном уровнях (Сергиевский, 1987; Шишкин, 1988; Васильев, 2008). Адекватной моделью в исследованиях, связанных с оценкой адаптивного потенциала, может стать стресс-реакция, в ходе которой максимально реализуются потенции, как особи, так и сообществ
разного уровня. Представители различных отрядов класса насекомых, отличающегося широкой экологической пластичностью, соответствуют требованиям к объектам в подобных исследованиях.
Учение о стрессе и адаптационном синдроме было создано в середине прошлого века (Селье, 1961); представление о стресс-реакции было сформулировано несколько позднее (Горизонтов, 1973; Погодаев, 1976), причем неоднократно повторялось, что эта реакция развивается как цепь событий, опосредованных гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системой. Отсутствие такой системы у насекомых считалось априорно доказательством невозможности развития стресс-реакции по типу теплокровных (Косицкий, 1970). Тем не менее, доказательств развития стресса у насекомых получено достаточно (Лухтанов, 1985; Черныш, 1985; Раушенбах, 1990). Выявлены механизмы генетического контроля отдельных звеньев стресс-реакции (Раушенбах, 1997; Раушенбах и др., 2000; Ченцова и др., 2007). В работах лаборатории И.Ю. Раушенбах также исследовано место стресс-реакции в процессах онтогенеза и адаптациогенеза; определены основные маркерные характеристики стресс-реакции у дрозофилы. Исследовалась и связь стресс-реакции с отдельными видами полиморфизма в природных популяциях D. melanogaster. Однако экономически значимые виды насекомых, к тому же принадлежащие к нескольким отрядам, до сих пор не становились объектами исследований такого рода.
Демографические показатели, считающиеся достоверными характеристиками искусственных популяций (Монастырский, Горбатовский, 1991; Злотий, Головко, 1998), позволяют на ряде последовательных поколений сделать заключение о роли отдельных регулируемых факторов в динамике состояния искусственной популяции и предположить, какое значение могут иметь изменения эколого-климатического и антропогенного характера в жизни природных популяций. Однако, только исследования изменений границ ареала, динамики структуры природных популяций дают окончательный ответ на вопросы, связанные с прогнозом их состояния. Сочетание методов оценки реакции на воздействия на уровне популяций, субпопуляционных групп, индивидуальных организмов и суборганизменных систем представляется наиболее перспективным подходом.
Цель работы:
Выяснение роли стресс-реакции насекомых (медоносной пчелы Apis mellifera L., комнатной мухи Musca domestica L., колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say) в реализации адаптивного потенциала особи и популяции.
Задачи исследования:
1) исследование закономерностей проявления стресс-реакции у
насекомых при стрессах различной природы и модальности;
2) установление онтогенетических закономерностей проявления и
развития стресс-реакции у насекомых с полным типом превращения и
последствий перенесенных стрессов;
-
характеристика фаз развития стресс-реакции и ее особенности при воздействии нескольких стрессоров;
-
изучение модулирующего влияния биологически активных веществ на развитие стресс-реакции и последствия стрессов у насекомых;
-
выявление особенностей развития стресс-реакции у генетически различающихся внутривидовых групп Apis mellifera L. в условиях зоны гибридизации интродуцируемых групп с аборигенными семьями Apis mellifera mellifera;
-
анализ изменений структуры лабораторных популяций Musca domestica L. при стрессовых воздействиях и исследование процессов адаптациогенеза при селекции на устойчивость к стрессам;
-
выяснение роли стресс-реакции в проявлении полиморфизма в популяциях Leptinotarsa decemlineata Say на Южном Урале.
Научная новизна результатов исследований
Впервые проведены комплексные исследования развития стресс-реакции на видах насекомых, ранее не исследованных в данном аспекте. На примерах комнатной мухи, колорадского жука и медоносной пчелы показан универсальный фазовый характер стресс-реакции насекомых и сложная структура стадии реакции тревоги.
