Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Щелочные термальные источники 9
1.1. Азотные термы 10
1. 2. Азотные щелочные гидротермы Байкальской рифтовой зоны 12
Глава 2. Микробное сообщество щелочных термальных источников 16
Глава 3. Влияние абиотических факторов на микроорганизмы, функционирующие в щелочных термальных источниках 20
3.1. Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам 20
3.2. Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к экстремальным значениям рН 23
Глава 4. Биологический круговорот азота в экосистемах 25
4. 1. Азотфиксирующие микроорганизмы 27
4. 2. Аммонифицирующие микроорганизмы 30
4.3. Нитрифицирующие микроорганизмы 32
4.3.1. Аммонийокисляющие бактерии 34
4.3.2. Нитритокисляющие бактерии 35
4.4. Денитрифицирующие микроорганизмы 38
Глава 5. Объекты и методы исследования 43
5.1. Объекты исследования 43
5.2. Методы полевых исследований 46
5.3. Методы лабораторных исследований 47
5.3.1. Методы культивирования и изучения роста бактерий в зависимости от физико-химических факторов 47
5.3.2. Методы идентификации бактерий 49
5.4. Методы определения скорости микробных процессов 49
5.4.1. Метод определения денитрифицирующей и азотфиксирующей активностей чистых культур бактерий 50
5.5. Методы определения протеолитической активности 51
Глава 6. Физико-химическая и микробиологическая характеристика источников 53
6.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья 53
6.1.2. Физико-химическая характеристика источника Горячинск по сезонам 58
6.2. Численность функциональных групп бактерий круговорота азота в гидротермах Бурятии 61
6. 2. 1. Общее микробное число и численность функциональных групп бактерий круговорота азота в источнике Горячинск по сезонам 65
Глава 7. Скорости процессов цикла азота в донных осадках источников Прибайкалья 68
7.1. Биологическая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья 68
7.2. Азотфиксирующая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья 69
7.3. Денитрифицирующая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья 70
7.4. Протеолитическая активность в нативных образцах термальных источников Прибайкалья 71
Глава 8. Сезонная динамика процессов цикла азота в донных осадках источника Горячинск 78
8.1. Сезонная динамика эмиссии СОг 78
8.2. Сезонная динамика скорости азотфиксации 79
8.3. Сезонная динамика скорости нитрификации 82
8.4. Сезонная динамика скорости денитрификации 83
Глава 9. Бактерии участвующие в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья 87
9.1. Азотфиксирующие бактерии 87
9.2. Денитрифицирующие бактерии 91
9.3. Аммонифицирующие бактерии 95
9.4. Аммонийокисляющие и нитритокисляющие бактерии 99
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105
ВЫВОДЫ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110
- Азотные термы
- Микробное сообщество щелочных термальных источников
- Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам
Введение к работе
Актуальность темы. Азот является одним из важнейших биофильных элементов, во многом определяющий характер и направление микробиологических процессов в различных экосистемах. Избыток или недостаток азотсодержащих соединений отражается на общей продуктивности водоемов. В настоящее время накоплен большой материал, освещающий круговорот азота в таких водных экосистемах как моря, океаны и озера (Кузнецов и др., 1985; Goering, Parker, 1972; Birch, Spiridakis, 1981; Knowles, 1982; Kuenen, Robertson, 1988; Zehr et al., 1998; Саралов, 1991;Zumpf, 1992; Koops, 2001; Lis, 2006).
В гораздо меньшей степени изучены особенности цикла азота в экосистемах, характеризуемых как экстремальные. В пределах Байкальской рифтовой зоны широко распространены слабоминерализованные источники, газирующие азотом с высокими значениями температуры (до 75С) и рН (до 10). В щелочных термальных источниках проведено много исследований, посвященных азотфиксирующим цианобактериям. В то же время роль алкалотермофильных азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий в биогеохимическом цикле азота изучена недостаточно.
Цель исследования - изучение бактериальных процессов цикла азота в гидротермах Прибайкалья, выделение и описание алкалотермофильных бактерий, участвующих в этих процессах.
Задачи исследования:
Изучение физико-химических параметров исследуемых щелочных термальных источников Прибайкалья.
Исследование сезонной динамики азотсодержащих соединений в илах.
Определение интенсивности бактериальных процессов цикла азота.
Изучение внеклеточной протеолитическои активности в нативных образцах.
Определение численности азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих бактерий по сезонам.
Выделение чистых культур бактерий цикла азота и изучение их физиолого-биохимических свойств и определение функциональной активности.
