Содержание к диссертации
Введение
1 CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1 Эколого-биологические особенности Bacillus thuringiensis . 10
1.1.1 Систематическое положение В. thuringiensis 10
1.1.2 История описания вида В. thuringiensis и его разнообразия 11
1.1.3 Внутривидовая классификация В. thuringiensis . 12
1.1.4 Распространение В. thuringiensis 15
1.1.5 Характеристика клеточных и культуральных признаков В. thuringiensis 16
1.1.6 Особенности жизненного цикла 17
1.1.7 Токсины В. thuringiensis- 20
1.1.8 Взаимоотношения паразит-хозяин " 23
1.2 Изменчивость у В. thuringiensis 26
1.2.1 Мутационная изменчивость 26
1.2.2 Рекомбинационная изменчивость 27
1.2.3 Диссоциативная изменчивость 29
2 Материал и методы исследования 38
2.1 Исходные штаммы и условия культивирования 38
2.1.1 Исходные штаммы 38
2.1.2 Условия культивирования 38
2.2 Флуктуационный тест Луриа-Дельбрюка 39
2.3 Определение параметров роста периодической культуры и динамики возникновения морфологических вариантов . 40
2.4 Определение выживаемости клеток в краткосрочных экспериментах 41
2.4.1 Выживаемость клеток при 40С 41
2.4.2 Исследование влияния химических инсектицидов . 42
2.4.3 Обработка клеток УФ-лучами 42
2.5 Анализ диагностических признаков R-форм 43
2.6 Исследование капсулы 46
2.7 Подвижность и хемотаксис 46
2.7.1 Приготовление вставок 46
2.8 Метод получения спонтанных мутантов, устойчивых к антибиотикам 47
2.9 Совместное культивирование штаммов 48
3 CLASS Результат CLASS ы 50
3.1 Исследование природы диссоциации у В. thuringiensis с помощью флуктуационного теста и анализа роста периодических культур 50
3.1.1 Особенности встречаемости R-вариантов в тесте Луриа-Дельбрюка у штаммов 49 и 2002 53
3.1.2 Особенности появления R-форм в периодических культурах при оптимальных условиях культивирования 60
3.1.3 Частота возникновения R-форм в оптимальных условиях 62
3.2 Влияние факторов среды на рост и динамику возникновения R-вариантов 64
3.2.1 Характер размножения и встречаемости R-вариантов в условиях культивирования при повышенном значении рН среды 64
3.2.2 Характер размножения и встречаемости R-вариантов в условиях культивирования при повышенной температуре 68
3.2.3 Действие УФ-лучей на возникновение R-вариантов 70
3.3 Скорость роста R-вариантов при оптимальной (28С) и повышенной (40С) температурах культивирования 72
3.4 Сравнительный анализ устойчивости к повышенной температуре клеток исходных S и R-вариантов 74
3.5 Выживаемость R-форм под воздействием УФ-лучей 76
3.6 Влияние химических инсектицидов на выживаемость и изменчивость S и R-вариантов 77
3.7 Сравнительный анализ R и S-форм по диагностически значимым признакам 80
3.7.1 Физиолого-биохимические свойства S и R-вариантов . 81
3.7.2 Отношение S и R-вариантов к антибиотикам пеницил-линового ряда 85
3.7.3 Споро-кристаллообразование у R-вариантов, возникших спонтанно и под действием факторов среды . 88
3.8 Анализ свойств, предшествующих споруляции 92
3.8.1 Исследование подвижности и хемотаксических реакций S и R-вариантов 92
3.8.2 Исследование способности к обмену генетической информацией между S и R-вариантами 98
3.9 Исследование обратного R—>S перехода 107
4 Обсуждение 116
Выводы 128
Список литературы 129
Приложения 151
- Внутривидовая классификация В. thuringiensis
- Анализ диагностических признаков R-форм
- Особенности встречаемости R-вариантов в тесте Луриа-Дельбрюка у штаммов 49 и 2002
- Споро-кристаллообразование у R-вариантов, возникших спонтанно и под действием факторов среды
Введение к работе
Актуальность работы. Одним из источников естественной изменчивости энтомопатогенного вида Bacillus thuringiensis {ВТ) является так называемая S-R диссоциация. В результате такой изменчивости в исходно кло-новых спорообразующих культурах бацилл возникают с частотой, существенно превышающей частоты спонтанных мутаций, аспорогенные или олигоспорогенные морфологические варианты. Значимость этого процесса у Bacillus thuringiensis заключается в том, что у диссоциантов скоординированно со спорообразованием нарушается процесс формирования кристаллов (5-эндотоксина, являющегося основным фактором вирулентности для насекомых-хозяев данного вида бацилл [116, 138].
