Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 8
1.1 .Биология вида Bacillus thuringiensis 8
1.1.1 .История открытия, систематическое положение 8
1.1.2.Морфологические, культуральные и биохимические свойства Bacillus thuringiensis 12
1.1.3.Спорообразование у Bacillus thuringiensis 13
1.1 4. Биологически активные соединения, синтезируемые Bacillus thuringiensis 14
1.2.Экология ВТ 17
1.2.1 .Местообитание и распространение Bacillus thuringiensis 17
1.2.2.Изменчивость вида Bacillus thuringiensis'. мутационная, рекомбинационная, диссоциативная 26
1.2.3 .Внутривидовое разнообразие вида Bacillus thuringiensis 28
1.3.Системы подвижности и хемотаксиса у прокариот 30
2 Материал и методы исследования 38
2.1.Материалы 38
2.1.1 . Штаммы и условия культивирования 38
2.1.2.Эффекторы для тестирования хемотаксиса 39
2.2.Методы исследования подвижности и хемотаксиса 40
2.2.1.Метод исследования подвижности 40
2.2.2.Метод вставки для исследования хемотаксиса 40
2.2.2.1.Приготовление вставок для исследования хемотаксиса 41
2.3.Статистическая обработка результатов и фото-документирование 41
3 .Результаты и обсуждение 42
3.1 .Подбор условий для сравнительного изучения типов движения у штаммов Bacillus thuringiensis 42
3.1.1 . Влияние плотности среды и возраста культуры на характер колонизации 42
3.1.2.Стабильность проявления реакции движения на средах с 0,3% и 0,4% содержанием агара 45
3.1.3.Гетерогенность популяции клеток штамма 49 по реакции движения 47
3.2.Характер движения штаммов Bacillus thuringiensis на среде с 0,4% содержанием агара 48
3.3.Характер движения штаммов Bacillus thuringiensis на среде с 1,0% содержанием агара 58
3 4. Хемотаксис 67
3.4.1.Особенности проявления хемореакции у Bacillus thuringiensis 67
3.4.2.Анализ хемоответа штаммов дикого типа, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis, на разные эффекторы 70
3.4.3..Характер хемоответа штаммов дикого типа на природные соединения... 74
3.5.Взаимоотношения между штаммами Bacillus thuringiensis на среде, содержащей 0,4% агара 80
3.6.Особенности движения и хемотаксиса у диссоциативных R-вариантов Bacillus thuringiensis 83
3.6.1.Особенности движения диссоциантов на средах разной плотности 84
3.6.2.Хемотаксис у диссоциативных вариантов, полученных от штаммов разных подвидов Bacillus thuringiensis 87
Заключение 93
Выводы 99
Список использованной литературы 100
ПРИЛОЖЕНИЯ 121
- Биологически активные соединения, синтезируемые Bacillus thuringiensis
- Штаммы и условия культивирования
- Влияние плотности среды и возраста культуры на характер колонизации
Введение к работе
Актуальность исследования. Bacillus thuringiensis (ВТ) – хорошо известный вид энтомопатогенных спорообразующих бактерий, которые являются одним из естественных регуляторов численности насекомых и используются во всем мире в качестве биологических инсектицидов на протяжении более тридцати лет. Отличительной особенностью этого вида является формирование в бактериальной клетке в процессе споруляции белкового кристалла -эндотоксина. Признание ведущей роли этого токсина в гибели насекомых сфокусировало внимание большинства исследователей на данном признаке и обеспечило детальную изученность его молекулярной биологии, генетического контроля и механизма действия на личинок насекомых [Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты, 2001].
Намного меньше известно о других признаках этих бактерий, в частности, таких как подвижность и хемотаксис, имеющих первостепенное значение в обеспечении жизнеспособности и адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды. Исследований хемотаксиса у ВТ ранее не проводилось, а сведения о системе подвижности клеток крайне бедны. Только в последние годы отмечается повышение интереса к функционированию жгутикового аппарата клеток ВТ, несмотря на то, что его структура лежит в основе общепризнанной схемы внутривидовой идентификации штаммов данного вида [de Barjac, Frachon, 1990]. Такой интерес вызван появлением работ, указывающих, что экспортный аппарат жгутиков может быть одним из факторов вирулентности представителей вида ВТ для личинок насекомых-хозяев [Ghelardi et al., 2002; Bouillaut et al., 2005; , , 2006].
