Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Микроорганизмы щелочных гидротерм.
1.1. Термальные источники Баргузинской долины и их физико-химическая характеристика 8
1.2. Термальные источники - как среда обитания микроорганизмов 10
1.3. Отношение микроорганизмов к температурному градиенту 12
1.3.1. Термофильность 13
1.4. Причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам 16
Глава 2. Систематика, физиология и биохимия термофильных микроскопических грибов
2.1. Таксономия термофильных микроскопических грибов 19
2.2. Физиология термофильных микроскопических грибов 25
2.3. Классификация ферментов и характеристика некоторых групп... 26
2.4. Классификация секретируемых протеаз 27
2.4Л. Металлопротеазы 28
2.4.2. Сериновые протеазы 29
2.4.3. Аспартильные протеазы 31
2.4.4. Цистеиновые протеиназы 34
2.5. Целлюлаза микроскопических грибов 34
2.6. Каталазная активность микроорганизмов 38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Объект исследования 40
3.2. Методы исследования природной среды и отбора проб 42
3.3. Методы определения численности бактерий и микроскопических грибов 42
3.4. Методы получения накопительных и чистых культур микроскопических грибов 43
3.5. Методы изучения скорости роста микроорганизмов в зависимости от температурного градиента, рН и углеводов 43
3.6. Методы идентификации микроскопических грибов 44
3.7. Качественный метод определения протеолитических свойств микроорганизмов 44
3.8. Методы определения протеолитической активности 45
3.8.1. Методы определения протеолитической активности при различных концентрациях казеина 45
3.8.2. Методы определения протеолитической активности на различных углеводах 46
3.8.3. Метод ингибиторов протеаз 46
3.9. Метод определения целлюлазной активности 46
ЗЛО. Метод определения каталазной активности 48
3.11. Метод определения токсичности и антибиотической активности термофильных микроскопических грибов 48
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Баргузинской долины 50
4.2. Количественный и качественный состав термофильных и термотолерантных микроскопических грибов гидротерм 53
4.3. Экофизиология микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины 66
Глава 5. Ферментативная активность термофильных микрорганизмов
5.1. Протеазная активность в нативных образцах термальных источников Баргузинской долины 72
5.2. Протеолитические свойства и активность накопительных культур термальных источников Баргузинской долины 81
5.3. Внеклеточные протеолитические ферменты микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины 86
5.4. Целлюлазная активность микроскопических грибов в термальных источниках Баргузинской долины 97
5.5. Внеклеточная каталаза термофильных и термотолерантных микроскопических грибов 102
5.6. Токсичность и антибиотическая активность термофильных микроскопических грибов 110
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112
ВЫВОДЫ 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
- Термальные источники - как среда обитания микроорганизмов
- Классификация секретируемых протеаз
- Метод определения целлюлазной активности
Введение к работе
Термофильные микроскопические грибы и бактерии являются экологически обособленной группой организмов, принимающих участие в круговороте биогенных элементов в различных экосистемах. Активная роль микроскопических грибов в процессах трансформации веществ обусловлена присущей им высокой ферментативной активностью и физиологической пластичностью на изменение физико-химических и биологических параметров среды.
Изучению термофильных микроскопических грибов в последнее время уделяется большое внимание, что связано с выяснением их роли в высокотемпературных системах и большим биотехнологическим потенциалом. Анализ этих данных представляет особый интерес для экологии микромицетов., в связи с раскрытием их трофических связей в экологических нишах с высоким температурным градиентом и определением продуцентов устойчивых к высоким температурам и рН ферментов.
Распространение микроскопических грибов в термальных источниках Прибайкалья ранее изучалось эпизодически (Рихванов, 1995; Тахтеев, 2000). Работ по физиологии и ферментативной активности данной группы микроорганизмов в этих источниках нет.
