Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Биохимическая адаптация гидробионтов к токсическому воздействию и другим факторам среды (обзор литературы) 21
1.1. Молекулярные факторы адаптации. Металлотионеины и другие стресс-белки 23
1.2. Метаболические факторы адаптации 35
1.2.1. Реакции свободного окисления 36
1.2.1.1. Ферментативная детоксикация ксенобиотиков 41
1.2.1.2. Антиоксидантная защита .і 1
1.2.1.3. Биомаркеры окислительно-восстановительных процессов в экологическом мониторинге природных водоемов
1.2.2. Адаптивная динамика основных путей метаболизма 69
1.2.3. Биогенные вещества и специализированные защитные белки в качестве факторов метаболической адаптации 73
1.3. Клеточная адаптация и её биохимические маркеры 82
1.3.1. Апоптоз — запрограммированная гибель клеток 84
1.3.2. Аутолиз и некроз 96
1.4. Стресс и его общебиологическая природа 108
1.4.1. Основные биохимические маркеры стресса 109
1.4.2. Развитие стресс-реакции. Неспецифическая и специфическая адаптация 113
ГЛАВА 2. Материалы и методы 119
2.1. Материалы 119
2.1.1. Особенности биологии подопытных животных 119
2.1.2. Сбор и содержание животных в лаборатории. Постановка токсикологических экспериментов 130
2.2. Методы 132
2.2.1. Количественное определение активности ферментов 132
2.2.2. Энзимэлектрофорез множественных форм ферментов в полиакриламидном геле 139
2.2.3. Изоэлектрическое фокусирование множественных форм ферментов 141
2.2.4. Определение субклеточной локализации множественных форм ферментов 1чЗ
2.2.5. Качественное и количественное определение сорбита 143
ГЛАВА 3. Суммарная активность ферментов в остром токсикологическом эксперименте 145
3.1. Методическая основа и проблемы постановки токсикологических экспериментов 146
3.1.1. Верификация результатов, полученных с объединённой пробой 150
3.1.2. Групповая изменчивость и репрезентативные группы 157
3.2. Изучение динамики суммарной активности ферментов в остром токсикологическом эксперименте 161
3.2.1. Изменение активности ферментов как следствие интоксикации организма 162
3.2.2. Колебательная динамика активности ферментов в процессе адаптации 165 ГЛАВА 4. Изменение состава множественных форм гидролитических ферментов при интоксикации гидробионтов 187
4.1. Молекулярная гетерогенность ферментов в норме 188
4.1.1. Процедура разделения и характеристики множественных форм исследованных ферментов 188
4.1.2. Ферменты или множественные формы? 194
4.2. Функциональные и патологические изменения состава множественных форм ферментов 199
4.2.1. Множественные формы ферментов как инструменты метаболической адаптации и маркеры загрязнённости природных вод 205
4.2.2. Множественные формы ферментов как факторы специализации тканей, органов и межвидовой дифференциации 210
ГЛАВА 5. Комплекс кислых фосфатаз живородки речной 214
5.1. Молекулярная гетерогенность и субклеточная локализация 215
5.1.1. Суммарная активность и состав множественных форм 215
5.1.2. Тканевая специфичность и субклеточная локализация 225
5.2. Физико-химические свойства и функции кислых фосфатаз 233
5.2.1. Очистка ферментов, их зависимость от катионов металлов 233
5.2.2. Субстратная специфичность и метаболические функции 237
5.3. Реакция комплекса кислых фосфатаз на токсическое воздействие 240
5.3.1. Опыты in vitro 240
5.3.2. Опыты in vivo 244
5.3.2.1. Динамика суммарной активности комплекса кислых фосфатаз 245
5.3.2.2. Изменения состава множественных форм кислых фосфатаз 253
ГЛАВА 6. Обмен побочных метаболитов в состоянии стресса 263
6.1. Побочные метаболиты живородки речной 267
6.1.1. Сезонная динамика накопления сорбита 270
6.1.2. Стресс-индуцированная динамика накопления сорбита 271
6.2. Динамика активности сопутствующих ферментов 274
6.2.1. Превращение побочных метаболитов в состоянии холодового и токсического воздействия 275
6.2.2. Координация факторов срочной и устойчивой адаптации. Структурный след 284
ГЛАВА 7. Биохимическое тестирование стоков и индикация качества природной воды 291
7.1. Лабораторный токсикологический эксперимент 292
7.2. Исследования в природном водоёме
7.2.1. Биологическая индикация качества воды ЗС1
7.2.2. Эксперимент в природных условиях (биотестирование путём переселения) 320 заключение 329
Выводы 333
Список литературы
- Биомаркеры окислительно-восстановительных процессов в экологическом мониторинге природных водоемов
- Энзимэлектрофорез множественных форм ферментов в полиакриламидном геле
- Изучение динамики суммарной активности ферментов в остром токсикологическом эксперименте
- Динамика активности сопутствующих ферментов
Введение к работе
Актуальность темы. Техногенное загрязнение водной среды — одна из глобальных экологических проблем современного общества и в ряду с климатическими изменениями температуры, освещенности, газового, солевого состава и др. параметров, едва ли не главный по значимости средовой фактор, воздействию которого нередко подвергаются водные животные. Сила воздействия этого фактора на гидробионтов определяется его качественными и количественными признаками. Первые обусловлены вероятностью попадания в гидросферу какого-либо не встречавшегося ранее токсического вещества (некоторые тяжелые металлы, ксенобиотики и пр.), вторые — концентрацией в воде и продолжительностью воздействия на биоту. Если по силе воздействия какой-либо фактор среды выходит за привычные рамки, освоенные животными в результате естественного отбора (популяционно-генетическая адаптация) или онтогенеза (индивидуальная адаптация), организм переходит в состояние стресса — органического или физиологического расстройства, сопровождаемого нарушением обмена веществ.