Научная новизна работы. Впервые проведена комплексная оценка интенсивности микробного цикла азота в щелочных гидротермах. Впервые изучено пространственно-временное распространение бактерий, участвующих в процессах трансформации азота в щелочных термальных источниках Прибайкалья. Определено вертикальное распределение бактерий круговорота азота, содержание органических веществ и внеклеточная протеолитическая активность микроорганизмов в илах гидротерм. Выделены накопительные и чистые культуры азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов, способные расти в щелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) при высоких температурах (>45С). Описана алкалотермофильная нитритокисляющая Nitrospira sp. с оптимумом роста при температуре 48С и рН 8,7.
Практическая значимость. Количественная оценка функциональной активности микроорганизмов круговорота азота может быть использована для определения экологического состояния водных экосистем. Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии как активные продуценты протеаз, устойчивых к высоким значениям температуры и рН. Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении курса лекций по предмету "Микробиология", "Биохимия", "Экология".
Защищаемые положения. Распространение бактерий, участвующих в цикле азота в щелочных
термальных источниках Байкальского региона определяется химическим составом воды, содержанием органического вещества и минеральных форм азота. В то же время такие факторы, как высокие температура и рН, не оказывают ингибирующего влияния на жизнедеятельность бактерий.
Наибольшие значения протеазной активности в нативных образцах характерны для микробных матов и растительных остатков.
В илах и микробных матах щелочных термальных источников среди культивируемых азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих бактерий доминируют представители рода Bacillus. Среди нитрификаторов I и II фазы - представители родов Nitrosomonas и Nitrospira.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004); Южносибирской научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Хакасия, 2004, 2005); Международной конференции "Экосистемы Монголии и приграничных регионов сопредельных стран: природные ресурсы, биоразнообразие и экологические перспективы", Улан-Батор (Монголия) 2005; V межрегиональной научной конференции молодых ученых «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона», (Улан-Удэ, 2006); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ (Москва, 2005, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 14 работ.
Объем работы. Диссертация включает 9 глав и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы (80отечественных и 111 зарубежных источников) и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 29 рисунками и фотографиями.
Благодарности Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву и сотрудникам Лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, к.б.н. Е.В. Лебедевой и сотрудникам Лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН, Я.Е.Дунаевскому, д.б.н., родным и близким.
Определение интенсивностей микробных процессов проводилось совместно с А.Л. Степановым (МГУ). Выделение цианобактерий проводилось совместно с Д.Балдановой и к.б.н. А.В.Брянской (ИОЭБ СО РАН). Определение видовой принадлежности цианобактерий проводилось к.б.н. А.В. Брянской и Д. Балдановой (ИОЭБ СО РАН). Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым участникам работы.
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ 05-04-97215р_байкал_а; Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы»; МО РФ № РНП. 2.1.1. НОЦ «Байкал»; Президиума СО РАН №24.
Азотные термы
Азотные слабоминерализованные щелочные термы представляют собой крупную группу минеральных вод, которые широко распространены в мире. Большие области Центральной Азии, Индии, Восточной Сибири, Восточной Африки, Южной Африки, Южной Америки, запада США,
Европы, западные и восточные районы Исландии относятся к провинции щелочных азотных термальных вод (Крайнов, Швец, 1980). Примером могут служить термальные источники в районе озера Богория (Кения) с рН 9, соленостью 3,5 мг/л и температурой от 35 до 100С (Krienitz et al., 2003). На западном побережье Северной Америки (Йеллоустоунском плато) широко распространены щелочные хлоридные азотные термальные воды (Басков, Суриков, 1989). Азотные субаквальные гидротермы в Исландии во фьорде Эйджафьордур с температурой воды 71 С, рН 10, минерализацией 291 мг/л и содержанием сульфида 0.32 мг/л (Marteinsson et al., 2001).
Решающим фактором в формировании азотных терм является наличие глубинных разломов, активизированных в кайнозое, по которым происходит интенсивный выброс тепла с глубин 2-3км. На указанных глубинах господствует восстановительная геохимическая обстановка, вследствие чего азотные термы являются щелочными и характеризуются низкими значениями Eh. В очагах разгрузки в приповерхностных условиях нередко происходит смешивание терм с грунтовыми или поверхностными водами и происходит изменение окислительно-восстановительных условий и рН смещается в нейтральную или слабокислую сторону, a Eh повышается до +300 - +600 мВ.
По мнению И.М.Борисенко и Л.В.Замана азотные термы формируются за счет инфильтрационных вод, проникающих на значительные глубины по сейсмоактивным разломам в условиях аномального теплового поля. При взаимодействии с вмещающими породами они обогащаются макро- и микрокомпонентами, состав которых зависит от геологической среды и температуры вод. Параллельно с изменением химического состава инфильтрационных вод преобразуется и их газовый состав - кислород расходуется на окислительные реакции, и воды становятся чисто азотными. Вместе с тем некоторые компоненты, особенно газы, преимущественно в периоды сейсмической активности в незначительных количествах могут поступать из мантии (Борисенко, Замана, 1978). Отличительной особенностью азотных гидротерм является обогащенность их кремнекислотой, содержание которой, в пересчете на SiC 2 достигает 100-110 мг/л (Крайнов, Швец, 1980). В азотные термы кремнекислота поступает за счет силикатов, в первую очередь - полевых шпатов, растворение и гидролиз которых возрастает с повышением температуры вод. Наблюдается прямая зависимость между концентрацией в водах SiC 2 и их температурой. Накоплению кремнекислоты способствует натриевый состав гидротерм и их щелочной характер (Крайнов, Швец, 1980).