Выявлено стимулирующее действие (эффекты гормезиса) инсектицидов в летальных (диагностических) дозировках, проявляющееся в локальных популяциях L. decemlineata с высокой частотой встречаемости резистентных генотипов.
Впервые на примере A. mellifera и М. domestica показано изменение уровня транскрипционной активности генов профенолоксидазы и антибактериальных пептидов при стрессах различной природы.
Впервые установлена согласованность динамики активности отдельных компонентов фенолоксидазной системы в онтогенезе комнатной мухи и колорадского жука. Обнаружено соответствие динамики активности ферментов фенолоксидазной системы насекомых чередованию фаз стресс-реакции.
Показана возможность использования характеристик фаз развития стресс-реакции насекомых для оценки состояния семей медоносной пчелы.
Впервые выявлено закономерное снижение уровня
внутрипопуляционного полиморфизма с последующим его восстановлением в ряду поколений в популяциях, подвергающихся неблагоприятным воздействиям в условиях эксперимента. Продемонстрировано различие в процессах формирования адаптации в лабораторных популяциях М. domestica к стрессогенным воздействиям в зависимости от характера и длительности воздействия стрессоров.
Впервые установлено наличие дифференциации типов стресс-реакции у имаго колорадского жука. Обнаружена связь динамики активности фенолоксидазной системы и фенотипических характеристик имаго.
На модельной выборке имаго L. decemlineata показана возможность комплексного применения молекулярно-биологического (двунаправленная
аллельспецифичная полимеразная цепная реакция), фенетического и токсикологического методов для анализа популяционной структуры вида.
Теоретическая значимость работы. Работа обобщает результаты многолетних исследований, посвященных выяснению роли стресс-реакции в формировании онтогенетических адаптации на ранее не исследованных модельных объектах.
Предложена схема развития стресс-реакции насекомых, согласующаяся с фундаментальной схемой Селье и уточняющая структуру стадии реакции тревоги. Показан универсальный характер стресс-реакции насекомых при воздействиях разного типа, что можно считать подтверждением общности защитной реактивности в отдаленных таксонах животного мира.
Установлена роль стресса и место стресс-реакции в микроэволюционных преобразованиях популяций насекомых как механизма реализации адаптивного потенциала особи и популяции. Одновременно продемонстрирована роль стресс-реакции как преадаптивного стимула, повышающего адаптационные возможности особи и расширяющего границы адаптивного потенциала популяций насекомых.
Концептуальные положения, выносимые на защиту:
-
Генетическая детерминированность параметров стресс-реакции насекомых позволяет использовать различные модели стрессовых ситуаций в качестве методологической базы для оценки состояния популяций насекомых.
-
Резервы скрытой изменчивости, обеспечивающие значительную часть адаптивного потенциала популяций насекомых и вида в целом, проявляются в полиморфизме типов стресс-реакции.
-
Стресс-реакция в лабораторных и природных популяциях насекомых является механизмом реализации адаптивного потенциала популяции и проявления полиморфизма.
-
Стресс-реакция в популяциях насекомых играет роль мощного преадаптивного стимула, становясь последним звеном в системе неспецифической защитной реактивности насекомых, и ее развитие предопределяет дальнейшее состояние, как отдельных особей, так и популяции в целом.
Практическая значимость работы. Разработаны экспериментальные модели стрессовых ситуаций применительно к насекомым, позволяющие охарактеризовать состояние популяций и отдельных особей. На их основе предложены тест-системы, в перспективе применимые в практике массового разведения культур насекомых, в частности, в пчеловодстве. Результаты исследований используются в практике лабораторного скрининга активности предполагаемых адаптогенов и дисадаптантов насекомых.
Показана необходимость учета отдаленных последствий стрессов при оценке состояния популяций и групп насекомых более низкого ранга, особенно при решении вопросов о применении физиологически активных веществ для профилактики и лечения пчел, а также при оценке развития резистентности в популяциях колорадского жука. Результаты работы могут
быть использованы для чтений лекций по курсу «Зоология», «Экологическая физиология», «Экологическая генетика», «Генетика».