Впервые понятие стресса (неспецифического адаптационного синдрома) было разработано канадским патологом Гансом Сельё. Он рассматривал стресс как механизм сохранения гомеостаза, универсальный для живых организмов (Селье, 1961, 1972, 1979), однако впоследствии выяснилось, что существующее многообразие жизненных форм и уровней организации в живой природе не позволяет одинаково интерпретировать стресс у теплокровных животных и беспозвоночных организмов, таких, как насекомые или моллюски. Фундаментальные отличия в строении и функциях нервных систем, степени их вовлечённости в регуляцию гомеостаза, а также в уровнях развития и преобладании значимости клеточной и организменной регуляции метаболизма в данных примерах столь существенны, что для диагностики стресса невозможно использовать одни и те же симптомы (маркеры).
Более того, понятие стресса по-разному интерпретируется экологами,
генетиками, физиологами и биохимиками в связи с существованием разных
форм проявления "органических и физиологических расстройств" у животных на метаболическом, клеточном, морфо-функциональном, популяционном и биоценотическом уровнях организации.
В этой связи важно отметить, что для универсальной диагностики стресса оказываются наиболее важными не столько какие-либо физиологические или биохимические маркеры, сколько определённый сценарий развития событий, индуктором которых в организме послужил стресс. Несмотря на различную природу стресс-индуцирующего воздействия, в нашем случае это химическая структура токсических веществ, степень их токсичности для определённых видов гидробионтов и вероятность попадания в водную среду, организм реагирует, отвечая стереотипным набором биохимических и физиологических реакций, направленных на преодоление нарушений его жизнедеятельности. Этот набор в совокупности именуемый стресс-реакцией (он же — неспецифический адаптационный синдром), обеспечивает так называемую неспецифическую или срочную адаптацию.
Срочная адаптация не является окончательной для организма, а представляет собой первую фазу индивидуальной адаптации, из которой развивается вторая фаза — устойчивая или специфическая адаптация. Её важная особенность состоит в способности, во-первых, повышать устойчивость организма к какому-либо определённому или ряду близких по своей природе раздражителей, а во-вторых, формировать так называемый структурный след, который позволяет полностью устранить нарушения гомеостаза и сохранять эту способность в постадаптационный период.
В литературе имеются многочисленные экспериментальные свидетельства того, что вследствие интоксикации у гидробионтов происходит изменение активности и состава множественных форм целого ряда ферментов, непосредственно не связанных с детоксикацией (Немова, 1996, 2008; Немова и др., 1990). Аналогичная реакция наблюдается в ответ и на другие раздражители, например, радиоактивное, рентгеновское и ультрафиолетовое облучение, повышение температуры воды. В частности, на такие факторы реагируют
многие оксидоредуктазы (глюкозо-6-фосфат-, лактат-, малат-, сукцинат- и
алкогольдегирогеназы) и трансферазы (аспартатаминотрансфераза, гексокиназа), но в гораздо большей степени это относится к ферментам с широкими метаболическими функциями — неспецифичным к субстрату гидролазам (рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза, протеазы, щелочная и кислая фосфатазы, неспецифические эстеразы и др.).
По ряду признаков, это и есть "изменения обмена веществ" как указывал Г. Селье, которые составляют суть неспецифического адаптационного синдрома. Однако в силу чрезвычайной разрозненности и часто противоречивости литературных данных охарактеризовать неспецифическую адаптацию на биохимическом уровне как единый и универсальный механизм сохранения гомеостаза у гидробионтов пока не представляется возможным.