Накопившиеся к настоящему времени сведения о том, что бактерии вида Bacillus thuringiensis могут быть причиной серьезных оппортунистических инфекций человека и животных [Hernandez et al., 1998, Salamitou, 2000], а также молекулярно-генетические доказательства их близкого родства с таким патогенном как Bacillus anthracis [Helgason et al., 2000], выдвигают на первый план исследования поведения клеток ВТ при взаимодействии с компонентами окружающей среды, которое обеспечивается системами подвижности и хемотаксиса. Эти системы хорошо изучены у Escherichia coli и Salmonella enterica serovar Typhimurium, а для представителей вида Bacillus thuringiensis, невзирая на всю их экономическую важность, вопрос до сих пор остается открытым.
Цель настоящего исследования – изучить особенности колонизации сред разной плотности и хемотаксические ответы на ряд химических соединений и смесей у диссоциативных S- и R-вариантов штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis.
В задачи исследования входило: выявить особенности колонизации агаросодержащих сред разной плотности клетками штаммов 16-ти подвидов ВТ; исследовать хемотаксические реакции штаммов разных подвидов на химические соединения антропогенного и природного происхождения; изучить подвижность и хемотаксис у морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации исходных штаммов.
Научная новизна исследования состоит в том, что впервые экспериментально выявлена гетерогенность штаммов энтомопатогенного вида ВТ по способности колонизировать среды с разной плотностью и различия в стратегии колонизации этих сред, проявляющейся в дифференцировке разных типов клеток. Впервые исследованы хемотаксические реакции на ряд эффекторов у клеток десяти штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ. Обнаружены качественные изменения в хемоответах клеток морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации природных штаммов.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о разнообразии стратегий клеток Bacillus thuringiensis при колонизации сред с разной плотностью и возможном поведении их при контакте с различными компонентами природного и антропогенного происхождения.
Охарактеризованы коллекционные штаммы по подвижности на средах разной плотности и хемотаксису. Получена коллекция диссоциантов и мутантов, которая может быть использована для изучения генетического контроля типов дифференцировки клеток бацилл и системы хемотаксиса.
Защищаемые положения:
1. Клетки Bacillus thuringiensis различаются по способности и стратегии колонизации сред разной плотности.
2. Клетки штаммов разных подвидов Bacillus thuringiensis обладают хемотаксисом. Специфичность спектра аттрактантов и репеллентов для данных бацилл может отражать особенности их существования в природе.
3. Возникновение морфологических вариантов в процессе диссоциации увеличивает гетерогенность популяций Bacillus thuringiensis по подвижности и способности к хемоответу.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Всероссийских конференциях: «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 2001); «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); на Всероссийской школе по экологической генетике «Модификационная изменчивость в экологических взаимодействиях» (Санкт-Петербург, 2005); на III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 в журнале из перечня ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала, методов исследования, изложения и обсуждения результатов экспериментов, выводов и Приложения. Результаты работы проиллюстрированы 15 таблицами и 25 рисунками. Список использованной литературы включает 196 наименований, в том числе 141 на иностранных языках.
