Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Механизмы взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения (НЛИ) с молекулярными структурами клетки и модификация генетических эффектов 10
1.1.1. Резонансное фотоакцепторное поглощение энергии низкоинтенсивного лазерного излучения (НЛИ) 10
1.1.2. Нелинейные формы абсорбции излучения инфракрасной (ИК) области спектра 16
1.1.3. Каскад темновых биохимических реакций в клетках при лазерной экспозиции 19
1.1.4. Биоэффективность импульсного воздействия в зависимости от параметров облучения 23
1.2. Основные характеристики процесса митотической рекомбинации как источника генетической изменчивости в митотически делящихся клетках 27
1.2.1. Временные рамки осуществления митотической рекомбинации 29
1.2.2. Современные представления о механизмах соматического кроссинговера 31
1.2.3. Влияние абиотических факторов на частоту митотической рекомбинации 40
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследования и условия проведения опытов 44
2.2. Гены маркеры X - хромосомы Drosophila melanogaster, используемые в работе 46
2.3. Схемы разработанных экспериментов 48
2.4. Условия экспозиций низкоинтенсивным импульсным лазерным излучением 50
2.5. Статистическая обработка данных 53
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Модификация частоты митотической рекомбинации при воздействии НИЛИ на имаго различных генотипов 56
3.1.1. Экспериментальные исследования с облучением самок имаго генотипических структур YF//Y+F+, Y+F//Y+F+ 56
3.1.2. Экспериментальные исследования на генотипических структурах YCT//F с облучением самок, самцов и обеих родительских форм 68
3.1.3. Экспериментальные исследования с использованием генотипическои структуры WAF//YCT 79
3.2. Флуктуации частот митотической рекомбинации в условиях экспозиции личинок 92
3.2.1. Частота рекомбинационных событий в районе
расположения генов Y - СТ - F 3.2.2. Частота митотического синапсиса в дистальных районах X - хромосомы 96
3.3. Отрицательная интерференция в соматическом кроссинговере 100
3.4. Влияние различной частоты посылки импульсов на уровень суперэкспрессии макрохет Drosophila melanogaster 105
3.5. Морфозы и гинандроморфы как отклонения в индивидуальном развитии организма 114
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Потенциальные механизмы биоэффективности электромагнитного излучения инфракрасного диапазона 122
4.2. Низкоинтенсивное лазерное излучение и митотическая рекомбинация 126
4.3. Изменения паттерна экспрессии гена forked 136
4.4. Дозовая зависимость биоэффективности импульсного лазерного излучения 147
Выводы 152
Литература 154
Список основных сокращений 176
Приложение
- Механизмы взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения (НЛИ) с молекулярными структурами клетки и модификация генетических эффектов
- Объекты исследования и условия проведения опытов
- Модификация частоты митотической рекомбинации при воздействии НИЛИ на имаго различных генотипов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Для каждой точки биосферы значения и сочетания экологических факторов носят специфический характер. Однако человек в ходе своей хозяйственной деятельности нарушает годами сложившееся природное равновесие, в том числе и электромагнитный баланс, важнейший компонент биогенной коммуникации (Рорр F.-A., Chang J.J., 1998). Межклеточные и межорганизменные взаимодействия в биосистемах различных уровней организации (Будаговский А.В., 2000), взаимодействия со средой обитания, регулировка возрастной дифференциации популяций (Бурлаков А.Б. и др., 2000), в немалой степени определяются биофотонной эмиссией. Само функционирование сложной живой системы и поддержание ее целостности осуществляется при постоянном воздействии эндогенных излучений, генерируемых самой биосистемой (Вапняр В.В., 2002). В то же время функционирование живых организмов тесно связано с наличием во внешней среде излучений широкого диапазона длин волн. Флуктуации электромагнитного фона, являясь мощным стрессовым фактором, вторгаются в эволюционно сложившиеся механизмы адаптации видов.