Распространение микромицетов изучалось в термальных источниках Камчатки (Егорова и др., 1997). Имеются работы по изучению ферментов термофильных грибов, выделенных из саморазогревшихся растительных остатков и других высокотемпературных систем (Билай, 1987; Логинова и др., 1967).
В проведенном исследовании впервые изучен видовой состав микроскопических грибов, их численность и пространственное распределение в термальных источниках Прибайкалья. Определены температурные и рН параметры роста выделенных культур микромицетов. Впервые проведено комплексное исследование ферментативной активности в
нативных образцах термальных источников и выделенных накопительных и чистых культурах.
Целью настоящей работы было изучение видового разнообразия и физиолого-биохимических свойств микромицетов выделенных из термальных источников Прибайкалья.
В задачи исследования входило:
Определение физико-химических условий среды обитания микроскопических грибов.
Определение численности физиологических групп микромицетов.
Изучение видового разнообразия микромицетов.
Выделение накопительных и чистых культур микроскопических грибов.
Определение влияния основных абиотических факторов на рост и развитие чистых культур.
Определение протеолитической, целлюлазной и каталазной активностей в накопительных и чистых культурах, а также в нативных образцах.
Комплексное исследование микробного сообщества микромицетов термальных источников Баргузинской долины показало, что температура, рН и субстрат источников оказывают существенное дифференцирующее влияние на видовой состав данной группы микроорганизмов. Выявлено, что в термальных источниках именно микроскопические грибы являются основными деструкторами органического вещества. Ферментативная активность их наблюдается в широком диапазоне температур и рН. Показано, что микроскопические грибы секретируют протеолитические ферменты при высоких температурах, проявляют оптимум активности при рН 7,7; 9,7 и 10,4 и относятся к классам сериновых и металлопротеаз.
Полученные результаты расширяют представление о разнообразии микроскопических грибов в термальных источниках Баргузинской долины и их функциональной роли в этих экосистемах. Выявленные закономерности
распространения, физиологической и ферментативной активности микроскопических грибов могут использоваться при проведении экологического мониторинга и прогнозировании состояния исследованных источников.
Термальные источники - как среда обитания микроорганизмов
Состав микрофлоры и характер микробиологических процессов в водоемах тесно связан с экологической обстановкой окружающей среды, ее химическими и физическими особенностями, со всем сложно структурированным комплексом гидробионтов. Основными факторами влияющими на развитие микроорганизмов являются температурный, кислородный и газовый режимы, поступление биогенных элементов (Кузнецов, 1977; Гебрук, Галкин, 2002).
На характер распределения микроорганизмов влияет ряд следующих факторов: источники энергии и углерода, субстрат окислительно-восстановительных реакций, взаимоотношения между организмами, а также состав и концентрация растворенных в воде органических и неорганических веществ.
Способность некоторых микроорганизмов жить при высоких температурах в последнее время привлекла особое внимание биологов. Возрос интерес к экологическому обследованию горячих источников, так как в них были обнаружены новые виды и формы термофильных микроорганизмов (Заварзин, 2003). Получение новых данных относительно состава микрофлоры термальных источников и установление связи между микробиологическими и химическими характеристиками позволяет выявить существенную роль микроорганизмов в формировании химического состава термальных вод,
Как отмечают D.A. Соопеу и др. (1964), горячие источники являются классическим местом обитания термофильных микроскопических грибов. Исследования по выделению и изучению термофильных микроскопических грибов проводились Логиновой с сотр. (1967), Билай (1976). Ими были выделены 5 термотолерантных форм грибов, относящихся к родам Aspergillus и Verticillium. Причем четыре штамма обнаружены в горячих источниках Курильских островов, температура воды которых достигала 90С.