Исследования последних лет с использованием разнообразных микроорганизмов, у которых наблюдается сходная изменчивость, предполагают, что возникновение подобной вариабельности имеет адаптивное значение и приводит к появлению форм, наиболее приспособленных к условиям окружающей среды [34, 76]. Для вида ВТ этот вопрос остается практически не разработанным. В основном, внимание исследователей уделяется кри-сталлообразующим формам, используемым в производстве энтомопатоген-ных биопрепаратов. Аспорогенным, акристаллическим вариантам, а также конкретно процессу диссоциации у ВТ посвящены немногочисленные работы, в которых описано явление расщепления в лабораторных культурах и исследованы некоторые свойства единичных диссоциантов в сравнении с исходными формами. Сведения, касающиеся причин, механизмов и биологического значения диссоциативной изменчивости вида В Т в литературе не найдены. Однако данные вопросы в последнее время вновь приобретают особую актуальность в связи с обнаружением существования аспо-рогенных вариантов ВТ в природных биоценозах [66, 177], возможности развития устойчивости у насекомых-вредителей к действию штаммов ВТ [190] и признанием ВТ как единого геновида с Bacillus antracis [141].
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение природы процесса диссоциативного расщепления клоновых культур ВТ и его эколого-генетической роли.
В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:
Исследовать природу и закономерности процесса расщепления с помощью флуктуационного теста и анализа роста периодических культур у двух штаммов ВТ, принадлежащих к разным подвидам, в оптимальных условиях культивирования.
Оценить влияние условий среды (температура, рН, УФ-лучи) и генотипа штаммов на процесс расщепления клоновых культур.
Определить значимость диссоциативного процесса, путем сравнительного анализа морфологических вариантов по двум комплексам признаков, одни из которых используются в диагностическом разграничении подвидов ВТ, а другие - обеспечивают большую адаптивность клеток микроорганизмов к меняющимся условиям среды.
Основные положения, выносимые на защиту: S-R диссоциация у Bacillus thuringiensis является проявлением мутагенеза стационарной фазы, существование которого показано для ряда микроорганизмов, в частности, Bacillus subtilis.
Процесс контролируется генотипом штамма и является реакцией на стрессовые условия среды: увеличение плотности популяции, накопление в среде продуктов обмена, изменение рН среды, повышение температуры культивирования, действие УФ-лучей.
Диссоциация у В Т увеличивает адаптивные возможности изогенных культур, генерируя разнообразные субклоны, отличающиеся от исходного типа главным образом по признакам, которые дают возможность клеткам в культуре адаптироваться к условиям существования: подвижности хемотаксису, компетентности и споруляции.
Наличие S и R морфологических вариантов в популяциях увеличивает эффективность обмена генетической информацией и формирования стабильных рекомбинантов между штаммами разных подвидов ВТ.
Научная новизна работы.
Впервые исследован характер и частота диссоциативного перехода у двух штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ с помощью флук-туационного теста Луриа-Дельбрюка. Показано, что частота данного процесса определяется генотипом штамма. Диссоциативные R-варианты отсутствуют в культурах при оптимальных условиях, а возникают в результате генетических событий в стационарной фазе роста в ответ на изменения условий среды.
Экспериментально установлено, что факторы среды (температура, рН среды, УФ-лучи) увеличивают частоту возникновения разнообразных дис-социантов, у которых в основном изменены признаки, не являющиеся значимыми диагностически, но имеющими важную роль в обеспечении выживаемости клеток в стрессовых условиях.
Впервые исследованы хемотаксические реакции на штаммах двух подвидов ВТ. Обнаружены качественные изменения в хемоответах клеток при S—>R переходе.
Показана значимость наличия альтернативных форм диссоциантов (S и R)) в увеличении эффективности рекомбинации у ВТ.