Низкоинтенсивное лазерное излучение (НЛИ) контролируемый человеком экологический фактор. Характер отклика биосистемы на такого рода экзогенное воздействие определяется следующими его параметрами: длиной волны излучения, мощностью излучения, дозой воздействия, диаметром светового пучка, поляризо-ванностыо (линейной, круговой, эллиптической и т. д.), типом воздействия, временем экспозиции, частотой модуляции, длительностью импульса, коэффициентом заполнения, созданием и релаксацией когерентности, учетом монохроматичности. Действуя на живые системы различных уровней организации (клетки, ткани, ораны, организм) низкоэнергетическое лазерное излучение неизбежно вызывает ответную реакцию в виде комплекса разветвленных цепей взаимосвязанных и взаимообусловленных процессов (биофизических, биохимических, физиологических и морфологических), прямым и опосредованным образом определяющих реакции наследственных структур, сокрытых в ядре эукариотических клеток. Однако до сегодняшнего дня актуальным остается вопрос, касающийся рекомбинационного влияния низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения, подводимого к та-
кой живой системе как соматическая клетка организма, с различной частотой следования импульсов. Не решены вопросы запуска основных цепей ответных реакций на инфракрасное воздействие, приводящих к регистрируемым биоэффектам, вопросы изменения торсионного напряжения ДНК, изменения сочетания рецессивных мутантных генов в пределах исходных нитей нуклеиновых кислот, процессы избирательной экспрессии генов и последующей трансляции закодированных ими белков.
В медицинской практике актуальной остается концепция минимизации дозы, ибо энергии лазерного луча должно быть достаточно лишь для запуска ответной реакции организма, приводящей к тем многочисленным внешним эффектам, которые определяются как биостимулирующие. Снизить дозы воздействия позволяет использование импульсного ИК - лазерного света.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей диссертации явилось изучение влияния среднечастотного (80 - 3000 Гц) ИК (890 нм) низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в разных частотных модуляциях на генетические структуры живых систем путем анализа уровня митотической рекомбинации в обычных соматических клетках и паттерна биосинтетических процессов, проявляющегося как суперэкспрессия некоторых морфологических составляющих организма.
Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:
Изучить ответную реакцию генетических структур живой системы на воздействие низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения с различной частотой следования импульсов путем анализа изменений частоты митотической рекомбинации по количеству особей с мозаичными клонами различной величины или иному в сравнении с ожидаемым генотипу гонад;
Провести анализ распределения митотических обменов по длине X - хромосомы и их независимости друг от друга после влияния на организм экзогенного фактора волновой природы;
Изучить влияние различных частот следования импульсов ИК НИЛИ на процессы экспрессии генов и последующую трансляцию белков, путем идентификации изменений местоположения, числа строго детерминированных макрохет;
Проанализировать данные кривой «доза - эффект» в отношении зависимости ответной реакции наследственных структур соматических клеток от параметров низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения инфракрасного диапазона;
Выявить универсальные частоты следования импульсов, оказывающие био-стимулирующее действие вне зависимости от пола, возраста, генотипической структуры организма при экспозиции в пределах малых доз излучения.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Решенные в данной работе вопросы представляют интерес как новые знания об общих закономерностях формирования ответной реакции генетических структур соматических тканей организма на воздействие ИК НИЛИ в условиях тотального облучения.
Впервые рассматривается биологическое действие НИЛИ ИК - области спектра на интенсивность процесса митотической рекомбинации в обычных соматических клетках организма.
Рассмотрены возможности наложения биоэффектов в случае облучения обоих родителей, несущих таким образом гомологичные X - хромосомы подвергшиеся воздействию лазерного света.
Исследована возможность каждого из родителей в отдельности, доносить вызванные облучением изменения до первых митотических делений дроблений зиготы и последующих митозов, направленных на формирование тканей имаго.
Рассмотрены изменения межклеточной регуляции и экспрессии некоторых регу-ляторных генов в моменты дифференциации сенсорных материнских клеток, дающих в последствии развитие макрохетам тела.
Раскрывается общеорганизменный эффект НИЛИ, а не только местные реакции на облучение, что можно использовать с целью регуляции морфогенеза.