Одним из экзотических местообитаний термофильных и термотолерантных грибов являются горячие сточные воды ядерных реакторов (Tansey, Broc,1973; Blalock, 1973). Наиболее часто термофильные микроскопические грибы находят в горячих источниках и связанных с ними водоемах, имеющих кислую реакцию среды (Tansey, Вгос, 1971,1973; Ellis, 1980 а, в). Термофильные грибы выявлены также на растительных остатках холодных озер в Японии (Tubaki е.а.1974). При этом Aspergillus fumigatus отмечен повсеместно. Thermomyces lanuginosa- выявлен в местах скопления растительных остатков с температурой до 37 С. Термофильный гриб Humicola lanuginose выделен из гейзера, имеющего температуру 60С. Из горячих источников на о. Тайвань выделяли Aspergillus fumigatus и Humicola insolent (Кашнер, 1981).
Из анализа литературных данных можно сделать вывод о том, что облигатные термофильные грибы представляют собой немногочисленную по числу видов экологическую группу. Она представляет собой стабильный компонент микоценоза, доминирующий в двух основных местообитаниях:
1) в самонагревающихся субстратах в природе и в различном промышленном сырье;
2) в термальных природных и антропогенных местообитаниях. Однако следует особо отметить, что распространение микроскопических грибов и их экологическая функциональная роль в термальных водных системах изучена еще слабо.
Микроорганизмы обычно подразделяют на следующие группы по их способности к росту при различных температурах:
1) психрофилы;
2) мезофилы;
3) термофилы.
К психрофилам относятся микроорганизмы, имеющие минимальную температуру роста ниже 15 С. Их максимальная температура часто (но не всегда) является более низкой, чем у мезофилов.
Мезофилы - микроорганизмы, имеющие максимальную температуру роста ниже, чем у термофилов, а минимальную выше, чем у психрофилов. Типичная максимальная температура для мезофилов могут быть 40-45С, а типичная минимальная температура — около ЮС (Лукомская, 1987; Позмогова, 1973).
Термофилы - микроорганизмы с максимальной температурой роста выше 55 С. Группа термофилов отличается сложной структурой. Внутри ее обычно выделяют следующие подгруппы:
1) Экстремально - термофильные микроорганизмы (бактерии), не растущие при температуре ниже 40-45С;
2) Стенотермофилы, растущие при минимальной температуре выше 37С;
3) Эвритермофилы, минимальная температура роста которых может находиться в широком диапазоне, расположенном ниже 37С;
4) Термотолерантные микроорганизмы, которые образуют особую группу (Имшенецкий, 1944). Их максимальная температура роста находится в пределах 37-43 С. Т.е., они способны размножаться без существенного уменьшения или увеличения максимальной скорости роста при несколько повышенных температурах (на 4-8 С), по сравнению с температурами, являющимися оптимальными для мезофильных штаммов.
Классификация секретируемых протеаз
Исследования по выделению, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся интенсивно. Это объясняется востребованностью й многообразием протеолитических ферментов. Эти ферменты, синтезированные внутриклеточно, участвуют в регуляции внутриклеточного метаболизма и различных уровней биологических процессов: молекулярных, клеточных, тканевых, и межорганных (Adams, 1993; Ong et al, 1973). На уровне клеток они могут контролировать концентрацию белков и пептидных биорегуляторов. Протеолитические ферменты активируют неактивные предшественники и в результате ограниченного протеолиза физиологически активных белков и пептидов вызывают трансформацию биологической активности. Внеклеточные протеазы присутствуют у различных микроорганизмов, в частности у мицеальных грибов. Они играют ключевую роль в использовании микромицетами органических субстратов (Билай, Бэккер, 1988; Miller, 1974). Эти ферменты участвуют в целом ряде метаболических процессов: катализируют гидролиз экзогенных питательных веществ; снабжают клетки мономерами, которые в дальнейшем окисляются с выходом энергии, и мономерами участвующими в белковом обмене; принимают участие в разрушении белковых оболочек спор в процессе прорастания и, возможно, в процессах морфофизиологических перестроек мицелия (Имшенецкий 1979, Ландау, 1996).