Практическая значимость. Установленный нами факт увеличения частоты диссоциативных форм с нарушенным споро-кристаллообразованием при повышении температуры, изменении рН среды необходимо учитывать в процессе производства биологических инсектицидов на основе ВТ.
Обнаруженные закономерности диссоциативного процесса важны для понимания взаимоотношений вида ВТ и насекомых-хозяев в экологической системе "паразит-хозяин-внешняя среда" и позволят более эффективно использовать бактерийные препараты для защиты растений.
В практике защиты растений необходимо учитывать, что совместное использование биологических инсектицидов на основе ВТ с химическими инсектицидами "Децис", "Кинмикс", "Арриво" и "Карбофос" может при- вести к снижению энтомоцидного эффекта бакпрепаратов из-за токсичного действия химикатов на клетки бацилл, которое было выявлено нами.
Результаты по эффективности обмена генетическими маркерами между спорообразующими и аспорогенными формами могут иметь значение для дальнейших исследований горизонтального переноса генетической информации у бацилл, а коллекция вариантов с нарушенным споро- и кристаллообразованием, полученная от двух штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ, может быть использована для изучения молекулярных механизмов их возникновения, генетического контроля процесса спорообразования и мутагенеза стационарной фазы..
Апробация работы. Результаты работы были представлены: на региональной конференции: "Биология-наука XXI века" (Пущино, 2002). на Всероссийских конференциях: "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 1999, 2000, 2001); "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе" (Иркутск, 2002). на международных конференциях: "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 1996); "Проблемы экологии. Чтения памяти профессора М.М. Кожова" (Иркутск, 2000); "Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно-преобразованных экосистем" (Иркутск, 2001); "Экология Южной Сибири" (Красноярск, 2001).
Основные положения диссертации представлены в статьях и тезисах. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из Введения, обзора литературы, экспериментальной части, Обсуждения и выводов. Результаты работы проиллюстрированы 19 таблицами и 19 рисунками, имеется Приложение. Список литературы состоит из 214 наименований (в том числе 107 на иностранных языках).
Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики Иркутского государ- ственного университета.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю -В.И. Чемериловой за ценные указания и помощь при выполнении работы.
За предоставление штаммов 49 и 2002 Bacillus thuringiensis, а также за предоставление сывороток к типовым О-антигенам искренне благодарна сотрудникам кафедры микробиологии ИГУ - к.б.н., доценту Т.В. Завезе-новой и к.б.н., доценту Г.Б. Талалаевой.
За внимание к работе, постоянные консультации и замечания автор признательна сотрудникам кафедры ботаники и генетики - зав.кафедрой к.б.н., доценту А. М. Зарубину, д.б.н., профессору Г. В. Гречаному, к.б.н., доценту Р. М. Островской, к.б.н. В. В. Чепиноге, а также зав. лабораторией экспериментальной биотехнологии НИИ биологии при ИГУ д.б.н., профессору Б. Н. Огаркову, зав. лабораторией генетической инженерии растений Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН д.б.н. Ю. М. Константинову.
За помощь в выполнении и оформлении результатов исследований благодарна Ю. Н. Яковлевой, Н. В. Зыряновой, студентам - М. Молоковой, Е. Серышевой, Е. Лебенко и Л. Маланушенко.
Внутривидовая классификация В. thuringiensis
Общепризнанная схема внутривидовой идентификации В. thuringiensis была разработана учеными H.De Barjac и A. Bonnefoli в институте Пастера (Париж) в 1962 г. [112]. Она основана на определении структуры жгутикового антигена и дополняется рядом физиолого-биохимических характеристик. К настоящему времени выделено и классифицировано 82 серова-рианта ВТ, отличающихся между собой не только таксономическими показателями, но и энтомоцидностью. Так как описание новых подвидов основано на структуре Н антигена, штаммы, ранее идентифицированные как подвиды dendrolimus и subtoxicus, считаются биоварами подвидов sotto и entomocidus [147, 151] (Таблица 1).Существуют и другие принципы внутривидовой классификации, например, К.-В. Joung и J.-C. Cote исследовали полиморфизм рестрикционных фрагментов 23S, 5S и 16S рРНК и на его основе выделили 8 филогенетических групп В. thuringiensis [152].