Вследствие невозможности линейной модификации нуклеиновых кислот ИК светом предлагается модель многофакторного влияния излучения указанной области спектра на генетические структуры сомы. Предлагаются гипотетические схемы первоакцепции излучения и каскада последующих реакций на уровне клеток и тканей, а также поднимается проблема подбора оптимальных доз излучения, которые бы соотносились с эндогенными ритмами и приводили к повышению биоэффективности в меньших дозовых пределах.
Рассматривается неоднозначная роль генотипической изменчивости в соматических тканях (в том числе и для жизнедеятельности человека) и ее эволюционное, либо адаптивное значение для популяции организмов.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
В ходе экспериментальных исследований были выявлены:
Экологическая роль низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения в процессах дефинитивного становления морфологических структур организма с индукцией приспособительных механизмов наследственной (рекомбинационной) и ненаследственной (модификационной) изменчивости;
Флуктуации частот митотической рекомбинации между отцовскими и материнскими X - хромосомами как результат разнопланового взаимодействия инфракрасного лазерного света низких интенсивностей с наследственными структурами соматических клеток;
Влияние низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения инфракрасной области спектра с различной частотой следования импульсов на генетически строго детерминированную систему морфогенеза макрохет из сенсорных материнских клеток с последующей суперэкспрессией признака.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В диссертационной работе предлагается экспресс - метод тестирования (somatic mutation and recombination test): генетической биоэффективности НИЛИ; ЭМ излучений и полей; генотоксической активности полютантов окружающей среды, биоценозов, нативных и селитебных ландшафтов; генетической токсичности лекарственных средств. Метод характеризуется информативностью, достаточно быстрым выявлением результатов (в течение 10-12 дней), достаточно большим объемом репрезентативных выборок, экономичностью, способностью учитывать различные генетические события.
Метод позволяет установить значимость ЭМ фона в жизни организмов, ответная реакция которых направлена на восстановление функциональной активности ДНК, а так же позволяет выявить тончайшие механизмы взаимодействия НИЛИ с наследственными структурами организма.
Исследования генетической эффективности НИЛИ ИК области спектра дают возможность обоснованного подбора оптимальных для различных вариантов патологии частот следования импульсов при минимальных, но достаточно эффектов-
ных дозах воздействия (особенно на развивающийся организм и половые клетки -предшественники).
Выявленные в ходе экспериментальных исследований биоэффективные дозы можно использовать в целях селекции в растениеводстве (данное явление позволит использовать летальные дозы радиационного воздействия с сохранением жизнеспособности объектов, ускорить репарацию повреждений, получая фенотипически отличные формы) при воздействии на проростки тех или иных культур, т.к. семена могут отличаться лазерорезистентностыо, а также для облучения привоя и подвоя с целью облегчения процессов прививания и в животноводстве для облегчения прохождения отелов (особенно в зимний стойловый период), активизации резистентности у молодняка, увеличения надоев, уменьшения длительности сервис - перио-да, повышения среднесуточного прироста, снижения содержания Cs в тканях КРС (путем ускорения экскреции), обеззараживания бактериально обсемененных комбикормов и белково-витаминиых концентратов.
Полученные данные широко используются в преподавании курсов «Сельскохозяйственная радиология», «Сельскохозяйственная радиобиология», «Ведение сельского хозяйства в условиях радиоактивного загрязнения территории» на пятом, третьем и четвертом курсах таких специальностей как «Агрономия», «Зоотехники», «Экономисты» Всероссийской Московской сельскохозяйственной академии им К.А. Тимирязева (Калужский филиал); для разработки и руководства проведением научно-исследовательских работ студентов по кафедре «Сельскохозяйственная радиология и экология» МСХА им К.А. Тимирязева и на кафедре «Общая биология» КГПУ им. К.Э. Циолковского. Материалы диссертации используются в учебных курсах «Генетика», «Основы радиобиологии», «Большой практикум по биологии развития» на второй ступени обучения биолого-химического факультета по специальностям «Биология», «Экология» в Калужском государственном педагогическом университете им. К.Э. Циолковского, ныне Институте естествознания.