Разнообразие условий и функций протеаз, в которых они синтезируются и действуют, определяет многообразие этих ферментов. Все известные к настоящему времени протеазы (эндопептидаза) отнесены к одному из четырех классов: металлопротеаз, сериновых, цистеиновых и карбоксильных (аспартильные) протеазы (Лобарева, Степанов, 1978; Мс Donald, 1985). К наиболее общим критериям определения класса данных ферментов относятся: однотипный механизм каталитического действия, обусловленный присутствием в активных центрах соответствующих реакционноспособных групп; сходство диапазона рН; наличие общих для данного класса ингибиторов (Raoefal, 1998).
Эти протеолитические ферменты часто секретируются в неактивной форме. Для активаций металлопротеаз необходимо присутствие ионов металлов: магния, марганца, кобальта, цинка.
Ферменты этой группы можно разделить на две подгруппы. К первой принадлежат ферменты, у которых металл подвижен, и соединен с белковой частью и легко теряется при очистке (Кретович, 1974). Ферменты второй подгруппы содержат металл, прочно соединенный с белком. К ним относятся карбоксипептидаза, в активном центре которой присутствует ион цинка и свободная карбоксильная группа с белком (Кретович, 1974,Прист, 1987).
Металл опротеазы обладают специфичностью: они разрывают пептидные связи гистидин-лейцин, аланин-лейцин, тирозин-лейцин, глутамил-фенилаланил, глутамил-аланил-фенилаланил (Егоров и др., 1979). Они расщепляют белки, которые широко распространены в природе (включая эластин, кутикулу насекомых).
По специфичности и ферментативным свойствам Ваганов с сотр. (1983, 1988) делят металлопротеазы аспергиллов на две группы. К первой относятся те ферменты, оптимум активности которых лежит при рН 7,0 (протеиназа 1 A. orysae и A. sioae). Их молекулярная масса лежит в диапазоне 41-45 kDa и они ингибируются фосфоамидоном. Протеазы второй группы имеют оптимум гидролиза белков при рН 5,0-6,0. К ним относятся протеазы А. oryseae и A. soiae (Nakadia et al., 1972). Эти ферменты имеют молекулярную массу порядка 20 KDa и не чувствительны к фосфамидону.
Сериновые протеазы - это наиболее изученная группа, в которую входят три семейства: химотрепсинов, субтилизинов и карбоксипептидаз,
Руденская (1980) разделяет семейство субтилизинов на семь подсемейств и щелочные протеиназы грибов относит к третьему подсемейству. Это ферменты с молекулярной массой 18-57 кОа и ИЭТ 5,9-8,75. Они секретируются многими грибами, растущими на средах с коллагеном, казеином, гемоглобином, эластином и другими белковыми субстратами (Monod et al., 1993; Aikawa et. al., 1990); полностью ингибируются фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ), химостатином и др. ингибиторами. Сериновая протеиназа из Steptomyces thermovulgaris в активном центре имеет цистеин, который в пространственной структуре расположен в непосредственной близости и к гистидину, участвующему в каталитическом акте, и к аспарагиновой кислоте. Для нее характерна высокая протеолитическая активность и низкая специфичность (Прист, 1987), Aspergillus fumigatus секретирует сериновую протеиназу с Mr 33 kDa и ИЭТ 9.3, которая представляет собой простую не гликозилированную полипептидную цепь. Так как этот гриб способен поражать дыхательный тракт больных пузырчатым фиброзом, авторы рассматривают щелочную протеазу как вирулентный фактор (Larcher et al., 1996).