В тоже время, известны и некоторые устойчивые стресс-редуцирующие факторы специфической адаптации. Установлено, например, что большинство токсических веществ подвергается детоксикации путем их постепенной деградации системой цитохромов Р450 (органические вещества) или специфического связывания в неактивные комплексы с металлотионеинами (тяжелые металлы) или иммуноглобулинами (токсины белковой природы и другие антигены). Известны также белки теплового шока или в общем смысле — стресс-белки с невыясненными до конца функциями. Предполагают, что большинство из них играют роль специфических протекторов (например, криопротекторов), некоторые являются сигнальными в генерации стресс-редуцирующих механизмов. Кроме того, описаны белки и другие молекулярные факторы (пептиды, углеводы и их производные), участвующие в изменении проницаемости клеточных мембран, вязкости и плотности жидкостей организма и других физико-химических параметров клеток и тканей.
Очевидно, что, например, повышенное содержание в организме определённых металл отионеинов или иммуноглобулинов, накопление криопротекторов, индукция активности "адаптационных" форм ферментов и др. параметры, выходящие за рамки нормы реакции, являются вполне
убедительными признаками структурного следа специфической адаптации. Тем
не менее, механизмы координации срочных и возникающих позднее устойчивых стресс-редуцирующих факторов, собственно процесс индукции специфической адаптации как результат стресс-реакции на токсическое воздействие остаются пока не известными.
По нашему убеждению, для разрешения проблем экологической биохимии в области теории адаптации необходим систематический подход к исследованию, а именно, анализ динамики изменений широкого круга метаболических параметров (прежде всего, активности ферментов) у ряда гидробионтов разных систематических групп в ответ на токсическое воздействие различной природы, и интерпретация полученных результатов в концепции неспецифической адаптации. Одновременно детальное изучение физико-химических свойств ферментов позволит определить их участие в адаптации как специфических стресс-редуцирующих факторов и таким образом расшифровать механизмы стресс-реакции и адаптации.
Цель и задачи исследования. Основная цель нашей работы — выявление биохимических механизмов стресс-редуцирующей реакции на сублетальную интоксикацию у пресноводных моллюсков и других гидробионтов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Установить основные параметры гидролитических ферментов (активность, тканевую локализацию, состав множественных форм) у пресноводных гидробионтов в норме и выявить их динамику в ответ на слабое токсическое воздействие (на уровне ПДК) в остром опыте.
-
Охарактеризовать универсальные и специфичные аспекты биохимической адаптации в ответ на токсическую нагрузку у разных видов гидробионтов.
-
Выявить механизм стресс-редуцирующей реакции на сублетальное токсическое воздействие и охарактеризовать взаимосвязь биохимических механизмов срочной и устойчивой адаптации у пресноводного моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.).
4. Оценить и обосновать возможность биотестирования и биоиндикации с использованием активности гидролитических ферментов гидробионтов как маркеров токсического загрязнения воды и водоёмов.
Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые охарактеризован механизм метаболической адаптации к токсическому воздействию у живородки речной, включая фазы неспецифической (срочной) и специфической (устойчивой) адаптации, а также процесс их координации с участием комплекса кислых фосфатаз, обладающих различной специфичностью в отношении природных субстратов.
Проанализированы и обобщены изменения ряда физико-химических параметров гидролитических ферментов (общая активность фермента, состав и активность множественных форм) у широкого круга видов пресноводных гидробионтов в ответ на слабое токсическое воздействие. Впервые получены систематические данные о динамике биохимической адаптации у разных видов исследованных животных, которые дополняют классическое представление о неспецифическом адаптационном синдроме (НАС). Эти данные позволяют выявить как индивидуальные особенности разных видов по их стресс-реакции, так и общие (универсальные) закономерности адаптивной динамики метаболизма.
Впервые выделены и охарактеризованы кислые фосфатазы из пищеварительной железы моллюска живородка речная (Viviparus viviparus L.). Определены их физико-химические и функциональные параметры (Rf в 5,7% ПААГ, pi, субстратная специфичность), установлена субклеточная локализация и тканеспецифичность этих ферментов. Кроме того, выделена и подробно изучена индуцибельная (адаптационная) кислая фосфатаза, появляющаяся в ответ на острую интоксикацию хлоридом кадмия.
На основании данных о субстратной специфичности и изменении активности кислых фосфатаз при интоксикации предложена схема участия этих ферментов в адаптивной регуляции гликолиза и накоплении побочных метаболитов (глюкоза, фруктоза, сорбит, глицерин) у пресноводных
гидробионтов.
