Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS 7
1.1. История изучения энтомопатогенных микроорганизмов 7
1.2. Современные представления о филогении, классификации и биологии вида Вас. thuringiensis. . Биология вида Bacillus thuringiensis 26
1.3. J. Морфология 26
1.3.2. Культуральные особенности Bacillus thuringiensis 29
1.3.3. Физиология Bacillus thuringiensis 29
1.4. Токсины Bacillus thuringiensis и механизм их действия на насекомых 30
1.4.1. Энтомоцидные кристаллы 30
1.4.2. Механизм действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis 40
1.4.3. Термостабильный ттомоцидный токсин 43
1.4.4. Фосфолипидьи протеазы и другие метаболиты 44
1.5. Особенности инфекционного процесса, вызванного Bacillus thuringiensis у насекомых 45
1.6. Функционирование энтомопатогенных кристаллообразующих бактерий в популяции вредителя 50
1.7. Эколого-географические особенности распространения^ВасШив thuringiensis 54
Глава 2. ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЙ ОБЗОР ПРИРОДНОЙ ЗОНЫ КАМЧАТКИ. ЭНТОМОФАУНА КАМЧАТКИ 63
Глава 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 66
3.1. Объекты исследования 66
3.2. Методика сбора патологического материала 67
3.3. Методика бактериального анализа 69
3.4. Изучение морфолого-культуральных признаков 69
3.5. Изучение физиолого-биохимических признаков 70
3.6. Изучение серологических признаков 72
3.7. Изучение антагонистических свойств исследуемых культур 75
3.8. Определение продуктивности исследуемых штаммов 76
3.9. Определение биологической активности 78
ЗЛО. Спектрофотометрическ'ій метод определения /?-экзотоксина 80
3.11. Определение экзотоксигенности на личинках комнатной мухи (Musca domestica L.) и большой пчелиной огневки (Galleria mellonella L.) 81
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 85
4.1. Распространение Bacillus thuringiensis в различных звеньях лесного биоценоза 85
4.1.1. Встречаемость Bacillus thuringiensis в различных объектах исследования 85
4.1.2. Штаммы Bacillus thuringiensis, циркулирующие при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia larickola Karl.) 91
4.2. Морфологические особенности камчатских штаммов 95
4.3. Культуральные признаки исследуемых штаммов 112
4.4. Физиолого-биохимические признаки камчатских штаммов 1 ] 5
4.5. Серологические свойства камчатских штаммов 130
4.6. Продуктивность исследуемых штаммов 146
4.7. Биологическая активность камчатских штаммов 151
4.8. Действие ^экзотоксина камчатских штаммов на личинок комнатной мухи (Musca domestica L.) и большой пчелиной огневки (Galleria mellonella L.) 163
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 172
ВЫВОДЫ 177
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 179
ПРИЛОЖЕНИЯ 192
- Культуральные особенности Bacillus thuringiensis
- Изучение физиолого-биохимических признаков
- Штаммы Bacillus thuringiensis, циркулирующие при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia larickola Karl.)
Введение к работе
Энтомопатогенные, бактерии вида Bacillus thuringiensis — самые
распространенные агенты биологического контроля насекомых - эс|э<фективны не только против Lepidoptera, Homoptera, Coleoptera, Diptera, ZZ>ictyoptera, Mallophaga, но и против нематод {Strongylida, Tylenchidd), клещей {Acari), Digenea, Protozoa {Diplomonadidd).
Каждый год производится 13 000 тонн бактериальных препарат<=> в на основе Bacillus thuringiensis. Препараты не представляют опасности для ~m-^. еловека и теплокровных и могут успешно использоваться для регулирования чиг елейности насекомых, наносящих вред сельскому и лесному хозяйству. Также безопасны для использования в водной среде, где применяются против* JDiptera-переносчиков вирусных и паразитарных болезней (по данным IPCS, 1 *?99).
Избирательность действия различных разновидностей Вас. thz ълг-ingiensis обусловлена специфическим связыванием растворенного S-эндо токсина с аффинным к нему белком, экспонированным на поверхности аіггикальньїх мембран эпителиальных клеток кишечника восприимчивых ^-іасекомьіх (Hofmannetal., 1986, 19S8).
Споры Вас. thuringiensis могут длительное время сохраняться в э косистеме при постепенном уменьшении концентрации, как компонент естественной микрофлоры. Токсины Вас. thuringiensis инактивируются в почве в течение нескольких дней или часов другими микроорганизмами.
