Введение к работе
Актуальность темы. Каждый организм в течение своей жизни подвергается воздействию абиотических и антропогенных неблагоприятных экологических факторов, таких как резкие перепады температуры, недостаток питания, гипероксия или гипоксия, поллютанты, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение и др. Для перенесения неблагоприятных условий у живых организмов выработались различные приспособления как на уровне индивида в течение онтогенеза (физиологическая адаптация), так и в ходе эволюции на уровне популяции, вида (генетическая адаптация). Поскольку экологические стрессоры различной природы часто воздействуют одновременно либо с небольшим интервалом времени, в эволюции сформировались механизмы перекрёстной адаптации, когда устойчивость организма к воздействию одного стрессора сопровождается повышением резистентности к действию комплекса других стрессоров (Hale, 1969; Fregly, 1971; Hoffmann, Parsons, 1989; Sothmann et al., 1996; Pastori, Foyer, 2002; Ning, Chen, 2006; Horowitz, Assadi, 2010). Явление перекрестной адаптации вызывает особый научный интерес, поскольку подразумевает общность моле-кулярно-клеточных компенсаторных механизмов стрессоустойчивости.
Длительность жизни и плодовитость организмов отражают степень приспособленности популяции к среде обитания. Продолжительность жизни является интегральным показателем стрессоустойчивости организма, поскольку в определенной мере она зависит от генотипа особи, и в большей степени - от влияния экологических стрессоров (Петин, Сынзыныс, 1998). Установлено, что в регуляции стрессоустойчивости организма, скорости его старения и продолжительности жизни участвуют различные гены, кодирующие транскрипционные факторы (FOXO, Hsf-І), деацетилазы белков, протеинкиназы (PI3K, TOR, JNK), каталазы, цитоплазматическую и митохондриальную супероксиддисмутазы (SOD) (Москалев, Шапошников, 2008, 2010; McElwee et al., 2004; Giannakou, Partridge, 2004; Lamitina, Strange, 2005; Carter, Brunet, 2007). В последнее время появились данные о влиянии генов белков теплового шока (Hsps, Heat Shock Proteins) на продолжительность жизни различных модельных организмов (Morrow et al., 2004; Klose et al., 2005; Poirier, Seroude, 2005; Vanhooren et al., 2008).
Индукция белков теплового шока (молекулярных шаперонов) - один из первичных защитных механизмов в условиях стресса. Основной функцией белков теплового шока при стрессе является поддержание нативной кон-формации других белков в клетке, предотвращение их агрегации, восстановление функционально активной структуры белков, участие в деградации нерепарируемых и агрегированных белков (Tavernarakis, Driscoll, 2002; Coffer, 2003; Morrow et al., 2004; Rattan et al., 2004). Неотъемлемая роль белков теплового шока в механизмах стрессоустойчивости подтверждается их высокой эволюционной консервативностью от Escherichia coli до человека (Soti, Csermely, 2007; Calderwood et al., 2009). К настоящему моменту известно, что белки теплового шока участвуют в адаптивном ответе клетки in vitro к действию различных экзогенных стрессоров (Amundson et al., 2003; Hunt et al., 2004; Kang et al., 2002; Soti, Csermely, 2007). Однако остается неясным вопрос об их роли в формировании адаптивного ответа in vivo, в том числе, к действию малых доз ионизирующего излучения, и в обеспечении перекрестной адаптации к действию факторов химической и физической природы на уровне целого организма.