Установлена роль сорбита в метаболизме живородки речной как криопротектора и фактора устойчивости к токсическому воздействию. Предполагается участие сорбита в индукции апоптоза при исчерпании адаптивного потенциала отдельных клеток. Выявлена динамика содержания сорбита и активности ряда ферментов углеводного обмена в пищеварительной железе моллюска. Показано, что сорбит накапливается в пищеварительной железе моллюска, как при понижении температуры воды, так и острой интоксикации, однако происходит это разными путями, поскольку динамика сопутствующих накоплению сорбита ферментов (кислая фосфатаза, сорбитолдегидрогеназа, альдозоредуктаза) различается в зависимости от характера стресс-индуцирующего воздействия. Это связано с вынужденной оптимизацией регуляторных механизмов в процессе адаптации к определённым неблагоприятным факторам внешней среды и/или необходимостью изменения баланса свободных углеводов (прежде всего, глюкозы и фруктозы) как предшественников сорбита для реализации стресс-редуцирующих реакций организма.
На примере трёх видов моллюсков Viviparus vivparus L., Anodonta stagnalis Gmelin, Unio longirostris Rossmaessler показана изменчивость активности кислой фосфатазы в популяциях живородки речной, обитающих в зонах с различной антропогенной нагрузкой (р. Которосль, г. Ярославль и Ярославская обл.). Исследованы активность и состав множественных форм кислой фосфатазы. Установлены достоверные и очень значительные популяционные различия исследованных биохимических параметров, сохраняющиеся в условиях кратковременного изменения условий обитания (при искусственном переселении).
На основании анализа результатов лабораторных исследований даны обоснованные рекомендации для выбора тест-функции (фермент), тест-объекта (вид животного) и параметров токсикологического эксперимента (продолжительность, концентрация токсиканта). Наглядно продемонстрирован способ биохимического тестирования качества воды в остром опыте с
использованием живородки речной (тест-объект) и гидролитических ферментов (тест-функция).
Практическая значимость. Запатентованный нами способ биохимического тестирования качества воды (патент РФ №2308719) состоит в регистрации изменений суммарной активности кислой фосфатазы и дезоксирибонуклеазы в экстракте пищеварительной железы живородки речной по истечении ряда кратковременных экспозиций моллюсков в тестируемой воде. Этот способ имеет универсальное применение в отношении химической природы токсических веществ и их качественного состава в многокомпонентных смесях, т.к. базируется на концепции о неспецифическом адаптационном синдроме, являющейся частью нашего исследования.
Предложен способ биохимической индикации токсического загрязнения природных водоёмов по сравнительным данным о суммарной активности кислой фосфатазы в экстракте пищеварительной железы трёх видов пресноводных моллюсков (V. vivparus, A. stagnalis, U. longirostris). По сравнению с традиционными методами биологической индикации, данный способ значительно проще для реализации, т.к. не требует глубоких знаний в области морфологии и систематике водных животных. В тоже время он позволяет оценить суммарное токсическое загрязнение водоёма или его определённых зон, и, по сути, не ограничен в применении ареалами изученных видов моллюсков, т.к. может быть отработан и для других видов гидробионтов.
Обоснованность научных положений, выводов, рекомендаций. Научные положения диссертационной работы, выводы и рекомендации являются результатом натурных и лабораторных исследований, проведённых с применением современных биологических, биохимических и физико-химических методов анализа с использованием калиброванной, юстированной и поверенной аппаратуры. Для получения экспериментальных результатов в основном использованы стандартные методы исследований. Корректность полученных результатов подтверждена статистической оценкой сходства и различия выборок при повторных экспериментах и проведении независимых
контрольных исследований.
Положения, выносимые на защиту:
-
В ответ на сублетальное токсическое воздействие (на уровне ПДК) активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов у водных животных меняется циклически, характеризуясь закономерно повторяющимися фазами частичной инактивации и последующей активации через определенные промежутки времени. Эта зависимость представляет собой отражение срочной биохимической адаптации организма к токсическому воздействию, которая, реализуясь на физиологическом уровне, формирует неспецифический адаптационный синдром.
-
У водных животных, разных по уровню биологической организации, существуют универсальные факторы метаболической адаптации к токсическим веществам, которые не зависят от природы токсиканта. Эти факторы обусловлены активностью ферментных систем, напрямую не связанных с детоксикацией, но участвующих в стресс-редуцирующей регуляции обмена веществ и индукции специфических факторов токсикорезистентности. Эти процессы реализуются с помощью множественных форм ферментов, метаболические функции которых могут принципиально отличаться друг от друга, что позволяет производить устойчивые сдвиги обмена веществ (на примере комплекса кислых фосфатаз и их влияния на интенсивность гликолиза и накопление побочных метаболитов).