Для производства большинства бактериальных препаратов и:
руживаются в составе нормальной микрофлоры здоровых насекомых. Вас. thu-ringiensis может быть выделен из почвы, воды, с поверхности растений и других субстратов, с которыми контактируют насекомые. Высокая частота встречаемости и обширный спектр насекомых-хозяев свидетельствует об участии Вас. thuringiensis в естественном регулировании численности насекомых.
Нами впервые проведены исследования по выявлению и распространению энтомопатогенных бактерий вида Вас. thuringiensis в биоценозах Камчатки. Эти исследования представляют интерес в связи с тем, что энтомофауна полуострова Камчатка очень своеобразна благодаря его палеографии. Камчатка неоднократно отделялась от материка, превращаясь в остров. Оледенения почти полностью уничтожили третичную фауну полуострова, но в послеледниковое время она во многом развивалась и развивается как островная фауна. В настоящее время Парапольскии дол, расположенный на севере, препятствует проникновению лесных форм из соседних материковых зон.
Такая изолированность Камчатки от материка, характер формирования энтомофауны полуострова предполагают и распространение в этом регионе определенных разновидностей Вас. thuringiensis', тесно связанных паразитическими взаимоотношениями с насекомыми. При обследовании энтомофауны лесных и сельскохозяйственных биоценозов Елизовского, Мильковского и Пенжинского районов Камчатки для бактериологического анализа были взяты здоровые, больные и погибшие особи следующих отрядов: Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Diptera. При проведении исследований обнаружена естественная эпизоотия в популяции лиственничной мухи Hylemyia laricicola Karl.) на р. Таловка в Пенжинском районе, вызванная Вас. thuringiensis. Кроме того, бактериологическому анализу были подвергнуты особи класса паукообразных (Arachnida), моллюски класса брюхоногих (Gastropoda), дождевые черви (Oligochaeta). Для микробиологических исследований также собирались образцы почв, лесной подстилки, коры и листьев различных растений.
Целью исследований явилось изучение экологических особенностей Вас. thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки, а также выделение Lepidopterar и Diptera-акгивнык штаммов Вас. thuringiensis.
В задачи исследований входило:
1 .Изучить распространенность Вас. thuringiensis в биоценозах Камчатки.
2.Провести сравнительное исследование морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств выделенных штаммов Вас. thuringiensis.
3.Изучить серологические свойства выделенных штаммов.
4.0пределить продуктивность культур Вас. thuringiensis
5.Изучить биологическую активность и выявить спектр патогенности выделенных культур.
Новизна и научная ценность работы. Впервые исследованы лесные и сельскохозяйственные биоценозы Камчатки с целью выявления энтомопатогенных бактерий вида Вас. thuringiensis. Выявлено, что в биоценозах Камчатки циркулируют различные сероварианты: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus, canadensis. Доминирующим серовариантом является ssp. dendrolimus.
При изучении естественной эпизоотии лиственничной мухи {Hylemyia laricicola Karl), обнаруженной в Пенжинском районе Камчатской области, установлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus. Выделенные культуры отличались продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, ферментативной и биологической активностью. Среди изученных штаммов выявлен внутривидовой антагонизм. Отдельные особи насекомых явились источником выделения нескольких биотипов Вас. thuringiensis. При изучении эпизоотии обнаружен экзотоксигенный штамм 3-го сероварианта.
Высокопродуктивные и высоковирулентные штаммы выделялись не только из погибших, но и из живых особей восприимчивых и невосприимчивых видов, входящих в различные звенья трофической цепи: "кормовое растение - фитофаги -зоофаги - некрофаги".
Обнаружены штаммы Вас. thuringiensis^ обладающие необычной морфологией. Штамм К 56 (ssp. dendwlimm), выделенный из имаго березового пилильщика (Cimbex femorata Schrank), образует включения исключительно овоидной формы. Неидентифицированный штамм К 17-3, выделенный из комара-долгоножки (сем. Tipulidae), формирует крупные кристаллы, плотно прилегающие к споре одной из своих граней. Оба штамма оказались непатогенными по отношению к личинкам чешуекрылых.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований выделены Lepidoptera-aKmBiihiQ штаммы, пригодные для производства бактериальных препаратов и экзотоксигенный штамм, эффективный по отношению к двукрылым и чешуекрылым, который может быть использован в качестве продуцента бактериального препарата широкого спектра действия. Для культивирования Вас. thuringiensis с целью удешевления питательной среды предложена среда на основе экстракта дождевых червей (красного калифорнийского гибрида), используемого в качестве белкового компонента. Оформлены документы на получение патента.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений" (Велегож, 1989); на региональных конференциях: "Энтомологические проблемы Байкальской Сибири" (Иркутск, 1997), "Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование" (Иркутск, 1999); на Российской научно-практической конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе" (Иркутск, 2002).