Материалы наших исследований и подбор данных литературы находят практическое приложение и в курсах «Концепции современного естествознания» и «Безопасность жизнедеятельности» первого и третьих курсов Института управления и бизнеса в плане ознакомления с механизмами и ролью лазеротерапевтических процедур в ходе диагностики, профилактики, лечения и реабилитации пациентов в
Механизмы взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения (НЛИ) с молекулярными структурами клетки и модификация генетических эффектов
Наследственный материал, сокрытый в ядре клетки, подвергается модифицирующему действию ряда факторов, в том числе НЛИ. Каковы механизмы запуска ответной реакции системы, определяющие, в конечном счете, стимулирование, ин-гибирование и толерантность генетического материала соматических клеток в отношении воздействия экзогенного фактора волновой природы? Тем более что от первичной светоакцепции зависит направленность, выраженность и характер биоэффективности НЛИ. 1.1.1. Резонансное фотоакцепторное поглощение энергии НЛИ
Пока не существует единой всеобъемлющей теоретической концепции, дающей однозначное представление о механизмах действия лазерного света на биосистемы. Однако, многие ученые (Девятков Н.Д. и др., 1987; Воронина О.Ю. и др., 1992; Климанов М.Е. и др., 1993; Артюхов В.Г. и др., 1996; Зубкова СМ., 1999; Андрю-шина Н.Б. и др., 2000; Кару Т.Й., 2001; Гладких СП., 2002) сходятся во мнении о том, что процессы заключаются в поглощении кванта света и стимуляции в результате этого соответствующих фотохимических реакций, в образовании лабильных промежуточных фотопродуктов, в последующих молекулярно - клеточных механизмах реакции и в формировании конечного фотобиологического эффекта.
При выявлении механизма действия НЛИ необходимо определить возможные триггеры энергии монохроматического света. Спектральная зависимость различных апробированных биологических объектов (лимфоцитов человека, фибробла-стов животных, клеток культуры Д), совпадая с типичным спектром поглощения порфириновых соединений, позволяет (Гамалея Н.Ф. и др., 1983) предположить, что светоакцептором служит какое-то соединение из группы порфиринов (Климанов М.Е. и др., 1993; Гладких СП. и др., 2000; Клебанов Г.И., 2002). Порфирины являются составной частью многих важных биохимических компонентов организма животных и человека (гемоглобина, цитохромов, ряда ферментов) и способных играть роль сенсибилизаторов реакции (Зубкова СМ., 1978, Пальцев Ю.П. и др., 1992) при НЛИ с длиной волн 350-500 нм (Гладких СП. и др., 2002).
При облучении клеток крови in vitro отмечена высокая чувствительность эритроцитов, что связывают с содержанием в них гемоглобина и большей светопогло-щающей способностью (Пальцев Ю.П. и др., 1992, Гладких СП. и др., 2002). Насыщенные кровью ткани полностью поглощают видимый свет с длиной волны 580-бООнм уже на глубинах до 1 мм. Эффект окна прозрачности живых тканей объясняют (Елхов МП., Каплан М.А., 1993) блокировкой "паразитных" дыхательных цепей и последующим стимулирующим действием ЛИ, либо связывают с локальным разогревом хромофоров (Каплан М.А., 2000), имеющих негомогенное распределение в клетках и тканях.
Анализ электронных спектров поглощения показал, что в случае облучения гемоглобина, зарегистрированные изменения касаются в основном хромофорных групп ароматических аминокислот полипептидных цепей, а не хромофор железопорфи-рина, что говорит о миграции энергии, поглощенной гематином, на апобелок (Ар-тюхов В.Г. и др., 2000; Гладких СП. и др., 2002). Белковые глобулы оказывают защитное действие по отношению к гематину, и физико-химические свойства гемоглобина могут оставаться неизменными (Минц Р.И., Скопионов С А., 1989).