В зависимости от целей исследования штаммы ВТ дифференцируют разными методами на морфовары (по морфологии колоний) [29], на фаго-вары (по чувствительности к группе фагов) [7, 113], на кристовары (по характеристикам кристаллов) [13, 166], по соматическим антигенам [208], по спектру плазмид [113], по отношению к лектинам [122], на биовары или па-товары (по специфичности инсектицидного действия) [113]. С. Аптосоглоу и др. [109] предложили дифференцировать штаммы ВТ по характеристике белковых профилей целых клеток. Эти авторы разделили 77 штаммов на 28 электрофоретипов. Оказалось, что штаммы с идентичными полипептид -15 ными профилями образуют кристаллы одинаковой морфологии.
Бактерии вида Б Г широко распространены в природе и география их распространения постоянно расширяется в связи с открытием новых разновидностей.
Ареалами приуроченности известных серотипов ВТ считают следующие эколого-географические зоны: sotto, aizawai - Дальний Восток, dendrolimus - Сибирь, alesti - Европа, caucasicus - Кавказ, кепуае - Африка, entomocidus и finitimus - Северная Америка, israelensis - Израиль. Подвиды galleriae и thuringiensis признаются широко распространенными разновидностями без определенной эколого-географической локализации.
В Сибири чаще выделяются серотипы 4 и 5 [37]. Это подтверждается также данными Г.Б. Талалаевой, исследованиями которой, установлено, что наиболее распространенными биологическими вариантами вида В. thuringiensis в Южно-Сибирском регионе являются подвиды dendrolimus (серотип Н 4a4b), thuringiensis (серотип 1), galleriae (серотип Н 5а5в) [97].
До сих пор нет однозначного ответа о происхождении ВТ и его роли в окружающей среде. Ранее предполагали, что основным местообитанием кристаллообразующих бактерий являются насекомые [145]. К настоящему времени показано, что штаммы ВТ встречаются повсеместно. В. thuringiensis выделяют: из почвы, с поверхности листьев хвойных и лиственных растений, из различных насекомых, из пыли хранилищ [190]. Такие подвиды В. thuringiensis как israelensis, dacota, indiana и tohoruensis были выделены из почвы. Многие авторы считают, что обычным место обитанием ВТ является именно почва [125, 163]. М. Охба и Г. Аратаке [179] провели сравнительное выделение ВТ из подстилки В. тогі на шелководческих фермах и из почв вокруг них и выявили, что из подстилок выделяется ВТ серовара Н4ас, а из почв - НЗаЬс, H8ab, H4ab . Эти авторы соглашаются с выводами Смита и Куше, что ВТ входит в состав микрофлоры листьев растений [194]. Смирнова с соавт. [92] отмечают, что среди природных изо-лятов - компонентов филлосферы - преобладают штаммы, действующие на насекомых отряда Lepidoptera, питающихся листьями.
В Т встречается в различных звеньях биоценозов и выделяется не только из организмов членистоногих, но и с тех объектов, с которыми контактировали насекомые, а также из организмов животных имеющих тесные трофические связи с насекомыми [32]. Существуют работы, сообщающие о выделении ВТ из постельных клопов, аргасовых клещей и органов диких птиц [87]. Установлено, что споры этих бактерий способны выживать в рубце жвачных животных [108], в кишечнике птиц и мышевидных грызунов [192]. Имеются сообщения, что штаммы ВТ можно выделить их порошка перца [147] и воды спортивных бассейнов [140].
Клетки В. thuringiensis - палочки размером 0.8-1.3x3-6 мкм, одиночные или в цепочках, подвижные благодаря наличию жгутиков, длиной 6-8 мкм, расположенных перетрихиально. Для ВТ показано, что изолированные жгутики и клетки со жгутиками обладают адгезивной способностью к клеткам насекомых в культуре тканей [92]. Клетки имеют полисахаридную капсулу.
В лабораторных условиях на плотных питательных средах МПА и сходных по составу агаризованных средах клетки ВТ при размножении образуют крупные, плоско-зернистые, гладкие колонии от беловато-серой до розовой окраски. Край колоний волнистый или слабо ризоидный. Колонии в среду не врастают, в агаризованном столбике при посеве уколом -преимущественный рост на поверхности [63]. Являясь факультативными аэробами, представители вида жизнеспособны и в анаэробных условиях.