Культуральные особенности Bacillus thuringiensis
Культуральные особенности Bacillus thuringiensis на некоторых агаризованных средах составляют их важную отличительную особенность от других видов.
На МПА и сходных по составу агаризованных средах образуют круглые, плоские, гладкие колонии. Окраска колоний - от беловато-серой до розовой; колонии в среду не врастают. Край колоний гладкий, волнистый или слабо-ризоидный, при микроскопии — ризоидный с отходящими тяжами.
В агаровом столбике при посеве уколом - преимущественный рост на поверхности. На ломтиках картофеля - рост обильный, в большинстве случаев беловато-кремовый, без складок и морщин с брыжеечным характером, что свойственно бактериям группы Вас. subtilis-mesentericus.
Столбик желатины разжижается достаточно интенсивно и равномерно с поверхности. В МПБ - сильное помутнение с просветлением и образованием плотного придонного осадка. Образование пленки - гладкой, не плотной -отмечается сравнительно редко (Африкян, 1973).
Бактерии вида Bacillus thuringiensis, как правило, обладают активными протеолитическими, ал.илолитическими и гемолитическими свойствами. Весьма характерно также и образование фосфолипазы С у большинства штаммов.
Денитрификация и реакция ВП положительны, индол не образуют.
Обычно усваиваются с образованием кислоты без газа: глюкоза, трегалоза, фруктоза и глицерин. Не усваиваются: арабиноза, ксилоза, галактоза, лактоза, маннит, дульцит и инулин. Большинство штаммов не обладают инвертазой. Отношение к углеводистого питания — признак вариабельный, встречаются большие отклонения (Африкян, 1973).
Культуры Вас.thuringiensis нуждаются для своего развития в различных аминокислотах, отмечается и потребность в витаминах. По данным Багдасарян С.Н. (1998), наиболее важным для роста серотипа thuringiensis являются аргинин, аланин, метионин, треонин, аспарагиновая и глутаминовая кислота; для sotto-dendrolimus аргинин, гистидин и глутаминовая кислота; для galleriae - гистидин, аланин, аргинин, глутаминовая кислота; caucasicus - аргинин, гистидин и глутаминовая кислота; alesti - аргинин, метионин, гистидин; entomocidus - аргинин, гистидин, метионин, валин; tolworthi - треонин, аргинин, аспарагиновая кислота; morrisoni - валин, треонин, аспарагиновая кислота.
Значительных штаммовых различий в витаминном питании не выявлено. В этом отношении для отдельных серотипов витаминная зависимость может быть полезным дополнительным признаком при их идентификации. К таковым следует отнести тиаминную зависимость культур серотипа thuringiensis, потребность в никотиновой кислоте для серотипа galleriae.
Токсическое действие энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis обусловлено комплексом факторов. Прежде всего, это - образование энтомоцидных кристаллов, растворимых экзотоксинов, ферментов, а также других физиологически активных микробных метаболитов. Образование особых параспоральных включений в культурах спороносных бактерий Bacillus thuringiensis неоднократно отмечалось рядом исследователей еще задолго до установления их роли в энтомопатогенном действии. Впервые Хенней (Наппау, 1953) указал на возможную связь этих образований с энтомоцидным действием продуцирующих их бактерий.
Эндотоксин составляет 30 % сухой массы клетки. Кристаллический белок имеет аминокислотный состав, обычный для других бактериальных белков, хотя наиболее представлены глутаминовая и аспарагиновая кислоты, составляющие 25 % от общего количества. Разные подвиды мало отличаются по количественному составу и соотношению аминокислот. Белок кристаллов является сложным (гликопротеин) и содержит более 5 % углеводов, включая аминосахара, которые могут участвовать в связывании токсина с рецепторами клеток насекомых.
Синтез параспорального кристалла начинается на II стадии споруляции, достигая максимума на IV стадии.