Биоэффективность ЛИ далеко не всегда связана непосредственно с пигментированными молекулярными комплексами (Клебанов Г.И., 2002). Облучение оказывает влияние на оптические свойства и очищенной непигментированной плазмы (Минц Р.И., Скопионов С.А., 1989). При изменении плотности излучения от 0,5 до 750 Вт/м обнаружено стимулирующее действие He-Ne лазера на функциональную активность лимфоцитов (неокрашенных клеток крови). Данное явление сопровождалось выделением в среду двухспирального ДНК-содержащего фактора, образованием Е-розеток лимфоцитами крови человека (Гамалея Н.Ф. и др., 1983; Нестерова И.В. и др., 1993) и коррелировало с изменениями поверхностных цитомем-бран, их электростатических и адгезивных свойств (Лаптева P.M. и др., 1989), модуляцией Na/K-АТФазы (Самойлов Н.Г. и др., 2000). В интервале доз от 28 до 56 Дж/м усиливается транскрипционная активность лимфоцитов периферической крови (Smorianinova N.K. etal., 1991; Смолянинова Н.К., 1991).
Существует мнение (Девяткова Н.Д. и др., 1987; Зубкова СМ., 1999), что свето-акцептором может являться специфический порфирин-содержащий фермент ката-лаза, имеющий максимум светоабсорбции 628 нм наиболее близкий к длине волны He-Ne лазера (632,8 нм) по сравнению с максимумами других биологически важных соединений (цитохромоксидазы - 500 нм, цитохрома а - 605 нм, возбужденного кислорода с полосой 634 нм и т.д.). Монохроматическое излучение с .=632,8 нм (10 мин, 2,5 мВт/см , плотность мощности 1 мВт/см ) оказывает фотохимическое действие (Зубкова СМ., 1978) на хромофорную группу активного центра каталазы (Климанов М.Е. и др., 1993; Монич В.А. и др., 1993), который претерпевает при этом конформационные изменения (Redman СМ. et al., 1972, Jones P., 1973). Обнаружен защитный эффект апофермента по отношению к железопорфирину (Метелица Д.И. и др., 1997), однако после 15 мин воздействия He-Ne лазера (632,8 нм, 4-6 мВт) наблюдается снижение поглощения белковой части каталазы, что сопровождается уменьшением каталитической активности (Chain С.-К. et al., 1996; Pasher Т. et al., 1996; Артюхов В.Г. и др., 2000; Кару Т.Й., 2001).
Каталаза принимает активное участие в митохондриальных окислительных процессах (Ченцов Ю.С., 1995), связанных с энергообеспечением клетки, за счет окисления альдегидов (Свиридова СП. и др., 1989), существенных для механизма окислительного фосфорилирования (Зубкова СМ., 1978) и является ферментом антиок-сидантной защиты организма (Гончарова Л.Л. и др., 1994).
Воздействие импульсным ИК лазерным излучением (890 нм, 4,1-6 Вт) на различные стадии онтогенеза (личинки, куколки, имаго) D.melanogaster выявило активацию каталитической функции фермента при облучении с чей 150 Гц (1,31 Дж/м2) и 160 Гц (51,36 Дж/м2) и инактивирующий эффект при воздействии с чей 3000 Гц (26,32 Дж/м2) и 10240 Гц (3290 Дж/м2) (Алешина Т.Е., 2001). Невысокими значениями энергии конформационных переходов биополимеров (белки имеют спектр поглощения от УФ до ИК) И.И. Мельников (2004 г) объясняет общность отклика различных ферментативных систем на слабые энергетические воздействия НИЛИ.
Объекты исследования и условия проведения опытов
Объектом исследований послужила Drosophila melanogaster - известный издавна объект генетики. Изученность генетических и цитологических карт хромосом дрозофилы, генетического контроля большинства процессов развития, реакций клеток и организма на воздействия средовых факторов, малые размеры, позволяющие осуществлять тотальное облучение, короткий цикл развития, плодовитость, возможность базироваться на больших объемах репрезентативных выборок, относительная легкость в содержании в лабораторных условиях, удобство проведения экспериментов позволяют назвать данный объект перспективным для радиобиологических исследований современного этапа развития науки.
В ходе исследований использовали пять чистых линий D.melanogaster гомозиготных по рецессивным генам yf, yet, f, waf и Дз2. Домодедовская 32 - низкомута-бильная линия «дикого» типа (норма), фенотипически отличающаяся серой окраской тела, красного цвета глазами, нормальными по форме крыльями. Остальные линии представляют собой гетеро- или дигетерозиготы по мутантным генам специально выведенные в лаборатории с целью маркировки различных участков X -хромосомы и возможности последующей идентификации районов образования хиазм.