Природные штаммы ВТ обладают активными протеолитическими, ами-лолитическими и гемолитическими свойствами, не производят индол, уреа -17 зу на искусственных средах растут как сапрофиты, сбраживают глицерин, левулезу, глюкозу, мальтозу, трегалозу и крахмал, но не сбраживают ара-бинозу, ксилозу, галактозу, лактозу, маннит, дульцит и инсулин. Отношение к углеводам и другим источникам питания - признак вариабельный, встречаются большие отклонения. Многие штаммы для своего роста нуждаются в различных аминокислотах, иногда в витаминах [63]. Оптимальная температура роста составляет 28-35С, но организмы способны нормально развиваться в пределах от 10СС до 45С [51].
Анализ диагностических признаков R-форм
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штаммов 49, 2002 и выделенных от них R-вариантов определяли по общепринятым методикам [67, 70, 112].
Для изучения свойств колоний суспензии клеток после серии 10-кратных разведений рассевались на поверхности плотной среды LB. Колонии характеризовались по величине, форме, качеству поверхности, цвету.
Исследование спорообразования проводили на 10-е сутки. Предметное стекло с мазком фиксировали на пламени спиртовки, погружали в раствор красителя Comassie brilliant blue (0,25% Comassie brilliant blue, 50% этанола, 7% уксусной кислоты) на 3 мин., отмывали водой [191]. Готовый препарат анализировали под микроскопом Jenamed Carlzeiss Jena при увеличении 100x12,5.
Процент споро- и кристаллообразования определяли, визуально оценивая число проспорулировавших и сформировавших кристаллы клеток.
Для определения протеолитической активности делали посев в столбик мясопептонной желатины (МПЖ). Тест на желатине: к МПБ добавляли 15% желатины, после набухания расплавляли на водяной бане при 40-45С, устанавливали рН 7,0. Среду разливали в пробирки по 6 мл, стерилизовали. Застывшую среду засевали уколом на всю длину столбика МПЖ. Культивировали 10 дней при комнатной температуре. Отмечали степень разжижения желатины.
Для выявления лецитиназной активности среды готовили следующим образом: в стерильных условиях желток свежего яйца (предварительного вымытого в проточной воде и обработанного в 96 спирте) вносили в 500 мл стерильной и охлажденной до 50С LB, тщательно перемешивали и разливали по чашкам Петри. Посев культур делали радиальными штрихами. Наличие фермента лецитиназы определяли по гидролизу лецитина после трехсуточного выращивания, что внешне сопровождалось образованием молочно-белого ореола вокруг выросшей культуры.
Амилолитическую активность определяли по гидролизу крахмала. Готовили среду следующего состава (г/л): КН2РО4 - 0,5; MgS04 - 0,2; К2НРО4 -0,5; (NH4)2S04 - 0,2; агар-агар - 15,0; пептон - 20,0; дистиллированная вода до 1 л, конечный рН 7,2, после чего добавляли Юг. растворимого крахмала. Стерилизовали 30 мин при 0,5 атм. Стерильную среду разливали в чашки Петри и производили посев в виде квадрата 1x1см, реакцию учитывали через три дня инкубирования при 28С, заливая поверхность среды раствором Люголя [67]. Среда окрашивалась в синий цвет, за исключением зон гидролиза крахмала, которые оставались бесцветными или окрашивались в красновато-бурый цвет. Зоны гидролиза крахмала измеряли с помощью линейки.
Для определения характера роста в жидкой среде жидкую среду LB разливали в пробирки по 3 мл и автоклавировали 30 мин. при 0,5 атм. В каждую пробирку засевали клетки односуточной культуры с помощью петли. Культивировали в при 28С. Результаты учитывали на 7-е сутки культивирования. Уреазную активность определяли в среде, приготовленной следующим образом: в 100 мл горячей стерильной дистиллированной воды растворяли 4 г. сухой среды Гисса с лактозой и индикатором ВР, 0,1 г глюкозы и 1г. мочевины. Полученный раствор разливали в стерильные пробирки и стерилизовали 15 мин при 0,5 атм. В случае положительной реакции серовато-розовый цвет среды менялся на синий [67].