Протеиназы из Acremonium chrysogenum резко отличаются друг от друга по величине заряда. В сравнении с протеиназой 1 протеиназа 2 характеризуется меньшим содержанием основных аминокислот (лизина, аргинина, гистидина) и остатков полуцистина, триптофана, тирозина, большим содержанием глицина и аланина. В целом аминокислотный состав протеиназ Acremonium chrysogenum довольно близок аминокилотному составу протеиназ К из Tritiracium album и термомиколину из Malbranchea pulchella var. Sulfurea. Протеиназы 1 и протеиназы 2 проявляют четкую гомологию N- концевых последовательностей. Структуры протеиназ 1 и 2, по-видимому, близки, тогда как существенные различия в значениях ИЭТ ферментов объясняются различиями в содержании основных аминокислот. Значительное сходство между N- концевыми последовательностями наблюдается при сравнении протеиназ Acremonium chrysogenum с протеиназой К и термомиколином. Обнаруженная гомология говорит о близости первичной и третичной структур рассмотренных протеиназ (Степанов и др., 1986; Васильева и др., 1985).
Протеазы химотрипсинового типа имеют следующую цепь переноса заряда: остатки аспарагиновой кислоты, гистидина и серина (Степанов, 1973) и ингибируются диизопропилфторфосфатом. Билай (1985) относит протеиназу Melanokarpus albomyces на основании ее субстратной специфичности. Из Fusarium oxysporum выделена протеиназа, близкая к трипсину по специфичности и аминокислотной последовательности (Rypniewski et al., 1993). Кристаллографическое исследование подтвердило сходство этой протеиназы с бычьим трипсином. Показано, что структуры области активного центра и субстрат-связывающих участков у протеиназы Fusarium oxysporum и трипсина очень близки.
Сериновые карбоксипептидазы широко распространены у несовершенных грибов. Их молекулярная масса лежит в пределах от 30-48 KDa у протеиназ из М. anisopliae, Penicillium janthinellium (S-l), Aspergillus orysae (Ваганова и др., 1988) до 140-155 кДа у димерных протеаз, из Penicillium janthinellium (S-2), Aspergillus oryesae (О), A. saitoi. Оптимум pH этих ферментов находится в кислой и нейтральной областях (3,0 до 6,8), а ИЭТ- в узком интервале рН от 3,7 до 4,7. Кислые карбоксипептидазы аспергиллов во многом схожы и обладают карбоксиамидазной активностью (Takeuchi et al., 1986). Они имеют широкую субстратную специфичность: отщепляют с С-конца субстрата большинство аминокислот, включая пролин, но не все представители этого семейства ингибируются ПХМБ, поэтому остатки цистеина нельзя считать входящими в активный центр этих ферментов (Азаренкова и др., 1976).
Метод определения целлюлазной активности
Влияние различных углеводов в составе модифицированной среды Чапека изучали, добавляя в среду в качестве углеродного компонента один из следующих Сахаров: сахарозу, мальтозу, рамнозу, манит или глюкозу.
Для определения оптимума рН секретируемой протеиназы был использован 0,2 М универсальный буфер в диапазоне рН от 6,0 до 11. Протеолитическую активность определяли как описано выше.
Методы определения ингибиторов протеаз
Для выяснения природы функциональных групп активного центра к раствору фермента добавляли раствор соответствующего ингибитора, инкубировали 40 минут при комнатной температуре, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз - этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз - иодацетамид (ИАА) и сериновых протеаз -фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ).
Для выяснения биохимического механизма ферментативного гидролиза целлюлозы определяли активности отдельных ферментов целлюлозолитического комплекса - эндо-1,4-р-глюкозидазную, экзо-1,4-(3-глюкозидазную и целлобиазную активности (Сивере и др., 1982),
Определение редуцирующих Сахаров по мето7гу ТТТомодьи-Нельсона. Для определения редуцирующих Сахаров использовали 2 реактива: реактив Шомодьи (А) и реактив Нельсона (Б). Метод состоит в определении первоначального количественного окисления редуцирующих Сахаров, образовавщихся при ферментативном гидролизе целлюлозы, реактивом Шомодьи в щелочной среде (рН 9) с образованием закиси меди и последующим окислением арсеномолибдатным реактивом Нельсона в кислой среде (рН 4), с образованием молибденовой сини. Измеряли оптическую плотность полученного раствора при длине волны 610 нм (Билай, 1982).