Физические и биохимические функции кристалла в бактериальной клетке неизвестны, однако н; исключено, что кристаллообразование является результатом нерегулируемого синтеза белков споровых покровов. Обнаружен белок, локализованный на внутренней стороне экзоспориума и споровых покровов, которые сходны по молекулярной массе, аминокислотному составу и антигенным характеристикам с белком кристалла.
По мнению Азизбекяна P.P. (1990), матрицей для сборки кристаллов могут служить клеточные мембраны, обеспечивающие фиксацию центра кристаллизации независимо от их топографии. Вместе с тем, учитывая склонность белка токсина к агрегации, необходимость матрицы для кристаллизации сомнительна.
Закономерности формирования параспоральных кристаллов из 5-эндотоксинов различных патотипов Bacillus thuringiensis сходны и зависят от таких общих для кристаллообразования биологических макромолекул параметров, как рН, ионная сила растворов, молекулярная масса белков, составляющих кристаллы, вторичная и третичная структура этих белков (Солонцов, Юдина, 1996).
Параллельно идущие процессы споро- и кристаллообразования завершаются лизисом спорангия и разъединением спор и кристаллов. Однако у штаммов Bacillus thuringiensis ssp. finitimus спора и кристалл соединены друг с другом.
Молекулярные механизмы связи процессов споро- и кристаллообразования неясны. Экспериментально получены аспорогенные мутанты, сохраняющие способность к синтезу кристаллов (Азизбекян, 1990).
Эндотоксин представляет из себя кристалл, состоящий из белковых субъединиц элипсоиднсй формы, связанных между собой дисульфидными связями.
Параспоральные кристаллы обычно состоят не менее, чем из двух видов 5-эндотоксинов, часто отличающихся по интенсивности, специфичности инсектицидного действия. Соотношение этих 8-эндотоксинов в кристаллах может меняться в зависимости от состава сред, условий культивирования и других факторов, влияющих на экспрессию генов (Юдина и др., 1992; Олехнович и др., 1992).
Изучение физиолого-биохимических признаков
Исследования по выяснению морфоструктуры вегетативных клеток, спор и кристаллов выделенных штаммов производили при помощи трансмиссионного (просвечивающего) электронного микроскопа BS - 540 фирмы "Tesla" с разрешающей способностью 10 Е и увеличением до 150 000.
Для приготовления препаратов готовили суспензии бактериальных культур в стерильной воде. Культуральные взвеси наносили бактериальной петлей на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой. Коллодиевая подложка готовилась следующим образом: на дно чашки Петри, наполненной до 2/3 объема дистиллированной водой, помещали предметное стекло, на котором располагали медные сетки диаметром 3 мм. На поверхность воды наносили 2 капли 1,5 % раствора коллодия в амилацетате. После растекания капли амилацетат испарялся, и на поверхности воды оставалась коллодиевая пленка толщиной до 200 А. Вода откачивалась с помощью шприца и пленка оседала на сетки.
После нанесения культуральных суспензий на сетки, препараты высушивались на воздухе и оттенялись хромом под углом 45.
Полученные результаты фиксировались на сверхконтрастных спектрографических пластинках чувствительностью 5 ед.
Для описания колоний и роста по штриху культуры выращивали на МПА. На МПБ определяли характер роста, наличие пленки, осадка и помутнение среды.Для дифференциации культур Вас. thuringiensis используются данные сравнительной характеристики и стабильности различных физиологических тестов: образование ацетил мети л карбинола, лецитиназы, уреазы, протеолитических и сахаролитических ферментов; ферментация салицина, эскулина, крахмала.
Для исследования способности образовывать АМК использовали среду Кларка следующего состава (%): глюкоза - 1,0; пептон - 0,5; К2НРО4 - 0,1; вода водопроводная. Стерилизовали при 0,5 атм. 30 мин. Засевали и культивировали в течение 7-10 суток.
Ацетоин обнаруживали по реакции Фогес-Проскауэра, которая основана на том, что в щелочных условиях ацетоин окисляется в диацетил, реагирующей с гуанидиновои группой f V_ аргинина, содержащегося в пептоне.
Образуется комплексное соединение, окрашенное в красный цвет. Для выполнения реакции в пробирку с культурой добавляли 1 мл свежеприготовленного 10%-ного спиртового раствора а-нафтола и 20%-ного водного раствора КОН. Появление красного кольца на поверхности культуральной жидкости свидетельствует о наличие ацетоина.