Для выявления потребностей в факторах роста использовали синтетическую минимальную среду Никкерсона и Буллы следующего состава (г/л): MgS04x7H20 - 0,3; MnS04x5H20 - 0,05; CuS04x5H20 - 0,0005; СаС12х6Н20 - 0,08; ZnS04x7H20 - 0,005; К2НР04 - 0,5; (NH4)2S04 - 2,0; Na3CeH507x5H20 - 2,0; глюкоза - 4,0; pH 7,0-7,2. В минимальную среду вносили а-аминокислоты в концентрации 20 мкг/мл и D-аминокислоты в концентрации 40 мкг/мл среды. Растворы аминокислот вносили после ав-токлавирования среды. На 20 мл среды вносили 0,1 мл аминокислот. Для определения бактериоциногенности тестируемые штаммы высевали штрихом на плотную среду LB и культивировали в течение 48 часов при 30С. Для инактивирования фагов посевы облучали УФ светом в течение 15-20 минут и заливали полужидкой средой LB с предварительно внесенными в нее клетками индикаторного штамма. В качестве индикаторного штамма использовали 24-часовую культуру штамма 49. Зоны подавления роста индикаторного штамма анализировали через 24 часа.
Для исследования антигенных свойств клеток были использованы иммунные диагностические О-сыворотки с известным титром антител. Для приготовления О-антигена культуры после суточного инкубирования на плотной среде смывали физиологическим раствором. Суспензию с концентрацией клеток 2х109 прогревали на кипящей водяной бане в течение двух часов. Исследование антигенных свойств опытных штаммов проводили капельной реакцией агглютинации с использованием одного из разведений сыворотки (1:50 или 1:100). Сыворотка №735 получена к типовому штамму В. thuringiensis subsp.thuringiensis, сыворотка №49 - к типовому штамму В. Наличие капсул исследовали методом Гинса-Бурри при этом каплю культуры, взвешенной в воде, тщательно перемешивали краем шлифовального стекла с раствором туши, затем делали тонкий мазок. Мазок высушивали, фиксировали смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) 15 мин и окрашивали по Гинсу карболовым фуксином. Затем просматривали под световым микроскопом [62].
Особенности встречаемости R-вариантов в тесте Луриа-Дельбрюка у штаммов 49 и 2002
С субкультурами штаммов 49 и 2002 суммарно было проведено по 4-6 вариантов флуктуационного теста, которые различались используемыми клонами, стартовой концентрацией клеток в культурах и условиями высева суспензии после культивирования в стандартных условиях. Результаты исследований по определению характера и частоты встречаемости R-вариантов в параллельных и общей (в нашем случае "усредненной сливанием") культурах штаммов 49 и 2002 приведены в Таблицах 3 и 4. В качестве исходной культуры в тесте прямого S— К перехода использовали клоны с четкой S-морфологией и нормальным уровнем споро- и кристаллообразования.
Во всех экспериментах наблюдали закономерную картину встречаемости морфологических вариантов. В качестве примера типичного распределения R-вариантов для двух штаммов в Таблице 3 приведены в сокращенном варианте результаты одного из экспериментов.
Исходно в данном опыте было внесено, согласно расчету, примерно по 2-40 кл/мл в отдельные пробирки с жидкой средой. После 24 часов размножения концентрация клеток в каждой культуре достигала максимальной плот ности и увеличивалась в среднем у штамма 49 до 1,8 ХІ08, а у штамма 2002 - до 0,6 х 108 кл/мл, то есть за этот период каждая культура проходила примерно по 20-26 циклов удвоения.
При анализе колоний, сформированных на плотной среде после высева индивидуальных культур, нами были обнаружены колонии с R-морфологией даже в такой небольшой по сравнению с опытами Луриа-Дельбрюка выборке, но не было встречено случая возникновения морфологических вариантов на ранних генерациях. Особенно это было заметно для штамма 49. В сумме среди 9204 проанализированных колоний, образованных клетками этого штамма, высеянными из индивидуальных культур на плотную среду LB, измененную морфологию имели 8 колоний, которые встретились только в 2-х культурах. Причем фактор размножения измененных форм можно было предполагать только для одной культуры, где 7 вариантов распределились равномерно по засеянным чашкам, и исходя из расчетов концентрации, могли возникнуть на 6 цикле удвоения культуры. Однако анализ 933 колоний, выросших после рассева на чашки с плотной средой общей культуры, составленной из смеси суспензий индивидуальных культур, не выявил колоний с R-морфологией, что не соответствовало теоретически рассчитанному из предположения присутствия размножившихся R-вариантов в этих двух индивидуальных культурах.