Апробация работы. Материалы диссертации прошли апробацию на конференциях: «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии» (Челябинск, 1999), «Проблемы физико-химической биологии» (Пущино, 2000), «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2000), «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2000); на 9 совещании "Совр. состояние проблемы резистентности вредителей" (Санкт-Петербург, 2000); на XII съезде РЭО (Санкт-Петербург, 2002); на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); на III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); на Международном симпозиуме "Medico-biol. Problems of Thermophysiology" (Минск, 2002); на II Международной конференции «Разнообразие беспозвоночных животных на севере (Сыктывкар, 2000); на III съезде ВОГиС (Москва, 2004); на Международной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии» (Саранск, 2005), на IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция -стратегии жизни» (Уфа, 2006); на XIII съезде РЭО (Краснодар, 2007) и на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, 2007), на XXII Любищевских чтениях (Ульяновск, 2008).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 102 печатных работах, в том числе - 20 статей в рекомендованных ВАК журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), пяти глав с результатами собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающей 456 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 385 страницах и содержит 53 рисунка, 55 таблиц и приложение.
Стратегии реализации адаптивного потенциала. Адаптациогенез и его пусковые механизмы
Определение понятий «особь» и «популяция» в животном мире не является предметом острых дискуссий, однако разночтения существуют. Для аллогамных видов, к которым относится преобладающее число насекомых, справедливо определение популяции как группы свободно скрещивающихся организмов одного вида, характеризующихся общностью местообитания и образующих целостную генетическую систему, способную к поддержанию относительного постоянства своей структуры и к дальнейшим эволюционным преобразованиям (Лобашев, Инге-Вечтомов, 1976). Понятие «популяция», предложенное А.Ф. Алимовым (2000), учитывает не только пространственный, но и временной аспект существования: « ...популяция представляет собой, локализованную в пространстве и динамичную во времени систему особей одного вида, находящихся между собой в отношениях размножения».
Поскольку ареной первичных эволюционных преобразований является экосистема (биогеоценоз), то входящая в его состав популяция данного вида организмов является наименьшей эволюирующей единицей (Завадский, 1968; Шмальгаузен, 1983; Иванов и др., 2006). Роль генотипической дифференцировки популяций, на базе которой возникает сложная морфофизиологическая система взаимосвязанных экологических рас, подчеркнута еще в определении вида, данном Н.И. Вавиловым (Вавилов, 1968). Процессы адаптивных преобразований — адаптациогенез и дифференциация внутривидовых групп - рассматриваются как основы микроэволюции (Завадский, 1968; Тимофеев-Ресовский и др., 1977; Северцов, 2007).
Возможность адекватно реагировать на не всегда предсказуемые и ожидаемые изменения условий среды определяется набором свойств, точнее - признаков, и характером их проявления, или выраженностью. Сам признак не является наследуемым, он развивается как результат взаимодействия генотипа и среды (Дубинин, 1976). Необходимо помнить о том, что наследуется только генотип - комплекс генов, который определяет норму реакции, изменяющую проявление и выражение признаков в разных условиях среды.
Основные положения концепции о механизме адаптации организма к факторам среды. Понятие «гомеостаз» было введено в научную терминологию Клодом Бернаром как определение постоянства внутренней среды организма. Однако в более поздней трактовке этого понятия, предложенной П.Д. Горизонтовым (1973) с учетом учения Павлова, явление гомеостаза определяет: 1) единство внутренней среды; 2) постоянное уравновешивание функций организма в соответствии с влиянием его внешней и внутренней среды. Это означает не постоянство, а, наоборот, непрерывную изменчивость некоторых свойств и состава организма в границах соответствующих колебаний, свойственных норме. Границы колебаний могут в какой-то мере меняться в зависимости от действия факторов окружающей среды (Горизонтов, 1973).