Определение лецитиназной активности проводили на желточно-солевой среде. К 100 мл стерильного физиологического раствора добавляли один яичный желток. Перед извлечением желтка вымытое куриное яйцо выдерживали в течение 20 мин. в спирте. Полученную среду разливали в стерильные пробирки. Результат учитывали на 1-3 сутки.
При наличии лецитиназы наблюдается образование на поверхности среды плотного сгустка из нерастворимых жирных кислот. На этой же среде учитывали образование пигмента.
Для определения уреазной активности готовили среду следующего состава (%): пептон - 2,0; NaCl - 2,0; КН2Р04 - 2,0; глюкоза - 1,0. Все компоненты растворяли в 100 мл воды и после этого добавляли 1 г мочевины. Стерилизовали дробным способом. Гидролиз мочевины, происходящий при наличии у культуры уреазы, сопровождается изменением рН среды. Щелочную реакцию среды определяли раствором фенолфталеина.
Протеолитическую активность штаммов выявляли при их росте на МПЖ и на обезжиренном молоке.
Для приготовления МПЖ к МПБ добавляли 10-15 % желатины, оставляли на 20-30 мин., чтобы желатина набухла, затем смесь нагревали на водяной бане до полного растворения желатины, разливали по пробиркам и стерилизовали при 0,5 Атм. Продолжительность культивирования 5-7 суток. Разжижение желатины или его отсутствие отмечали визуально.
Для выявления казеинолитических ферментов обезжиренное молоко разливали по пробиркам, стерилизовали при 0,5 Атм; производили посев- и культивировали в течение 5-7 суток. Протеолиз выражался в постепенной пептонизации казеина молока. Способность ферментировать углеводы определяли на среде следующего состава (%): пептон - 0,5; К2НРО4 - 0,1. Углеводы готовили в виде 10%-ных водных растворов и стерилизовали отдельно от основного фона среды при 0,5 Атм. Стерильные растворы добавляли к основному фону в таком количестве, чтобы концентрация составила 1 г на 100 мл. Для обнаружения изменения рН добавляли бромкрезолп; рпур из расчета 0,2 мл 1,6 %-ого спиртового раствора на 100 мл среды.
Для изучения свойства потреблять салицин использовали среду следующего состава (%): пептон - 1,0; NaCl - 0,5; салицин - 1,0. Для обнаружения изменения рН добавляли бромтимолблау из расчета 0,2 мл 1,6 %-ого спиртового раствора на 100 мл среды.
Способность использовать эскулин выявляли на среде следующего состава (%): эскулин - 0,1; лимоннокислое железо - 0,1; пептон - 2; агар-агар - 3.
Посев производили уколом в чашки Петри, при положительной реакции вокруг укола образуется почернение.
Дія выявления амилолитической способности использовали среду следующего состава (%): пептон - 1,0; КН2Р04 - 0,5; растворимый крахмал - 0,2; агар-агар - 1,5. Посев производился уколом в чашки Петри. Гидролиз крахмала обнаруживается после обработки агаровой пластинки раствором Люголя.
Приготовление жгутиковых (Н) и соматических (О) антигенов.
С целью "омолаживания" маточную культуру пересевали в пробирку со свежескошенным агаром. Инкубировали 5 суток при t 28 С. При подтверждении чистоты штамма, вновь сеяли культуру на свежескошенный агар. Через сутки производили смыв культур стерильным физиологическим раствором. Мутность антигенной суспензии устанавливали по оптическому стандарту (1 млрд. в 1 мл). Затем раствор делили пополам. Для инактивации термолабильного жгутикового антигена бактериальную суспензию прогревали в кипящей водяной бане в течение 2-х часов. Так готовится соматический (О) антиген. Н-антиген оставляют без изменений. В качестве консерванта добавляли 2-3 капли 0,050 %-ого формалина.
Приготовление антисывороток.
Агглютинирующая диагностическая сыворотка готовилась путем иммунизации кроликов. Полученную иммунную сыворотку, определив ее титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), разливали по ампулам с добавлением консерванта.