Биологически активные соединения, синтезируемые Bacillus thuringiensis
Штаммы ВТ являются патогенами для личинок многих насекомых. В настоящее время известно, что патогенное действие клеток ВТ на насекомых и широкое распространение его в различных зкологичесіоїх нишах обусловлено многочисленными токсичными компонентами, которые они вырабатывают. Основным токсином, обеспечивающим действие ВТ на личинок насекомых-хозяев, является, как общепризнано, кристаллический белковый 5-эндотоксин. Кроме него клетки ВТ способны синтезировать: термостабильный р-экзотоксин, у-экзотоксин и а-экзотоксин, экзоферменты с инсектицидной активностью, вегетативные инсектицидные белки, а также бактериоциноподобные вещества (турицины) [Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты, 2001, Aronson, Shai, 2001]. В настоящее время описано большое количество белковых 5-эндотоксинов, продуцируемых ВТ. Большинство генов 5-эндотоксина находится на плазмидах. Известно более 14 cry генов [Lereclus, 1993], кодирующих кристаллические инсектицидные белки [Srinivas, 1997]. Активация работы данных генов происходит во время стационарной фазы роста бактериальной клетки и контролируется различными механизмами: транскипционным, посттранскрипционным и посттрансляционным [Agaisse, Lereclus, 1995, Ваши, Malvar, 1995]. Синтезируемые в результате работы cry генов белки имеют довольно широкое определение. Cry-белок - это белок параспорального включения (кристалла), оказывающий экспериментально доказуемый токсический эффект на целевой организм или любой белок, который имеет очевидное сходство аминокислотной последовательности с известным Cry-белком [Crickmore, 1998].
Согласно классификации 5-эндотоксинов ВТ, существовавшей до 1998 г, токсины подразделяются на 4 группы: белки класса Cryl токсичны для чешуекрылых (Lepidoptera); Cryll - для двукрылых (Diptera) и чешуекрылых (Lepidoptera); СгуШ - для жесткокрылых (Coleoptera); CrylV - токсичны только для двукрылых (Diptera) [Crickmore, 1998].
Однако в настоящее время описаны несколько кристаллических белков ВТ, активных в отношении вредителей, не являющихся насекомыми [Каменек и др., 2000, Добрица и др., 2001].
Различные штаммы ВТ (часто даже из одного сероварианта) значительно отличаются по ширине спектра инсектицидного действия и токсичности продуцируемого ими белкового кристалла [Добрица и др., 2001].
Термолабильный 5-эндотоксин по химическому составу представляет собой гликопротеид, размером от 130 до 145 кДа. После обработки ферментами в кишечнике насекомого-хозяина остается "устойчивая сердцевина", размером в 60-70 кДа; это и есть «истинный токсин» [Lereclus, 1989, Grochulski, 1995]. Физиологические функции кристаллов в бактериальной клетке еще не выяснены, однако не исключено, что кристаллообразование может быть проявлением нерегулируемого синтеза белка (ов) спор [Азизбекян, 1990].
Доказано и широко известно, что особую роль в патогенезе насекомых играет термостабильный 3-экзотоксин. По данным некоторых авторов [Лескова, Рыбина, 1987], основными факторами, влияющими на синтез экзотоксина ВТ, являются дозы аминного азота и соотношение азотных и углеродных компонентов в питательной среде. Показано, что интенсивность токсинообразования снижается после многократных пересевов.
Пока еще мало изученными остаются на данный момент у-экзотоксин и а-экзотоксин.
Экзоферменты: лецитиназа, протеазы, хитиназы и вегетативные инсектицидные белки, как известно, вносят значительный вклад в патогенную активность клеток ВТ [Lovgren et al., 1990, Zhang, 1993, Estruch et al, 1996]. Экспрессия генов, отвечающих за синтез данных специфичных факторов вирулентности у ВТ, находится под контролем плейотропного регулятора PlcR, активация plcR генов происходит в стационарную фазу роста бактериальной клетки [Agaisse et at, 1995, Gominet et al., 2001, Slamti, Lereclus, 2002]. К синтезу лецитиназы (фосфолипаза С), отвечающей за проникновение бактерии в организм насекомого-хозяина, способны около 60% всех известных подвидов ВТ [Неудачина, 1979]. Также клетки ВТ вырабатывают внеклеточные протеазы (сериновая и металлопротеиназы) [Честухина, 1990] и хитиназы [Sampson, Gooday, 1998], которые играют существенную роль в активности 5-эндотоксина, активируя его.
Вегетативные инсектицидные белки (VIP) не образуют кристаллов и секретируются во время роста клеток некоторых штаммов ВТ. В настоящее время известны белки VIP 1А, VIP 2А, VIP ЗА, последний из которых, при скармливании его насекомым, вызывает паралич кишечника и лизис эпителиальных клеток [Schnepf etal, 1998]. На данный момент способность к синтезу антибиотических (бактериоциноподобных) веществ отмечена у отдельных штаммов практически всех подвидов ВТ, однако роль их в патогенезе насекомых-хозяев ВТ до сих пор неизвестна [Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты, 2001].