Последовательность событий, ведущая к формированию адаптации и объяснение роли стресс-реакции в этих событиях для теплокровных изложены в концепции адаптациогенеза, предложенной Ф.З. Меерсоном (1984, 1991). Нарушение гомеостаза, вызванное фактором среды, или сигнал о возможности такого нарушения через высшие уровни регуляции активируют системы, ответственные за адаптацию. В результате возникают две цепи явлений: 1) мобилизация функциональной системы, которая доминирует в адаптации к определенному фактору, и 2) совершенно неспецифическая, возникающая при действии любого раздражителя, стандартная активация стрессреализующих систем.
В дальнейшем в клетках доминирующей функциональной системы, специфически ответственной за адаптацию, увеличение физиологической функции сопровождается активацией генетического аппарата. Возникает активация синтеза нуклеиновых кислот и белков, образующих ключевые структуры клетки, лимитирующие функцию. В итоге избирательного роста этих структур формируется так называемый системный структурный след, который приводит к увеличению функциональной мощности системы, ответственной за адаптацию и делает возможным превращение срочной, но ненадежной адаптации в устойчивую долговременную.
Формирование системного структурного следа и устойчивой адаптации осуществляется при необходимом участии стресс-реакции. Эта реакция закономерно возникает в ответ на любой элемент новизны и за счет широкого спектра гормонов и медиаторов играет важную роль как в формировании самой функциональной системы, составляющей основу адаптации, так и в формировании системного структурного следа, т.е. в превращении срочной адаптации в долговременную.
Существенно, что после того, как системный структурный след полностью сформировался и стал основой, например, адаптации к физической нагрузке, холоду или гипоксии, устойчивая адаптация устраняет нарушения гомеостаза и, как следствие, исчезает стресс-реакция, ставшая излишней (Меерсон, 1991).
Попытки ввести новые термины в теорию адаптациогенеза не прекращаются и сейчас. Так, относительно недавно была предложена концепция, согласно которой гомеостаз характеризовался только как стабильность физиологических систем, поддерживающих жизнь: уровень рН, температура тела, уровень содержания глюкозы, напряжение (парциальное давление) кислорода (McEwen, Wingfield, 2003). Все динамические параметры процессов, участвующих в поддержании гомеостаза в понимании авторов концепции, следует считать показателями аллостаза - по их определению, достижения стабильности посредством изменений. Авторы не забывают об определении гомеостаза, которое дал У. Кеннон (Cannon, 1929) - гомеостаз является оперированием координированными физиологическими процессами, поддерживающими большинство постоянных состояний организма. Тем не менее, они считают своим долгом подчеркнуть различие между системами, необходимыми для жизни, и системами, поддерживающими ее. Кроме этого, они предлагают использовать термины «аллостатическое состояние», «аллостатическая нагрузка» и «аллостатическая перегрузка», выделяя при этом 2 различных типа аллостатической перегрузки. Стресс как термин ими используется для, обозначения событий, угрожающих индивидууму, которые вызывают физиологические и поведенческие реакции как часть аллостаза. Соответственно, стресс-реакция включается ими в процесс аллостаза с соответствующей нагрузкой и двумя типами перегрузки. Следует сразу же отметить, что пока это новшество в терминологии не прижилось (Dallman, 2003).
Проведение экспериментов с воздействием стрессоров различного типа
Для всех объектов тепловой стресс создавали, помещая насекомых в термостат. Для имаго медоносной пчелы и комнатной мухи использовали капроновые садки с каркасом из тетрапака размером 70x70x70 мм. Для личинок и куколок комнатной мухи, личинок и куколок колорадского жука использовали чашки Петри. В садки помещали также поилки с водой, в чашки Петри - соответствующий субстрат (увлажненные отруби для М. domestica или свежие листья картофеля для L. decemlineata).