Реакция появления таких вариантов у данного штамма как бы запаздывала, что выражалось в более частом образовании секторных колоний. В описываемом эксперименте было отмечено 11 колоний, имеющих S-морфологию, но содержащих R-сектора разного размера (иногда до 1/2 колонии). Частота встречаемости варьировала в пределах 0,2-0,Зх10-2 и не коррелировала с числом проанализированных колоний. Секторные колонии могли возникнуть только при попадании клеток на плотную среду, т.е. при изменении условий культивирования. Возможно, они возникали в последних генерациях, находясь в составе еще не разделившихся цепочек клеток
По сравнению со штаммом 49, принадлежащим к подвиду dendrolimus, для штамма 2002 подвида thuringiensis, который достигал максимальной плотности при меньшей концентрации клеток, появление R-вариантов наблюдали в 50 % индивидуальных культур. Частота их встречаемости варьировала от 0,6х10-2 до 28,7х10 2. Кроме того у этого штамма с меньшей частотой формировались секторные колонии. Эти различия, по-видимому, определяются генотипом сравниваемых штаммов. Кроме того, в некоторых индивидуальных культурах штамма 2002 явно присутствовал фактор размножения измененных форм. Теоретический расчет ожидаемого числа колоний с S- и R-морфологией при высеве общей культуры (23,6 и 1,3 колоний на чашку, соответственно) не противоречил фактически полученному (27,9 и 0,6), но расчет возможного момента возникновения R-форм в индивидуальных культурах, в которых они обнаруживались, показывал, что измененные формы должны были существовать в этих культурах в исходный момент и не в единичном числе. Последнее, однако, маловероятно, так как, хотя и при высеве исходной суспензии была обнаружена одна колония с R-морфологией, но в выборке колоний большей, чем количество внесенных в культуры клеток. Этот факт можно было объяснить возникновением R-форм при высеве клеток на плотную среду, большей скоростью размножения по сравнению с S-формами или высокой частотой их возникновения в какой-либо момент культивирования.
Для избежания артефактов мы провели еще ряд экспериментов. Во всех экспериментах, суммированные результаты которых приведены в Таблице 4, наблюдали аналогичный характер распределения R-вариантов.
У штамма 49 частота встречаемости R-вариантов в опытах со сходными условиями культивирования варьировала в индивидуальных культурах незначительно и не зависела от количества пройденных генераций и количества проанализированных колоний. В большей степени она зависела от среды, на которую высевали суспензию. Так, в одном из экспериментов (Таблица 4) после размножения в стандартных условиях часть суспензии как индивидуальных так и общей культуры была высеяна на стандартную среду, а также на среду с неиспользованным нами ранее дрожжевым ав-толизатом. Посев в нестандартные условия вызвал достоверные (Р 0,05) различия в частоте встречаемости R-вариантов в индивидуальных и общей культурах по сравнению с высевом в обычные условия. Ни в одном опыте, проведенном с этим штаммом, не обнаружено достоверных различий между дисперсиями частот встречаемости R-вариантов в индивидуальных и общей культурах.
Штамм 2002 подвида thuringiensis отличался более высокой частотой встречаемости R-вариантов, большей дисперсией этих частот, что, по всей вероятности, определяется его генотипом, и тем, что R-варианты возникают у него в более ранние сроки культивирования. Только в двух экспериментах из шести были обнаружены достоверные (Р 0,05) различия между дисперсиями частот встречаемости морфологических вариантов в индивидуальных и общей культурах, да и то в тех случаях, где можно было предполагать присутствие R-вариантов с начального момента культивирования.
Споро-кристаллообразование у R-вариантов, возникших спонтанно и под действием факторов среды
Спорообразование является видовым признаком ВТ. Клетки этого вида переходят к формированию спор в конце логарифмической фазы, когда содержание питательных веществ в среде уменьшается. Известно, что в процессе диссоциации у ВТ возникают формы с нарушенным процессом споруляции.