В газовом составе азотных терм кроме азота (до 85-95%) характерно присутствие ощутимых количеств метана (до 32%), кислорода (до 20%), сероводорода и инертных газов. Весовое содержание сероводорода колеблется от 1-2 до 12-30 мг/л (Борисенко, Замана, 1978). Появление метана, сероводорода и водорода в метановых и азотно-метановых термальных водах связано с биогеохимическими процессами разложения органических веществ, содержащихся в осадочных отложениях впадин (Соломин, Крайнов, 1998).
Микробное сообщество щелочных термальных источников
Распространение и видовое разнообразие микроорганизмов зависят от физико-химических условий среды обитания. Важнейшими экологическими факторами, влияющими на формирование микробных сообществ минеральных источников, являются температура, активность среды (рН), окислительно-восстановительный потенциал (Eh), химический и газовый состав. Способность некоторых микроорганизмов жить при высоких температурах в последнее время привлекла особое внимание биологов. Возрос интерес к экологическому обследованию горячих источников, так как в них были обнаружены новые виды и формы термофильных микроорганизмов (Заварзин, 2001). Кроме того, экстремальные среды важно исследовать как модельные объекты в целях развития микробной экологии в целом. При относительно малом разнообразии жизненных форм в таких местообитаниях легче выявить кооперацию микроорганизмов, чем в экосистемах с обычными условиями среды, высоким видовым разнообразием и сложной структурной организацией. Получение новых данных относительно состава микрофлоры термальных источников и установление связи между микробиологическими и химическими характеристиками позволяет выявить существенную роль микроорганизмов в формировании химического состава термальных вод. Существуют различные классификации микроорганизмов по отношению к температуре (Wiegel, 1998; Castenholz, Pierson, 1995; Заварзин, Колотилова, 2001). Как правило, микроорганизмами называют термотолерантными, которые способны выживать в условиях повышенной температуры, но оптимальна для них умеренная температура (25-40 С). Термофильными - растущие при температуре 40-60С, экстремально термофильными - при температуре 55 80 С, гипертермофильными - выше 75 С. Большинство известных на сегодня гипертермофильных микроорганизмов - это археи, например Pyrolobus fumarii с верхним температурным пределом 113С (Bluchl et al., 1999). И лишь немногие гипертермофилы представляют собой бактерии (Pyrobaculum, Methanopuris). Гипертермофильные археи и бактерии, возможно, относятся к ранним формам жизни, когда повсеместно существовала высокая температура. В процессе снижения температуры на Земле появились вторичные термофилы. Вторичные термофилы не являются близкородственными гипертермофильным видам и, вероятно, произошли в результате перехода к термотолерантности и термофилии. (Brock, 1967, 1995).
К алкалофилам относят микроорганизмы с оптимумом рН выше 8,5, к алкалотолерантам - микроорганизмы способные развиваться при щелочных условиях, но с оптимумом рН до 8.5 (Wiegel, 1998). Строгие алкалофилы изучены недостаточно. Трудность культивирования, заключается в том, что при высоких значениях рН обычные минеральные компоненты питательных сред выпадают в осадок. Среди известных алкалофильных гетеротрофных бактерий имеются штаммы, сходные с Bacillus, для которых оптимален диапазон рН 9-11,5. Свойством устойчивости к щелочным условиям (алкалотолерантность) обладают гетеротрофные бактерии родов Flavobacterium, Pseudomonas, Vibrio, Corynebacterium и Arthrobacter, способные выдерживать рН до 11, но гораздо лучше растущие при нейтральной реакции среды.
Сочетание высоких значений температуры и рН обуславливает присутствие в микробных сообществах щелочных гидротем бактерий, обладающих алкалотермофильными свойствами, которые по физико-химическим параметрам роста отнесены к группе экстремофилов. Активное изучение экстремальных местообитаний в последние десятилетия вызвано поиском микроорганизмов с уникальными свойствами.