В ходе изучения влияния ИК НИЛИ на различные признаки Dr. melanogaster формировали экспериментальные группы из 2-х - 3-х суточных самок и самцов, полученных по (Мыльников СВ., 1991). Трех суточные самки способны откладывать максимальное количество яиц (Ватта К.В., Тихомиров М.М., 1979). Проводили массовые скрещивания 5 самок : 5 самцов с использованием особей различных генетических конфигураций с целью создания генетической гетерогенности в тканях, что в случае прохождения соматической рекомбинации позволит установить частоту кроссинговера по визуально наблюдаемым одиночным и двойным пятнам на теле дрозофилы с проявлением определенных генов или их групп в гомозиготе. Предварительно либо самок, либо самцов, либо обоих родителей подвергали лазерному воздействию. Варьирование пола облучаемых особей позволяет оценить не только лазерочувствительность половых клеток разной природы, но и роль цитоплазмы в передаче и усилении первоначального сигнала воздействия.
Скрещивания проводили в двух направлениях: самок определенной чистой линии скрещивали с самцами, несущими данные гены в доминантной форме, а несколько других в рецессивной (табл.1). В дальнейшем использовали реципрокные скрещивания с теми же маркерами. Во всех типах скрещивания оставляли контрольную группу, которая не подвергалась лазерным воздействиям. Все группы формировались из пяти повторностей. Продолжительность размножения родительских форм составляла 12 суток. Через четверо суток (в дальнейшем обозначено как I этап исследований), родительских особей пересаживали на свежую питательную среду еще на четверо суток (II этап) и по истечении следующих четверо суток (III этап исследований) устраняли из эксперимента.
Для получения массовых кратковременных яйцекладок в ходе эксперимента нами выполнялся ряд условий:
1. замена питательной среды в ходе кладки, что является стимулирующим фактором (Ватта К.В., Тихомиров М.М., 1979);
2. использовалась среда с хорошо проросшими дрожжами, то - есть спустя 1 - 2 суток после приготовления (Медведев Н.Н., 1968);
3. поверхность среды была достаточно влажной, что обеспечивало высокую насыщенность воздуха и стимулировало откладку яиц;
4. чтобы яйца распределялись равномерно по поверхности, и была гарантия хорошей интенсивности яйцекладки, поверхность среды делали шероховатой (при помощи кисточки);
5. при пересадке самок на новую питательную среду не допускались всякого рода сотрясения, толчки или вибрации пробирок, в которых находились D.melanogaster, так как потревоженные самки задерживают откладку уже оплодотворенных яиц и начальные этапы эмбриогенеза проходят внутриутробно, кладка десинхронизируется (Проблемы генетики в исследованиях на дрозофиле, 1977).
В случае облучения личинок, для синхронизации материала использовали кратковременные (4 часа) яйцекладки. Через 96 часов после завершения откладки яиц личинок подвергала облучению.
Индивидуальное развитие особей, включенных в скрещивания, проходило на стандартной питательной среде (Медведев Н.Н., 1968) с использованием следующих мер продуктов: вода дистиллированная - 500 мл, изюм - 20 г, манная крупа -22,5 г, агар - агар (вымороженный) - 4,5 г, дрожжи (сырая масса) - 40 г, пропионо-вая кислота - 2 мл. Показатель рН среды соответствовал 6,50±0,55, а ее влажность 75%. При помощи 5 мл шприца питательная среда ровным слоем помешалась на дно стеклянных пробирок слоем 1,5-2 см.
Модификация частоты митотической рекомбинации при воздействии НИЛИ на имаго различных генотипов
Одним из параметров исследуемых в данной работе была частота митотической рекомбинации между гомологичными районами X - хромосом, которая могла произойти либо в дробящихся ядрах эмбриона D.melanogaster, либо в ходе более поздних митозов, направленных на формирование различных органов imago.