-
Представления о динамике активности ферментов, участвующих в неспецифической адаптации к токсическому воздействию, могут быть использованы для разработки методов биохимического тестирования и биохимической индикации качества природных и сточных вод.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались I Международной и IV Всероссийской научно-практической конференции "Экология и охрана окружающей среды" (Рязань, 15-16 сентября 1994 г.), VII Съезду Гидробиологического общества РАН (Казань, 14-15 октября 1996 г.), научной конференции "Вузовская наука в решении экологических проблем Верхне-Волжского региона" (Ярославль, 18-19 апреля 1996 г.),
научной конференции "Биологические исследования в Ярославском
государственном университете" (Ярославль, 29 ноября 1997 г.), X Международной научной конференции "Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря и водоемов внутреннего стока Евразии" (Астрахань, 25-30 апреля 2008 г.), Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биоэкологи" (Московский областной государственный университет, 21-24 октября 2008 г.), III Всероссийской конференции по водной токсикологии, посвященной памяти Б.А. Флерова, "Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы" (Борок, 11-16 ноября 2008 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них 10 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ (1 — в печати), 1 монография, 1 патент на изобретение, 1 рукопись, депонированная в ВИНИТИ, 11 статей в материалах международных, всероссийских и др. конференций, 3 статьи в сборниках трудов вузов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о биохимических механизмах адаптации к токсическому воздействию in vivo у гидробионтов, участии различных белков, ферментов и метаболитов в разнообразных молекулярных процессах формирования токсикорезистентности на уровне организма (глава 1); описания биологических объектов, материалов и методов исследования (глава 2); изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных (главы 3-7); заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 382 страницах, содержит 64 таблицы и 52 рисунка, включая диаграммы, графики и фотографии.
Биомаркеры окислительно-восстановительных процессов в экологическом мониторинге природных водоемов
Металлотионеины (в англоязычной литературе — metallothionein, МТ) по своей внутриклеточной специализации относятся к некаталитическим протеинам, предназначенным для связывания катионов металлов и их выведения из метаболизма клеток, своего рода молекулярной консервации. Вообще в обмене веществ различных живых существ задействованы очень многие металлы, относимые по этой причине к микроэлементам (если речь идет о человеке) или биологически значимым ионам (в общебиологическом смысле), такие, например, как Са2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+ (Fe3+), Cu2+, Zn2+, и др., причем по мере накопления знаний о химическом составе живых организмов и развитии методов аналитической химии список таких металлов постепенно расширяется. В зависимости от вида животного, его физиологического состояния или даже времени года для каждого из биологически значимых катионов характерна определенная оптимальная концентрация, которую регулируют металлотионеины.
Кроме того, в природных водах постоянно присутствуют металлы, не являющиеся биологически значимыми для гидробионтов, прежде всего, это так называемые тяжелые металлы (переходные элементы, стоящие в периодической таблице после железа). Только редкие представители тяжелых металлов биологически значимы (Си, Zn), остальные же, представляют собой вещества, токсичные практически в любой концентрации. Обладая высоким сродством к НО- и HS-группам остаткам аминокислот в белках и ненасыщенных жирных кислот в липидах, тяжелые металлы изменяют структуру клеточных и внутриклеточных мембран, полностью или частично нарушая компартментацию и транспортную систему клетки, а также затрудняют образование вторичной структуры белков (особенно, а-спиралей), что приводит к их денатурации уже на стадии синтеза [Gorinstein et al, 2005]. Кроме того, тяжелые металлы являются молекулярными ингибиторами многих ферментов, подменяя другой катион в активном центре [Burlando et al, 2004].
Связывая тяжелые металлы в слабо диссоциирующий комплекс, металлотионеины выступают в качестве мощного фактора детоксикации, причем после взаимодействия с катионами металлов детоксикацию можно считать завершенной. Будучи связанными с металлотионеинами, тяжелые металлы полностью теряют свои токсические свойства и, как следствие, могут значительное время оставаться внутри клетки, циркулировать в организме или накапливаться в специализированных на детоксикации органах — печени (или пищеварительной железе) и почках. В других органах и тканях комплексы «металл-металлотионеин» не накапливаются, эмигрируя практически одновременно с изменением концентрации тяжелых металлов в окружающей среде. В частности, на примере садовой улитки Helix aspersa Mtiller было показано, что содержание Cd2+ и Fe3+ в пищеварительной железе не зависит от концентрации этих металлов в субстрате, тогда как динамика тех же металлов в соединительной ткани положительно кореллировала с загрязненностью внешней среды [Amaral et al., 2004]. В тоже время у половозрелых особей R. decussatus, которых собирали на южном побережье Португалии в течение года, концентрация металлотионеинов в пищеварительной железе менялась вместе с содержанием тяжелых металлов в воде: максимум — в июле-августе, минимум — в январе-феврале [Serafim and Bebianno, 2001], однако, данный факт может быть результатом длительной адаптации моллюсков, в зонах распространения которых имеют место периодические изменения загрязненности воды.