Высокую температуру в экспериментах использовали в двух вариантах: 1) до развития теплового стресса, о чем судили по наступлению состояния гиперактивности, и 2) до развития теплового шока, о чем судили- по наступлению теплового оцепенения.
Для установления уровня чувствительности- к действию повышенной температуры по модифицированному для насекомых методу открытого поля (Грицай и др., 1996) регистрировали локомоторную активность насекомых с интервалом 5 минут на протяжении всего периода экспозиции. После ее завершения наблюдения с ежесуточной регистрацией состояния насекомых велись в течение 7 суток. Во всех экспериментах чувствительность особей оценивалась либо индивидуально, при численности группы не менее 30-50 особей в варианте, либо в Зх-кратной повторности по 10-20 особей в каждом варианте.
Насекомых помещали (в садках или чашках Петри) в холодильную либо морозильную камеру, температуру в-которой фиксировали перед началом экспозиции. Время наступления холодового- оцепенения регистрировали визуально: После завершения экспозиции насекомых содержали при комнатной температуре в тех же садках и регистрировали момент первой двигательной реакции (разгибание-сгибание члеников лапок или хоботка) и время (в минутах) до восстановления нормальной локомоторной активности. Последующие наблюдения с регистрацией состояния насекомых велись на протяжении 7 суток.
В предварительных экспериментах оценивали уровень чувствительности к токсикантам. В экспериментах использовались инсектициды из разных групп:
Пиретроиды: дельтаметрин (децис КЭ, 25 г/л, Авентис Кроп Саенсис Г.м.б.х., Германия), эсфенвалерат (сэмпай, КЭ 50 г/л; Ниппон Сода, Япония), X - цигалотрин (каратэ, КЭ 50 г/л, Байер Кроп Сайенс AF, Германия). Фосфорорганические инсектициды: фосмет (фталофос, КЭ 20%), малатион (карбофос) СП (100 г/кг; ФГУП ВНИИХСЗР), пиримифос-метил (актеллик, КЭ 500 г/л; Сингента Кроп Протекши AF, Австрия). Аналоги ювенильных гормонов (АЮГ): метопрен, синтез О.С. Куковинец, ИОХ УНЦ РАН; препараты альтозид, альтозар (Ciba, Швейцария).
Нереистоксины: бенсултап (банкол, СП- 50%; Takeda Chemical Industries Ltd., Япония). Неоникотиноиды: тиаметоксам (актара, ВДГ 250 г/кг; Сингента Кроп Протекши АГ, Австрия), ацетамиприд (моспилан, РП 200 г/кг, Ниппон Сода ЛТД, Япония). Фенилпиразолы: фипронил (регент, КЭ 25 г/л, Сингента Кроп Протекши АГ, Австрия):
Инсектициды использовали- в вариантах либо, с топикальным нанесением, либо путем обработки корма (кишечно-контактным способом). Регистрировали время изменения поведенческих реакций - снижения подвижности, развития гиперактивности, проявления нокдаун-эффекта в течение различных периодов времени, как с коротким- интервалом (1.-5 минут), так и с длительным (от 0.5 до нескольких часов). Далее наблюдения продолжали на протяжении 3-7 суток с регистрацией состояния насекомых. Эксперименты закладывали в 3-5-кратной повторности по 10-20 особей в варианте.
Бактериальный препарат битоксибациллин (БТБ-45 СП; ООО «Сиббиофарм», г. Бердск) на основе Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, содержащий р-экзотоксин и подавляющий развитие представителей отрядов чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых (Бурцева и др., 2001) использовали путем обработки кормового субстрата.
Все эксперименты проводили по описанным ранее методикам (Беньковская, Идрисова, 1985; Беньковская, 1990; Беньковская и др., 2000, 2003).
Создание стрессовой ситуации осуществляли, удаляя і из садков (чашек Петри) пищу и воду. Состояние насекомых оценивали по проявлению локомоторной активности на протяжении от нескольких часов до 15 и более суток, в ряде экспериментов сопоставляли изменения среднего веса в опытных и контрольных вариантах. Количество особей и кратность повторностей в вариантах сохраняли как в выше перечисленных случаях.