Штаммы и условия культивирования
Исходным материалом для вставок послужили: растворы: 7,5хЮ"2М СаС12). Ю_1М КС1, 10%NaOH и 60% раствор NaHC03 (рН 9), 10"2М этанола (96%), 10" М растворы аминокислот: триптофана, валина, аланина, лейцина. Вещества антропогенного происхождения: нефтепродукты ортоксилол и гексадекан (цетан), гуминовый препарат «Гумат-80», растворы химических инсектицидов с торговыми марками: "Кинмикс", "Децис", "Арриво" и "Карбофос", обладающие энтомоцидной активностью против таких насекомых как белянки, яблоневая моль, различные пяденицы, коконопряд-колечник, листовертки, колорадский жук, гусеницы совок. Использовали растворы бетациперметрина («Кинмикс») в концентрации 3 мл на 10 л воды, растворы дельтаметрина («Децис»), циперметрина («Арриво»), сложного эфира дитиофосфорной кислоты («Карбофос») - в концентрации - 2 мл препарата на 10 л воды.
Природные соединения - водные вытяжки из: хвои лиственницы (Larix sibirica Ledeb.), сосны (Pinus sylvestris L.), кедра {Pinus sibirica Du Tour), пихты {Abies sibirica Ledeb.), ели {Picea obovata Ledeb.) и туи {Thuja occidentalis L.) и листьев березы {Betula pendula Roth), тополя {Populus balsaminefera L.), яблони {Malus baccata (L.) Bakh), боярышника {Crataegus sanguinea Pall.), рябины {Sorbus sibirica Held.), шиповника {Rosa rugosa Thunb.), черемухи {Padus avium Mill.), ивы {Salix behbiana Sarg.), ирги {Amelanchier ovalis Medik.), барбариса (Berberis vulgaris L.), черники (Vaccinium myrtillus L.), жимолости (Lonicera edulis Turez. ex Freyn), облепихи (Hippophae rhamnoides L.), малины (Rubus ilaens L.). Для сравнения нами были взяты образцы хвои и листвы одного и того же вида растений, но из разных биоценозов: г. Иркутск; окрестности деревни Выдринка (Иркутская обл.); побережье Малого моря окрестности поселка Большие Коты (оз. Байкал).
Для исследования подвиясности штаммов ВТ за основу были взяты условия экспериментов, описанных Hershey и Matsuyama [Hershey, Matsuyama, 1994] для E.coli. Шести часовую культуру клеток, выросших в 2 мл жидкой LB, высевали методом укола в центр чашки Петри со средой, содержащей 0,4% или 1,0% агара. Учет зон колонизации среды клетками бактерий проводили через 18, 24 часа или по мере необходимости через более длительное время. Измеряли зону колонизации среды с помощью бинокуляра "МБС-9" и объект-микрометра при увеличении 8x06 линейкой с ценой деления 1,7 мм. Край колонии исследовали с помщью микроскопа МБИ-9 при увеличении 20x12,4.
Для исследования хемотаксиса использовали модифицированный метод Tso и Adler [1974]. Клетки выращивали в течение 12 часов в 15 мл жидкой LB. Центрифугировали 5 мин при 3000-4000 об/мии, затем ресуспензировали в хемотаксисном буфере следующего состава: 10 мМ NaH2P04 - 120 мг, КҐ М ЕДТА - 23 мг, Н20 (диет.) - 1000 мл (рН 7,6) и разбавляли 0,4% раствором агарозы (Serva): 1000 мг на 250 мл Н20. Предварительно на чашку Петри помещали вставку диаметром 5 мм, содержащую химически тестируемое вещество в 1,5% растворе агарозы: 1000 мг на 66 мл Н20. Суспензию клеток в агарозе выливали на чашку Петри со вставкой. Реакцию клеток оценивали через 24 часа инкубации при 28С. Зону просветления вокруг вставки - если вещество репеллент или зону плотного скопления клеток вокруг вставки - если вещество аттрактант измеряли под бинокуляром "МБС-9" при увеличении 8x06 линейкой с ценой деления 1,7 мм. Вещество считали нейтральным, если мутность вокруг вставки не менялась.