Экстремофилы являются продуцентами термостабильных или термоактивных ферментов с алакалофильными свойствами: протеазы, амилазы, хитиназы, ксиланазы, липазы, лактазы, представляющих интерес для многочисленных промышленных технологий (Fujiwara, 1991; DeBlois and Wiegel, 1991,1995; Masui et al., 1994; Wiegel, 1998; Huber et al, 1992, 1998). Среди выделенных ферментов есть образцы с исключительными характеристиками, такие как амилаза с оптимумами рН 12 и температурой 60 (Huber et al., 1998), и сериновая протеаза с оптимумами 13 и 85С (Masui et al., 1994).
Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам
Для поддержания относительно постоянной вязкости мембраны при изменениях температуры у большинства бактерий происходят изменения ее липидного состава: при повышении температуры в мембрану включаются более насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты. Это повышает «температуру плавления» липидов и обеспечивает оптимальную стабильность и текучесть при повышенной температуре. (Квасников, Исакова, 1978; Жизнь микроорганизмов ..., 1981; Логинова, 1982; Zeng et al., 1992; Сущик и др., 1999; Калачева, Сущик, 1994). При повышенной температуре в клетках Spirulina platensis уменьшалась степень ненасыщенности жирных кислот за счет снижения относительного содержания моноеновой Сш, диненасыщенной С18:2 и триненасыщенной С 18:з кислот. Для внутриклеточных жирных кислот Chlorella vulgaris Beijer отмечено уменьшение относительного содержания триненасыщенных кислот С 1б;з и С 18:3 за счет увеличения содержания диненасыщенных кислот. В составе липидов микробного мата термального источника, основу которого составляли микроорганизмы рода Chloroflexus, доминировали насыщенные и мононенасыщенные Сіб и Сі8 жирные кислоты (Pond et al.„ 1986; Zeng et al, 1992). Предполагается, что внеклеточные выделения свободных жирных кислот являются дополнительным механизмом регуляции и поддержания определенного состава жирных кислот клетки. Повышение температуры приводит к приостановке синтеза диеновых кислот из моноеновых у Spirulina platensis, в клетках водорослей накапливается Ci8;1 моноеновая кислота. Чтобы элиминировать этот эффект, происходит увеличение выделения мононенасыщенной кислоты в окружающую среду. При повышенной температуре роста клетки Chlorella vulgaris усиливают синтез запасных липидов в форме триацилглицеролов, избыток олеиновой кислоты переправляется в эти липиды (Сущик и др., 1999; Калачева, Сущик, 1994). У термофильных архей, мембраны состоят из липидов глицерол-полипренильной природы содержащие простые эфирные связи, которые значительно более стабильны при высокой температуре, чем липиды со сложноэфирными связями (Pond et al., 1986).
Основой термотолерантности белков организмов являются небольшие изменения их молекулярных структур. В свою очередь, изменение макромолекулярной структуры связано с изменением качественного состава белкового полимера, что ведет к возрастанию прочности внутримолекулярных связей. Исследование состава белков термофильных микроорганизмов выявило увеличение числа аминокислот, способных к образованию дополнительных водородных связей, ионных взаимодействий. Отмечено относительно высокое содержание кислых аминокислот, аргинина, гистидина (Логинова, 1982). По сравнению с мезофилами, белки термофилов отличались высоким содержанием триптофана, лейцина, низким цистеина. Уменьшение содержания цистеина в белках связано с термофильностью, особенно уменьшение числа сульфгидрильных групп, которые расположены на поверхности молекул белка и могут окисляться (Жизнь микроорганизмов..., 1981).
Ферменты термофильных микроорганизмов термостабильны и активны при более высоких температурах. Между субъединицами в молекулах энзимов термофилов существуют более прочные гидрофобные связи, что обуславливают их термостабильность (Квасников, 1978; Логинова, 1982; Чурикова, Викторов, 1989). При изучении термостабильных ферментов не обнаружено какого-либо общего структурного принципа; в каждом случае имеет место особая комбинация дополнительных связей (Pantoliano et al., 1987; Takagi et al., 1990). Ферменты многих термофилов имеют более низкую молекулярную массу и характеризуются высоким содержанием глицина, серина, глутаминовой кислоты и низким аланина (Imanaka et al., 1986; Yutani et al., 1986). Введение Pro замены структуры белка штамма Bacillus sp. 18 позволило установить термостабильность фермента на 105% выше при 70С (Masui et al., 1994).
Также известно, что при повышении температуры в клетках многих организмов синтезируются специфические белки теплового шока, которые при нормальной температуре либо не синтезируются вообще, либо синтезируются в незначительном количестве. Белки-шепероны способствуют формированию специфически термостабильной третичной структуры белков (Hartl et al., 1994). Кроме того, ответ на тепловой шок значительно перекрывается с реакциями на другие стрессы, например при тепловом шоке наблюдается синтез каталазы - белка окислительного шока, который при высокой температуре способствует выживанию благодаря, возможно, удалению пероксидов, образование которых усиливается с повышением температуры (Lengeler et al., 1997).