Механизм связывания катионов металлов состоит во взаимодействии с HS- группами в остатках цистена белка. Металлтионенины — весьма богатые цистеином белки: в ряде молекулярных форм, найденных у гидробионтов, насчитывается 20-27 и более остатков цистеина в молекуле [Irato et al, 2001; Vergani et al, 2005]. Интересно, однако, заметить, что при столь единообразном механизме инактивации различных катионов металлов металлотионеины являются высокоспецифическими белками, каждый из которых связывает катион только определенного металла. Например, Cd у наземного моллюска Сераеа hortensis Muller индуцирует синтез исключительно Cd-MT вне зависимости от содержания в субстрате других токсикантов, причем накопление этого белка находится в логарифмической зависимости от концентрации Cd и потому может являться чувствительным количественным маркером загрязнения среды кадмием [Dallinger et al, 2004].
Аналогичные белки — Cd-MT и Cu-MT были найдены у виноградной улитки Helix pomatia L., причем биосинтез Cd-MT происходил исключительно в пищеварительной железе, a Cu-MT — в мантии [Dallinger, Chabicovsky and Berger, 2004]. Похожие черты индукции металлотионеинов обнаружены у мидии Mytilus edulis L.. В ответ на интоксикацию моллюсков ионами Cd и Hg через 21 день в жабрах, пищеварительной- железе и мантии появляются белки с молекулярной массой 12 Ша (мономер) и 20 kDa (димер). С помощью ионообменной хроматографии было показано, что они представляют собой шесть различных белковых компонентов, причем один из них обнаружен только в жабрах после экспозиции с Cd [Geret and Cosson, 2002]. Более того, разные концентрации Cd индуцируют у мидий разные изоформы » металлотионеинов: мономер MT10IV обнаруживается после экспозиции 0-4- — моллюсков в растворе 200 мкг Cd /л, димер МТ 20 II появляется в 400 мкг Cd /л при одновременной репрессии МТ 10 IV [Ciocan and Rotchell, 2004]. В другой работе изменения содержания мРНК тех же МТ 10 и МТ 20 исследовали у мидии Mytilus galloprovincialis Lamarck после индукции in vivo методом количественной ПЦР с детекцией продуктов в реальном времени. Совершенно аналогично было показано, что образование мРШС МТ 20 по сравнению с МТ 10 происходит только под воздействием гораздо больших концентраций металлов (при одновременном снижении количества мРНК МТ 10). Кроме того, установлено, что МТ 10 индуцируют Cd2+, Zn2+ и Cu2+, тогда как МТ 20 в большей степени зависим от Cd2+ и Hg2+ [Dondero et al, 2005].
Энзимэлектрофорез множественных форм ферментов в полиакриламидном геле
В исследовании апоптоза у беспозвоночных гидробионтов наблюдается ситуация, похожая на разработку вопроса о детоксикации ксенобиотиков. Механизмы регуляции и реализации этих процессов одинаково сложные и зависимые от огромного числа внешних и, особенно, внутренних факторов, подавляющее большинство из которых описано для человека, и списки эти продолжают постоянно пополняться, а сами механизмы — усложняться всё более и более. На этом фоне знания по беспозвоночным животным кажется безнадежно отстали, однако, это лишь на первый взгляд. У достаточно многих животных идентифицированы белки-гомологи каспаз, их индукторов, активаторов и репрессоров, но, прежде всего, убедительно показано, что апоптоз у них существует и реализуется очень похожим способом — фрагментацией геномной ДНК на олигонуклеотиды размером около 200 п.н. [Kroemer, Zamzami and Sus in, 1997].
Межнукеосомная фрагментация ДНК, выявляемая, например, электрофорезом и хорошо известная как признак апоптоза млекопитающих (человек, кролик, крыса, мышь), мух дрозофил и нематоды С. elegans, была изучена у моллюсков Mytilus galloprovincialis Lamarck в остром опыте с органическими производными олова, которые часто используются в качестве индукторов апоптоза. Показано, что в отличие от человека, распад ДНК в жабрах мидий может быть вызван только трибутилоловом, но не 4-нитрохинолин-1М-оксидом, бензо(а)пиреном и другими известными генотоксическими веществами, а следовательно, не може? в полной мере считаться отражением апоптоза у моллюсков, живущих под воздействием промышленных загрязнений в природных популяциях [Місіс efa/.,2002].