Были использованы следующие сыворотки, полученные путем иммунизации кроликов породы шиншилла, законсервированные хинозолом и сухой борной кислотой:
Hi - ssp. thuringiensis (штамм 735)
Н2 - ssp. fmitimus (штамм 738)
Нз - ssp, alesti (штамм 741), ssp. kurstaki (штамм 1093)
H4 - ssp. sotto (штамм 1002), ssp. dendrolimus (штамм 49/5),
ssp. kenyae (штамм 1010)
Нз - ssp. galleriae (штамм 1000), ssp. canadensis (штамм 1122)
H6 - ssp. subtoxicus (штамм 1004), ssp. entomocidus (штамм 1003)
H; — ssp. aizawai (штамм 1009)
H8 - ssp. morrisoni (штамм 1008),
H9 - ssp. tolworthi (штамм 1007)
Ню - ssp. darmstadiensis (штамм 1075),
Hi і - ssp. toumanoffi (штамм 1020)
H]2 - ssp. thompsoni (штамм 1121)
Постановка реакции агглютинации.
Реакция антиген-антитело представляет собой специфическое взаимодействие антигена с антителом. Агглютинация возникает при реакции корпускулярных антигенов со специфическими антителами, имеющими две или более валентности. В большинстве случаев антитела представлены сывороточными гликопротеинами, мигрирующими в составе медленной фракции у-глобулинов при электрофорезе белков сыворотки, Структурной единицей антитела является мономер, состоящий из 2-х легких цепей (L-цепи) и 2-х тяжелых цепей (Н-цепи). В цепях различают вариабельную область (V-область) в N-концевой части и постоянную, или константную, область (С-область).
V-область у разных антител варьирует. V-области L- и Н- цепей образуют антиген-связывающий г/ентр (активный центр антитела, паратоп), или Fab-фрагмент. Константная область молекулы имеет Fc-фрагмент - антиген-связывающий центр, образованный вариабельными областями L- и Н-цепей; именно с ним взаимодействует антиген-детерминанты (эпитоп) иммуногена. Антиген-связывающий центр комплементарен эпитопу антигена по принципу «ключ-замок»; прочность этой связи — аффинность — зависит от пространственного соответствия реагирующих поверхностей, электростатических, гидрофобных взаимодействий и сил Ван дер Ваальса. Валентность молекулы иммуноглобулина определяется числом ее активных центров. Двухвалентность иммуноглобулинов - это необходимая предпосылка образования иммунных агрегатов при агглютинации, так как лишь при валентности выше единицы возможно образование сетевидных структур из молекул антител и антигена (Фримель, Брок, 1986).
Штаммы Bacillus thuringiensis, циркулирующие при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia larickola Karl.)
При сборе патологического материала особое внимание уделялось погибшим и больным насекомым с признаками бактериальной инфекции.
При исследовании эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.), обнаруженной в кедровом стланике (Pinus pumila Rgi) вблизи реки Таловка в Пенжинском районе, выделено 10 штаммов кристаллообразующих бактерий. По данным серодиагностики выявлено, что две культуры - ssp. thuringiensis, две - ssp. alesti, четыре —ssp. kurstaki, две — ssp, dendrolimus.
Полученные результаты свидетельствуют, что массовая гибель личинок лиственничной мухи вызвана Вас. thuringiensis. Это единственная естественная эпизоотия, которую удалось наблюдать при проведении исследований в биоценозах Камчатки. Интересно отметить, что при этом в популяции циркулировали различные сероварианты: ssp. thuringiensis, ssp. alesti, ssp. kurstaki, ssp. dendrolimus.
Штаммы ssp. kurstaki (3-2кс, 3-3кс, 7-13кс, 7-14кс) были выделены из погибших куколок лиственничной мухи. Причем, штаммы 3-2кс, З-Зкс и штаммы 7-13кс, 7-14кс были выделены из разных особей. И в первом, и во втором случае один штамм оказался более высокопродуктивным по сравнению с другим штаммом, обнаруженном в погибшем насекомом. Из четырех штаммов ssp. kurstaki один (7-13кс) оказался экзотоксигенньш (0,246 мг/мл). Еще более уникальным было выделение четырех штаммов Вас. thuringiemis, обладающих различными биологическими свойствами из одной погибшей личинки. Двг штамма 6-9кс и 6-1 Оке, идентифицированных как ssp. thuringiensis, при одинаковой продуктивности (2,75+0,1 Ох 10 сп/мл) отличались биологической активностью по отношению к различным тест-насекомым. Культура 6-9кс оказалась более активной по сравнению с 6-1 Оке.