Изменения локомоторной активности насекомых в ходе стресс-реакции
Это может быть обусловлено, во-первых, существованием мутаций, способствующих выживанию, в гетерозиготном состоянии, и, во-вторых, проявлением эффекта адаптивного сочетания генетических комплексов, обеспечивающих неспецифическую устойчивость. Тест с определением количества особей в состоянии тремора может служить экспресс-методом выявления резервов формирования устойчивости в популяциях насекомых.
Токсический стресс, вызванный бактериальным препаратом. Микроорганизмы, особенно патогенные, попадая в организм насекомого, вызывают цепь событий, начинающихся неспецифической стресс-реакцией. В-первую очередь реагируют на патоген барьерные ткани: при контактном заражении - покровы, при пероральном заражении — ткани стенки кишечника (Глупов, 2001). Токсины, воздействующие как на ткани покровов и кишечника, так и на нервную систему (Бурцева и др., 2001), могут провоцировать неспецифическую реакцию, аналогично химическим токсикантам.
Основным путем проникновения бактериальных патогенов в,организм медоносной пчелы в природных условиях является желудочно-кишечный тракт. Соответственно, первым барьером для бактериальной инфекции становится кишечник насекомого. Важна не только механическая функция кишечной- стенки, но и активная реакция самого кишечника, включающая изменения тонуса мышц, реакцию эпителия и перитрофической мембраны, а также изменения внутренней среды - рН и активность ферментов (Кузнецов, 1948; Bai et. al., 1984; Кузманова и др., 1991; Бурцева и др., 2001; Мартемьянов и др., 2006).
Проникновение бактериального патогена в организм насекомого будет вызывать изменения в пищеварительном тракте (Кандыбин, 1989). Если насекомое обладает определенной чувствительностью к кристаллофорным бактериям, то попадание их в кишечник будет вызывать некоторые изменения в концентрации водородных ионов, что1 будет сказываться на секреции и активности пищеварительных ферментов. Как следствие нарушение пищеварения, изменение состояния перитрофической мембраны и эластичности стенок кишечника (Батурин, Батурина, 1978; Глупов, 2002).
Изменения размеров некоторых отделов кишечника подчиняются определенным закономерностям: длина средней кишки у пчел во всех группах изменяется несущественно, однако характер изменений значений демонстрирует явственный ответ на воздействие, что особенно заметно в варианте с гибридными семьями (рис. 10).
Выражены изменения ширины средней кишки, причем в вариантах с чистопородными семьями предварительная обработка привела к увеличению значений, а в варианте с гибридными - к некоторому их снижению. Стрессовый характер изменений длины толстой кишки наиболее очевиден в варианте с семьями кавказской расы, однако максимальное выражение этой тенденции наблюдалось для параметра ширины толстой кишки. Резкие изменения этого параметра у гибридных особей свидетельствуют, скорее всего, об усилении патологического процесса.
Изменения размеров отделов кишечника могут быть обусловлены. рядом причин. Во-первых, сокращениями мускулатуры кишечника, что в свою очередь обусловлено-общим ответом нервной системьь насекомого на инфекционную нагрузку; кроме-того, изменениями в состоянии слизистой оболочки отделов. Предварительная обработка, по всей видимости, вызывала гиперемию слизистой, что могло служить одним из защитных барьеров, предотвращающих проникновение патогена в гемоцель.
В то же время показано, что само изменение размеров кишечника, сопровождающееся механическим растяжением ряда клеток, может приводить к активации-внутриклеточных процессов, опосредующих действие гормонов и других биологически активных веществ (Ткачук, 2000).