У восточной устрицы {Crassostrea virginica Gmelin) исследовали частоту апоптоза в клетках гемолимфы при участии одноклеточных паразитических организмов. Межнуклеосомные фрагменты при этом детектировали чрезвычайно точным методом — гибридизацией in situ с использованием меченого дигоксигенином зонда, выявляли который иммуногистохимически конъюгированным с пероксидазой антидигоксигенином. Это позволило добиться значительно больщей чувствительности по сравнению с непосредственным наблюдением фрагментов после электрофореза, а также не требовало выделения ДНК из клеток и, соответственно, исключало возможность ее случайного повреждения. Выяснилось, что у инвазированных устриц апоптоз выражен значительно слабее по сравнению со здоровыми, особенно в соединительной ткани, жабрах и эпителии мантии. По всей видимости, апоптоз тормозят паразиты, тем самым, повышая количество клеток, пригодных для их роста и размножения. При- запрещении распространения плазмодиев между отдельными особями устриц в лабораторном эксперименте, число апоптозирующих клеток значительно увеличивается [Sunila and LaBanca, 2003].
Еще одна модификация метода выявления регулярной фрагментации генома была применена для исследования апоптоза у Ceratostoma foliatum Gmelin и гигантсокой устрицы Crassostrea gigas Thunberg. Межнуклеосомные фрагменты выявляли путем их концевого мечения с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и субстрата — меченого дУТФ (англоязычное название метода — terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL) и полагают, что разработанная и использованная в работе методика позволяет более точно определять фрагменты ДНК в клетках [Buckland-Nicks and Tompkins, 2005]. С помощью такой же техники авторы другой работы нашли, что апоптоз в гемоцитах устрицы С. gigas могут вызвать пептиды Arg-Gly-Asp, легко проникающие внутрь клетки и работающие в качестве лигандов, которые модулируют активность регуляторных белков [Terahara, Takahashi and Mori, 2005].
Изучение динамики суммарной активности ферментов в остром токсикологическом эксперименте
Качественный состав множественных форм ферментов определяли методом диск-электрофореза по Дэвису в вертикальных блоках ПААГ (концентрация сепарирующего геля составляла в разных вариантах от 5,7 до 8,0%) [Davis, 1964]. Индивидуальную активность множественных форм определяли путем денситометрии полученных энзимограмм и интегрирования пиков, соответствующих зонам активности на энзимограмме, выражали в процентах от суммарной активности фермента или единицах активности, если суммарная активность была известна.
Зоны активности кислых фосфатаз на электрофореграмме выявляли при инкубации блока ПААГ в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,8 или оптимальный) с субстратом (а-нафтилфосфат, 30 мг/100 мл раствора; нафтол AS-BS или нафтол AS-BI, 50 мг/100 мл раствора, предварительно растворить в 1 мл ДМФА) и красителем прочным синим Б (30 мг/100 мл раствора) при 37С в течение 20-30 мин (следили за степенью окрашивания зон активности и фона). Зоны активности проявлялись как малиновые (с а-нафтилфосфатом), тёмно-синие (с нафтолом AS-BI) или фиолетовые (с нафтолом AS-BS) полосы на слабо-жёлтом фоне геля [Лойда, Госсрау и Шиблер, 1982].
Зоны дезоксирибонуклеазной активности выявляли окрашиванием остаточных количеств ДНК (коммерческий препарат ДНК из эритроцитов цыплёнка, заполимеризована в сепарирующий гель, Імг/Юмл раствора для геля) метиленовой синью после предварительной инкубации блока ПААГ в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,6) при 37С в течение 60 мин. Рабочий 0,2% раствор метиленовой сини готовили непосредственно перед употреблением на 0,05 М ацетатном буфере, куда погружали блок ПААГ после инкубации на 30 мин. Избыток метиленовой сини удаляли 3-4 сменами 5% уксусной кислоты до достижения необходимой окраски. Зоны активности проявлялись как бесцветные полосы на синем фоне геля [Boyd, 1970].
Зоны активности кислых протеиназ выявляли модифицированным методом желатиновых реплик с блока ПААГ [Конарев, 1986], полученном на засвеченной, проявленной, -зафиксированной, тщательно промытой и высушенной фотобумаге (марки «Берёзка», на полиэтиленовой основе). Для этого блок ПААГ после электрофореза выдерживали по 10 мин в трёх сменах 0,05 М фосфатно-цитратного буфера (рН 2,6), последний раз — при 37С. Гель слегка подсушивали на салфетке, накладывали на лист подготовленной фотобумаги, накрывали двумя листами фильтровальной бумаги (вырезаны на 5 мм меньше размеров блока ПААГ), смоченной инкубационным буфером, закладывали между двумя стеклянными пластинами и скрепляли зажимами типа «бульдог». Конструкцию выдерживали при 37С в течение 20-90 мин (время оптимизировали для каждого исследованного вида животных). В качестве субстрата для протеиназ служил желатин эмульсионного слоя фотобумаги, поэтому в контактном отпечатке зон локализации фермента эмульсия разрушалась, и соответствующие участки становились белыми. Общий фон отпечатка при этом оставался чёрным.