Влияние плотности среды и возраста культуры на характер колонизации
Анализируя причины наблюдаемых различий в характере поведения штаммов на средах с низкой плотностью, мы исследовали состояние культур, выращиваемых в жидкой среде в течение 6 и 24 часов, и промикроскопировали зоны колонизации через 18 и 24 часа после инокуляции клеток в полужидкую среду.
Как было установлено, скорость колонизации полужидкой среды не была связана со скоростью размножения культур в жидкой среде. Так, например, штаммы 49 и 2002 не отличались достоверно по характеру размножения в жидкой среде LB в условиях периодической культуры. Время удвоения концентрации клеток штамма 49 в фазу логарифмического роста составило 0,8±0,11 часа, а клеток штамма 2002 - 0,8±0,07 часа. К 24 часу в обеих культурах концентрация клеток в среднем одинаково достигала максимального значения 2,4х108 кл/мл. Однако, как видно из результатов, представленных в таблице 5, зоны колонизации среды этими штаммами достоверно различались (р 0,001).
Результаты микроскопического анализа показали, что все исследованные клоны можно было условно подразделить на 4 типа по характеру распространения в полужидкой среде и типу дифференцировки клеток ВТ. Клоны первого типа были способны эффективно колонизировать среду за счет дифференцировки быстроплавающих коротких одиночных клеток, передвигающихся только в поверхностном слое среды. Такой тип колонизации был характерен для большинства клонов, принадлежащих к штаммам 1010 ssp. кепуае, 1000 и 2-1 ssp. galleriae, 49 ssp. dendrolimus, 1122 ssp. canadensis и 1120 ssp. toumanoffi. Эти клоны отличались относительно высокой скоростью продвижения зоны колонизации (2 - 3 мм/час), значительным ее диаметром к 18 часу культивирования и формированием характерного ободка по краю (рис.4А). Этот тип колонизации был характерен и для клеток штамма 805 ssp.caucasicus.
Для второго типа клонов было характерно формирование длинных нитевидных клеток, способных расти только на поверхности среды с 0,4% агара, образуя вокруг плотной центральной зоны роста как бы «венец» из выступающих нитей. В жидкой среде шестичасовая культура содержала неподвижные клетки нормального размера, а в 24-ти часовой культуре дополнительно появлялись длинные нитевидные клетки. Такой тип был характерен для всех клонов штамма 1009 ssp. aizawai, которые не были способны эффективно колонизировать среду с низкой плотностью (рис.2).
Клоны третьего и четвертого типов отличались от первых двух тем, что колонизировали эффективно толщу среды. Клоны третьего типа (штаммов 1008 ssp. morrisoni, 1007 ssp tolworthi, 2-1 ssp. galleriae, 1093 ssp. kurstaki, 2002 ssp thuringiensis) на среде с полужидким агаром формировали зоны с более плотным ростом в месте укола, но край зоны и его вид были неотличимы от «быстроколонизирующих» среду клонов (рис.4, штамм 1007). В высеваемой шестичасовой культуре наряду с подвижными мелкими клетками наблюдали слабо подвижные или чаще неподвижные клетки. Встречали нитевидные клетки или цепочки из 5 клеток. На поверхности полужидкой среды по краю зоны наблюдали одиночные неподвижные клетки, а подвижные клетки чаще встречались в толще среды, что не было характерно для штаммов первой группы. Также в глубине среды наблюдали отходящие от места укола и интенсивного роста одиночные длинные нитевидные клетки.
Клоны штаммов 4кс ssp alesti, 1075 ssp. darmstadiensis, 1003 ssp. entomocidus, 1004 ssp subtoxicus (четвертый тип) формировали зону колонизации иной морфологии (рис.4С), которая отличалась отсутствием характерного ободка по краю.