Основная трудность в рассмотрении данного вопроса заключалась в том, что механизмы митотической рекомбинации на данный момент времени еще мало изучены и основные серии доступных для рассмотрения работ приходились на 1965-, 1980 годы (Тупицына Б.М., 1965; Абелева Э.А., Мяснянкина Е.Н., 1971, 1976). В связи с этим требовалось более детальное рассмотрение полученных экспериментальных данных. Результаты митотической рекомбинации выявлялись опосредованным визуальным способом. Величина клона рекомбинантных клеток определялась по зонам расположения механосенсорных органов - макрохет, являющихся систематическим признаком. Всего у D.melanogaster имеется 25 пар макрохет, из которых 9 пар располагаются на голове и 16 пар - на груди мухи (Фриц-Ниггли X., 1961; Медведев Н.Н., 1966). Среди макрохет различают: верхние и нижние гуморальные, передние и задние нотоплевральные, презутуральные, передние и задние супраалярные, передние и задние посталярные и, наконец, передние и задние дор-зоцентральные (Медведев Н.Н.,1966). На щитке (скутеллюме) располагаются четыре макрохеты: две передние и две задние скутеллярные (рис.1).
В ходе анализа полученных данных основное внимание уделялось зависимости величины и направленности биоэффектов НИЛИ ИК спектра от дозы излучения и частоты следования импульсов, как немаловажных параметров лазерного излучения. В силу того, что достаточно остро стоит вопрос мутабильности соматических клеток различных полов, облучению подвергались отличные по половой принадлежности особи.
Тем более что в данных литературы однозначного ответа на данный вопрос не найдено. Дукельская А.В. и др., (1979) указывает на зависимость чувствительности полов от уровня регуляции: клеточного или имагинального диска - органа. Михеев B.C., Павлов Ю.И., (1977) исследуя имагинальный диск глаза Drosophila melanogaster, установили одинаковую частоту митотической рекомбинации в соме самцов и самок. Приведенные выводы не соответствовали данным К. Штерна (Stern С, 1936) о большей частоте соматического кроссинговера у самок и не совпадали с данными (Gatti М. et al., 1974; Абелева Э.А., Мяснянкина Е.Н., 1976) о большей чувствительности сомы самцов. Радиочувствительность генетического материала клеток сомы у обоих полов одинакова (Дукельская А.В. и др., 1979). Однако у самок интенсивно протекают процессы репарации.
В наших исследованиях облучение трех суточных самок yf//y+ff выявило большую достоверно значимую биоэффективность чей 300 Гц и 1500 Гц (табл.2) в отношении перекрестов в клетках сомы (рис.1). Среди рекомбинантов выявились как самки, так и самцы (таблица 1, приложение). Доза 65,7 мДж/см2 (1500 Гц; 4,1 Вт; 890 нм; 120 с) способствовала появлению четырех самок (частота рекомбинации 0,574±0,234 % в опыте и 0,114±0,114 % в контроле) с мозаичными клонами по гену forked, захватывающими в двух случаях правую и левую скутеллярные макрохеты (рис. 1а, приложение), в двух случаях - левую заднюю дорзоцентральную (рис. lb, приложение) и правую заднюю супраалярную макрохеты скутума D. melanogaster (рис.1). В данном случае кроссинговер наблюдался между генами yellow - forked и forked - центромера (рис. 18а, приложение). Одна самка была фенотипической yf и оказалась стерильной. Возможно, путь ее появления связан с рекомбинацией между геном forked - центромера облученной материнской и интактной X - хромосомы самца в первом делении дробления (рис.18Ь, приложение). Прошедший обмен видимо повлиял на жизнеспособность второго кроссоверного ядра у+Ґ7/у+Ґ", которое элиминировав не оставило следов данного генотипа.
Один рекомбинантный самец yf// имел мозаичный клон с нормальной формы макрохетами (0,107±0,107 в опыте, 0,110±0,110 в контроле), который захватывал переднюю и заднюю дорзоцентральные мактохеты с правой стороны торакса (табл.1, приложение).
В ходе повторного эксперимента (при использовании той же дозы) выявлены три самки с вильчатыми левой (правой) скутеллярными макрохетами (рис. 1а, приложение) и передней и задней скутеллярными bristles (одновременно), но на правой стороне тела (0,366±0,211 и 0,171±0,171 в контроле, рис.3).