В связи с этим мы проанализировали на способность к спорообразованию коллекцию R-вариантов, которая включала 57 R-форм штамма 49 и 204 R-варианта штамма 2002, возникших спонтанно и под воздействием факторов среды. Как отмечалось выше процесс споро- кристаллообразования у исходных S-вариантов штаммов 49 подвида dendrolimus и 2002 подвида thuringiensis завершается на третьи-пятые сутки и мазки, приготовленные из культур этого возраста, содержат массу свободных спор и кристаллов.
Микроскопирование культур R-вариантов, проведенное на 10-е сутки роста культур показало, что у всех выделенных морфологических форм в той или иной степени нарушен процесс споро- и кристаллообразования и часто клетки имели аномальную форму. Результаты ранжирования R-вариантов по степени нарушения образования спор представлены на рисунке 13 (А, Первая группа включала варианты, имеющие значительные нарушения споруляции. Культуры таких вариантов в возрасте 240 часов на 90-100% были представлены цепочками вегетативных клеток, наблюдался клеточный лизис, многие клетки имели неправильную изогнутую или извилистую форму (Рис. 13). У штамма 49 такие формы составляли 61,3%, у штамма 2002 - 37,7% от числа проанализированных. В данную группу попали все R-варианты штамма 49, выделенные при повышенной до 40С температуре и 50% таких форм штамма 2002.
У второй группы вариантов уровень спорообразования варьировал от 20 до 50%, также наблюдались лизис клеток и присутствие в мазках аномальных клеточных структур. Число R-форм в данной группе у штамма 49 составило - 29,8%, у штамма 2002 - 15,7%. Как у штамма 49, так и у штамма 2002 формы с таким уровнем нарушения споруляции почти в равной степени встречались и среди спонтанно возникших и среди R-форм, выделенных под воздействием УФ-лучей.
В третьей группе образование свободных спор достигало 50-80%. Доля таких R-вариантов среди проанализированной выборки штамма 49 составила 7%, 2002 - 46,6%.
Соотношение спор и кристаллов токсина практически у всех R-форм составляло 1:1, но в некоторых случаях количество кристаллов токсина могло превышать число спор или быть несколько меньшим.
Более детально соотношение спор и кристаллов исследовали на выборке R-вариантов штамма 49, выделенных под воздействием УФ-лучей. Мазки приготовлены на 10-е сутки культивирования. Результаты анализа приведены в таблице 11.
По результатам, приведенным в таблице 11, видно, что у исходного штамма 49 соотношение спор и кристаллов составляет 1:1, процент вегетативных клеток по отношению к спорам и кристаллам - 0,42, т.е. процесс спорообразования полностью завершился.
По соотношению спор и кристаллов проанализированные R-варианты не отличаются от исходного штамма, которое составляет также 1:1, за ис -91 ключением УФЯІЗ, у которого число спор достоверно превышает число кристаллов в 1,5 раза. Для R-форм характерно более высокое процентное соотношение вегетативных клеток относительно к спорам и кристаллам. Доля вегетативных клеток у R13 - 13,51% в 32 раза превышает их содержание в мазках исходного штамма 49. Самая большая доля - 100% у штамма y DR23, у которого споруляция полностью нарушена, близкими к нему являлись штаммы YORIO - 91,90%, УФШ - 83,06% и YOR22 - 81,97%.
Интересным фактом являлась определенная корреляция между цветом колоний, формируемых R-формами на среде и уровнем спорулирующих клеток в культуре. Так, варианты штамма 49, отнесенные к первой группе, формировали на плотной среде колонии серого цвета, у штамма 2002 аспо-рогенные формы имели серо-желтый цвет. Штамм 49 формировал, кроме того, прозрачные серые колонии, которые состояли из разрозненных вегетативных клеток правильной бациллярной формы, вероятно, появление таких колоний обусловлено действием литического фага. Наличие в клетках таких фагов показано для этого штамма [16]. Клетки, образующие 20-50% свободных спор, формировали на среде кремовые колонии у штамма 49 и серые у штамма 2002. Для третьей группы характерно образование светло-серых колоний штаммом 49 и светло-кремовых - 2002. R-варианты, отнесенные к четвертой группе, давали на среде колонии серо-белого цвета.