Наиболее удобным объектом для изучения генетической регуляции стрессоустойчивости и продолжительности жизни является Drosophila melanoga-ster, поскольку для данного вида существует полная коллекция линий с мутациями в генах белков теплового шока и транскрипционного фактора теплового шока. Помимо того, высокая плодовитость, возможность развития на искусственных агаросодержащих средах, короткий жизненный цикл
(около 12 сут.) и небольшая длительность жизни (около 3 мес.) дрозофилы позволяют в сжатые сроки осуществлять эксперименты с большими выборками исследуемых животных. Изученные в данной работе гены белков теплового шока ортологичны генам белков теплового шока человека, что позволяет использовать полученные нами выводы при интерпретации адаптации к стрессовым воздействиям у человека.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выяснении роли генов белков теплового шока и транскрипционного фактора теплового шока в формировании адаптивного ответа у Drosophila melanogaster к действию прооксиданта параквата, гипертермии, у-излучения. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Изучить адаптационную устойчивость Drosophila melanogaster к действию различных стрессоров (ионизирующего у-излучения, гипертермии и прооксиданта параквата) на основе параметров продолжительности жизни;
-
Провести сравнительный анализ продолжительности жизни у особей линии дикого типа и особей с мутациями генов белков теплового шока (Hsp70Ba, Hsp70A, Hsp70B, Hsp83, Hsp22, Hsp67Bb, Hsp60) и транскрипционного фактора Hsf (аллели 1-4) при индукции адаптации Drosophila melanogaster действием ионизирующего у-излучения в малых и средних дозах.
Теоретическая значимость и научная новизна. Показано, что действие хронического у-излучения при малых и средних значениях накопленной дозы и кратковременный тепловой шок способны индуцировать адаптивные изменения у дрозофил линии дикого типа, снижающие негативное воздействие острого у-излучения или прооксиданта параквата на продолжительность жизни. Данный факт говорит об универсальности молекуляр-но-клеточных механизмов стресс-ответа и важной роли успешного функционирования этих механизмов в продолжительности жизни. Выявлено, что способность особей к проявлению адаптации утрачивается при наличии в генотипе мутаций в гене транскрипционного фактора теплового шока Hsf4 и генах белков теплового шока семейства Hsp70. Полученные данные свидетельствуют о непосредственном участии Hsf и Hsp70 в генетическом контроле продолжительности жизни, в том числе, в условиях хронического стресса. В работе обоснована правомочность применения продолжительности жизни как интегрального показателя стрессоустойчивости в исследовании генетических механизмов адаптивного ответа. Выявлена недостающая связь между молекулярно-генетическими механизмами адаптивного ответа in vitro и эффектами адаптации на уровне целого организма.
Практическая значимость. Результаты исследований могут быть использованы при разработке рекомендаций по снижению негативных последствий воздействия стрессовых факторов на здоровье человека и экологическое состояние биоты. Поскольку в генотипе человека присутствуют исследованные гены, кодируемые ими белки могут служить новыми мишенями для фармакологического и генотерапевтического повышения стрессоустойчивости организма в целях радиопротекции, геропротекции (замедления скорости старения) и цитопротекции (при лечении воспалительных заболеваний, последствий травм, сердечно-сосудистых патологий).
Связь с научно-исследовательской работой института. Исследования проводили в течение 2007-2011 гг. в рамках бюджетных тем Отдела радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Проведенные исследования поддержаны грантом РФФИ на 2008-2010 гг., грантом Президиума РАН по целевым программам «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине» на 2009-2011 гг., Молодежным научным грантом УрО РАН 2010 г.
Личный вклад автора. Соискатель участвовал в разработке цели и задач исследования, провел всю экспериментальную работу, статистическую обработку и анализ данных, обобщение результатов, подготовку публикаций. 4
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов. Список цитируемой литературы содержит 220 публикаций, в том числе, 180 публикаций зарубежных авторов. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит семь таблиц и 29 рисунков.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 работ, в том числе, четыре статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на всероссийских научных конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы биологии и экологии» Института биологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2007, 2008, 2011 гг.); на всероссийском научном семинаре «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, 2008 г.); на международном симпозиуме «Современные материалы по радиационной биологии, оценка материалов» (Тэджон, 2011), а также на международных конференциях: «Эффекты малых доз радиации на здоровье человека и состояние окружающей среды» (Будапешт, 2007); «БИОРАД 2009» (Сыктывкар); «Современные проблемы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (Дубна, 2009).