Стресс, обусловленный старвацией. При голодании у пчел в наших экспериментах фаза беспокойства начиналась от 24 до 28 часов с момента прекращения кормления,, фаза адаптации была довольно коротка - от 28 до 32-34 часов. Фаза истощения начиналась через 34-36 часов от начала голодания. Выживаемость взрослых пчел, перенесших разные по длительности периоды старвации, существенно снижалась, если длительность старвации превышала 36 часов (рис. 11).
Таким образом, для взрослых рабочих пчел установлен критический период старвации, соответствующий переходу от фазы адаптации к фазе истощения (Селье, 1972), равный 36 часам. Следует отметить, что для экспериментов с короткими периодами старвации такой объект, как имаго медоносной пчелы и комнатной мухи адекватны, тогда как имаго колорадского жука отличаются высокой устойчивостью к долговременному голоданию, и такого рода эксперимент не выявляет различий между голодавшиминапротяжении 2-3-суток и питавшимися юсобями.
Холодовой стресс. Изменения локомоторной активности у исследуемых видов насекомых при развитии холодового стресса не настолько четко позволяют выделить фазы реакции, и в данном случае мы использовали параметры изменения активности после завершения экспозиции при низких температурах, регистрируя время наступления холодового оцепенения, а также моменты наступления отдельных фаз восстановления двигательной активности (рис. 12).
Начальным моментом восстановления активности после снятия холодового воздействия считали момент регистрации первых движений лапки или антенн насекомого. Этот момент отмечался как начало двигательных реакций (Тндр). Следующим регистрируемым моментом было начало активных движений всех конечностей, отмечавшееся как выход из оцепенения (Тво).
Особенности стресс-реакции в интродуцируемых семьях Apis mellifera
Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов изучался и для ядерной (Hall, 1998), и для митохондриальной ДНК (мтДНК) пчелы (Smith, Brown, 1988, 1990). В одном из первых исследований полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) мтДНК пчелы обнаружены очень небольшие различия между тремя подвидами - A.m. carnica, A.m. ligustica и A.m. caucasica (Cornuet et al., 1991). Впоследствии использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило выявить различия в структуре межгенного участка мтДНК COI-COII медоносной пчелы, что было использовано нами для оценки генетического полиморфизма в семьях Apis mellifera на территории Башкортостана (Никоноров и др., 1998).
Вариации длин участка COI - СОН у A. mellifera объясняются просто. Межгенный участок большой, с высоким содержанием А+Т, профилем стабильности, вторичной структурой и составом оснований, характерными для контрольных регионов. Все это подтверждает гипотезу о роли его как инициатора репликации. Ситуация у других видов Apis отличается, и не позволяет установить, когда появилась эта вероятная функция.
Таким образом, этот полиморфный участок мтДНК пчелы, возможно, может быть использован как маркер при исследованиях генетической структуры популяций, и даже на субпопуляционном уровне. В соответствии с первичной структурой (Cornuet et al., 1991) этого участка были выбраны две олигонуклеотидные последовательности, которые могут служить праймерами для специфичной ПЦР.
Основу метода составило строгое соответствие аллелей локуса отдельным географическим расам, установленное ранее J.-M.L. Cornuet с соавторами. Локус COI-COII у расы A.m. mellifera с частотой встречаемости более 0.99 представлен аллелем PQQ (описано всего два случая PQQQ). У южных рас A.m. caucasica, A.m. armenica, A.m. carnica, A.m. carpatica и A.m. ligustica (основной источник генетического загрязнения башкирской популяции А. т. mellifera) аллель Q, возможно, фиксирован.
По нуклеотидному составу мтДНК медоносной пчелы отличается высоким содержанием АТ-пар. Участок, расположенный между генами COI и СОИ, за исключением последовательности гена TPHKLeu, сильно отличается по нуклеотидному составу. Элемент Р (54 пн) состоит только из АТ-пар, а содержание этих нуклеотидов в Q-элементе (196 пн) составляет 93% (Crazier, Crozier, 1993; Никоноров и др., 1998).