Штаммы 6-1 Ікс (ssp. dendrolimus) и 6-12кс (ssp. alesti), выделенные из этой же особи, обладали более высокой продуктивностью (4,17+0,17x109 сп/мл и 5,50±0,26х 10 сп/мл), проявив при этом и высокую биологическую активность.
Обнаружение при эпизоотии штаммов различных биотипов Вас. thuringiensis, отличающихся продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, биологической активностью, по-видимому, явление не случайное. Наличие в популяции экзотоксигенных штаммов (6-9кс, 7-13кс), вероятно, оказывает синергическое влияние на патогенность штаммов, продуцирующих только эндотоксин и экзотоксин в незначительных количествах.
Выделенные культуры, за исключением штаммов ssp. dendrolimus, отличались пестрой антигенной структурой. Так, доминирующие при эпизоотии штаммы 3-го сероварианта дали перекрестные реакции с антисыворотками ssp, galleriae, ssp. aizawai и ssp. darmstadiensis. Серологически неоднородным и нестабильным оказался штамм 6-9 кс, соединяющий в себе агглютинабельные свойства 1-го и 4-го серо вариантов (см. Гл. 4, раздел 4.5).
Таким образом, в данном случае при эпизоотии "работает" не чистая культура определенной разновидности Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов, обладающих различными биологическими свойствами, что определяет устойчивость природной популяции патогена.
Циркуляция в пределах одной бактериальной эпизоотии нескольких серовариантов, вероятно, выступает как возможность приспособления к изменяющимся условиям среды, которые определяются специфическим климатом полуострова (высокая влажность, низкая температура). В связи с этим представляет интерес характер внутривидовых отношений тех разновидностей и штаммов Вас. thuringiensis, которые были выделены при исследовании данной эплзоотии.
Для изучения перекрестного антагонизма был использован метод агаровых блочков. Как видно из таблицы 4, ярко выраженными антагонистическими свойствами обладает штамм 3-го сероварианта Вас. thuringiensis ssp. kurstaki З-Зкс, который подавляет рост почти всех штаммов, за исключением штамма 3-го сероварианта Вас. thuringiensis ssp. alesti 4кс и штамма 1-го сероварианта Вас. thuringiensis ssp. thuringiensis 6-1 Оке.
Примечание: зона угнетения роста дана в мм.
Наибольшая зона подавления роста отмечалась у Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus 6-1 Ікс (4мм). У штаммов Ікс (ssp. dendrolimus) и б-12кс (ssp. alesti) зона угнетения составила 3 мм, у 7-14кс (ssp. kurstaki) - 3,5мм, у 6-9кс (ssp. thuringiensis) и 7-13кс (ssp. kurstaki) - 2,5мм. Очень слабо культура З-Зкс подавляла рост Вас. thuringiensis ssp. kurstaki 3-2кс, который был выделен из той же особи погибшей куколки, в которой обитал и штамм-антагонист. Зона угнетения роста составила 1,5 мм (табл. 4).
Что касается группы штаммов (6-9кс; 6-1 Оке; 6-1 Ікс; 6-12кс), обнаруженных в погибшей личинке лиственничной мухи и двух штаммов 7-13кс и 7-Икс, изолированных из одной особи погибшей куколки, то одновременное нахождение их в кишечнике насекомого не сопровождалось антагонистическими взаимоотношениями, которые могут складываться в микробиоценозе кишечника насекомого между его отдельными компонентами.
На факт нахождения разных вариаций Вас. thuringiensis в организме одной особи насекомого указывали Иванов Г.М. (1967) и Андросов Г.К. и др. (1981). Причем, Иванов Г.М. отмечал, что между выявленными штаммами выявлен антагонизм.
Наряду с культурой 3-3 кс, обладающей высокой антагонистической активностью, слабое угнетающее действие проявили штаммы 3-2кс; 6-1 Оке; 6-Пкс; 7-13кс и 7-14кс. Культура Вас, thuringiensis ssp. alesti 6-12 кс проявила весьма сильное антагонистическое воздействие лишь по отношению к культуре Ікс. Зона угнетения роста составила 3 мм. Следует отметить, что наиболее подвержен антагонистическому влиянию штамм Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus Ікс. На рост культуры Вас. thuringiensis ssp. thuringiensis 6-1 Оке ни одна из испытуемых культур не оказала антагонистического воздействия. Штаммы Ікс {ssp. dendrolimus), 4кс (ssp. alesti) и 6-9кс (ssp. thuringiensis) не проявили перекрестного антагонизма (табл.4).