Активность экзо-1,4-В-глокозидазы микроскопических грибов определяли по их способности осахаривать фильтровальную бумагу (фильтрат №3). К измельченной фильтровальной бумаге добавляли 2 мл 0,1 М цитрат- фосфатного буфера с рН 7 и 0,5 мл фильтрата культуральной жидкости. Раствор инкубировали в термостате при 42С, в течении 1 часа, после чего определяли образовавшиеся редуцирующие сахара.
Активность эндо-1,4-В -глюкозидазы микромицетов определяли по их осахаривающей способности. К 1 мл 1%-ного раствора Na-КМЦ в цитрат-фросфатном буфере (рН 7) приливали 1 мл культуральной жидкости, после чего определяли количества редуцирующих Сахаров по методу Шомодьи-Нельсона.
В-глюкозидазную активность определялись путем измерения увеличения содержания редуцирующих Сахаров, образовавшихся под воздействием ферментов на целлобиозу. Состав реакционной смеси готовили следующим образом: к 0,1 мл 0,05%-ного раствора целлобиозы в цитрат фосфатном буфере (рН 7) приливали 1 мл культурального фильтрата и инкубировали в течении 30 мин при температуре 42С. После инкубации определяли количество редуцирующих Сахаров в 1 мл реакционной смеси.
Определение каталазной активности основано на титрометрическом выявлении количества разложившейся перекиси водорода в течении определенного времени. Количество разложенной перекиси водорода рассчитывали по формуле: X=(Vk-Von)x0J7/0,5x0,034x3=(VK-Von)3,33P, где Х- активность каталазы в 1 мл исходного раствора; VK - количества тиосульфата натрия, ушедшего на на титрование контрольной пробы (мл); Von - количество тиосульфата натрия ушедшего на титрование опытной пробы (мл); 0,17-количество разведенной культуральной жидкости в пробе; 3- время инкубации (мин), Р - фактор разведения. За единицу активности каталазы принимали количество фермента, которое катализирует разложение 1 мкмоля Н2Ог (0,034 мг) за 1 мин (Борисова, 1982).
Антибиотическую активность определяли с помощью метода бумажных дисков. Диски из фильтровальной бумаги, смачивали в культуральной жидкости, накладывали на поверхность питательного агара, засеянного тест-организмами - Е. coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas acrusinosa, Streptococus aureus. Чашки помещали в термостат при температуре 37С (оптимальной для тест организмов) на 24 часа. При наличии в испытуемом растворе антибиотика вокруг бумажного диска обычно образуется зона задержки развития тест-микроба. Токсичность микроскопических грибов определяли на простейших животных. В качестве тест-объекта использовали Tetrachymena piriformis, которую получали из природных водоемов перевивкой тонкой пипеткой. Готовили сенной настой: 1-2 части сена кипятили в колбе для удаления зародышей неспоровых бактерий и других микроорганизмов, настаивали при комнатной температуре (20-25С) около 3 дней для развития сенной палочки и в эту среду вносили Tetrachymena piriformis.
Последовательность определения. На предметное стекло микропипетками наносили две капли культуральной жидкости гриба и одну каплю с тест-объектами. Все три капли должны быть одинакового объема. Предметное стекло помещали в чашку Петри с фильтровальной бумагой смоченной водой (влажная камера). Наблюдение за поведение тест-объектами начинают через несколько минут и продолжаются не менее 4 часов.
Критерием для определения токсичности служит время гибели Tetrachymena piriformis от воздействия испытуемого экстракта, которую констатируют по полному прекращению их движению и распаду. При действии экстракта резко токсичных грибов гибель наблюдается через 3 минуты; токсичных - 8-20 минут; слабо токсичных - через 24 часа. Нетоксичные штаммы грибов не вызывает гибели или каких либо морфологических изменений даже после 24 часового воздействия (Курасова и др., 1972).