Ожидаемый размер амплифицируемых с использованием специфических праймеров фрагментов мтДНК составлял 350±10 пн в случае комбинации Q и 600±10 пн при комбинации PQQ (Никоноров и др., 1998).
Результаты амплификации мтДНК отдельных особей медоносной пчелы представлены на рисунке 36. Как и ожидалось, были выявлены различия в размерах амплифицированных фрагментов мтДНК у A.m. mellifera и A.m. caucasica. Они составили 600±10 и 350+10 пн, соответственно.
Использование метода ПЦР дало возможность более детально исследовать вариабельный участок мтДНК пчелы (Cornuet et al., 1991). Даже при сравнительно небольшой выборке, описанный выше метод позволяет охарактеризовать каждую семью по вариабельности локуса COI-COII и может быть предложен для анализа расового происхождения по материнской линии A. mellifera. В Иглинском районе на племенных пасеках были выявлены семьи, заявленные как чистопородные с принадлежностью к A.m. mellifera, и, тем не менее, содержащие мтДНК A.m. caucasica. В дальнейшем проверка расовой принадлежности семей медоносной пчелы по мтДНК использовалась как обязательный компонент во всех экспериментах. Результаты электрофоретического разделения продуктов, полученных при амплификации локуса COI- СОЛ мтДНК пчелы
Apis mellifera L. Образцы 1-7- A.m. mellifera. Образцы 8-10-Л.т. caucasica. Образцы 1-5 получены из семей в заповеднике Шульган-Таш (среднерусская раса); 6-8 - с пасек в Иглинском районе; 9 и 10 - с пасеки учхоза БГАУ (кавказская раса).
Интродукция видов и подвидовых группировок насекомых в новых регионах влечет за собой первоначальный период адаптации к условиям соответствующих эколого-географических зон. Семьи пчел A.m. caucasica, интродуцируемые на территории Башкортостана в течение относительно короткого периода, гораздо менее адаптированы к условиям Южно Уральского региона, чем аборигенные семьи A.m. mellifera, что показали результаты экспериментов.
Основная проблема, с которой приходится сталкиваться в практике интродукции видов - это проблема адаптации к новым экологическим и биоценотическим условиям. Здесь выступает на одно из главных мест роль генетического груза, и особенно его субституционной (переходной) формы (Дубинин, 1976). Это связано с изменением условий среды, и часто приводит к тому, что аллели генов, ранее обеспечивавшие адаптивную норму, становятся неадаптивными. Как следствие, метаболизм интродуцентов также изменяется, и биохимические показатели отражают эти изменения.
Нами были исследованы тирозиназная и ДОФА-оксидазная активности у пчел среднерусской (А. т. mellifera L:) и кавказской {А. т. cancasica Gorb.) рас в норме и их распределение в организме имаго рабочих особей.
Тирозиназная и ДОФА-оксидазная активности фиксируются во всех исследованных органах. Их распределение носит неравномерный характер, который в целом повторяется у особей обеих рас (табл. 14). Наибольший уровень ДОФА-оксидазной активности отмечается в гемолимфе, на втором месте находятся покровы, и далее идут мозг и мышцы торакса. Наблюдаемый при этом разрыв между гемолимфой и другими органами по уровню ДОФА-оксидазной активности не является столь значительным, как в случае тирозиназы. Активность этого фермента у обеих рас максимальна в гемолимфе, где она почти на два порядка выше, чем в других органах.
Уровень обоих типов фенолоксидазной активности в органах пчел кавказской расы повышен по отношению к таковому у пчел среднерусской расы. Можно выделить органы, где отмечается превышение в 2-3 раза: в мышцах торакса увеличена ДОФА-оксидазная активность; в покровах и мозге - и тирозиназная, и ДОФА-оксидазная активность. В мозге в случае активности тирозиназы это превышение пятикратно. Достоверных различий не обнаружено только для тирозиназной активности в мышцах торакса.