Изоэлектрофокусиованию подвергали экстракты белков отдельных субклеточных фракций (лизосомальная, цитозольная), предварительно очищенные диализом против дистиллированной воды. Содержание общего белка по Бредфорд в экстрактах составляло 5-10 мг/мл.
Изоэлектрофокусирование проводили на пластине ПААГ (аналитически) или в толще гранулированного геля марки Ultrodex (препаративно) с амфолинами, имеющими диапазон значений рН от 3,5 до 9,5. Электродными растворами служили 1 М Н3РО4 (для анода) и 1 М NaOH (для катода). Пробу белков наносили на поверхность ПААГ (с помощью фрагмента фильтровальной бумаги 5x5 мм) или в толщу гранулированного геля (с помощью рамки-компаратора в объеме 3 мл).
В течение первых 2 часов изоэлектрофокусирования через каждые 20 мин падение силы тока компенсировали, затем продолжали процесс ещё 14-15 часов, пока падение силы тока не прекращалось, достигнув 4-5 мА, температуру поддерживали постоянной и равной 5С По окончании разделения от пластины ПААГ отделяли участок, незанятый белками, фрагментировали её (поперёк направления тока) и суспендировали фрагменты в пробирках с 1 мл 0,15 М раствора NaCl, после отстаивания суспензии измеряли рН супернатанта и строили калибровочную кривую «длина геля—рН», по которой определяли изоэлектрические точки исследуемых белков. Часть пластины, занятую белками, окрашивали по протоколу выявления электрофоретических зон активности кислой фосфатазы (см. раздел 2.2.2). Фрагменты гранулированного геля суспендировали в пробирках с 3 мл 0,15 М NaCl, измеряли рН супернатанта, после чего супернатант отделяли декантацией, диализовали против тысячекратного объёма 0,15 М NaCl, а затем использовали для определения концентрации белка методом Лоури и активности кислой фосфатазы спектрофотометрическим методом (см. раздел 2.2.1).
Динамика активности сопутствующих ферментов
Нередко такие ферменты называют изоферментами, особенно популярен синонимичный термин «изоэнзимы» или «изозимы» (в англоязычной литературе — isoenzymes, isozymes), обозначающий ферменты с похожей биологической активностью, но отличающиеся происхождением в разных клетках и тканях. В генетике употребимы термины изозимы (кодируются генами-гомологами) и аллозимы (кодируются аллельными генами). Обозначение «молекулярные формы» ферментов, подчёркивающее различие ферментов по молекулярной структуре, имеет тот же смысл, что и изоферменты, именно так чаще всего называют 5 форм лактатдегидрогеназы, которые отличаются набором субъединиц, образующих четвертичную структуру фермента [Baron, 1965].
Существует и другой более общий термин — «множественные формы» ферментов (в англоязычной литературе — multiple forms), обозначающий все ферменты, имеющие сходное функциональное значение. Однако большое число авторов ограничиваются технологическими терминами, происходящими от использованного метода разделения и идентификации ферментов, такими, например, как зона активности на энзимограмме (после электрофореза или изоэлектрофокусирования) или фракция (после ультрацентрифугирования, гельфильтрации или ВЭЖХ). В этих случаях имеются ввиду ферменты, охарактеризованные по какой-либо модельной реакции, но отличающиеся физико-химическими параметрами (размером молекулы, зарядом, наличием определённых функциональных групп). Сходное биологическое значение остаётся неочевидным, поскольку условия выявления ферментативной активности после фракционирования (состав буфера, рН, субстрат) далеко не всегда позволяют дифференцировать отдельные ферменты, особенно когда они обладают широкой субстратной специфичностью.
Обнаруженные нами на электрофореграммах зоны активности ферментов, скорее всего, также не во всех случаях являются их множественными формами и вообще родственными ферментами — компонентами одного функционального комплекса. В частности, существует целый ряд гидролаз, разрушающих белок (например, БСА), это и неспецифические экзопептидазы, специфические и неспецифические эндопептидазы (протеиназы), наконец, вполне определённые пищеварительные ферменты, такие как пепсин и трипсин. Эти ферменты могут быть выявлены на электрофореграмме с одним и тем же субстратом (также как при определении их суммарной активности), но в этом случае использование термина «множественные формы фермента» скорее-всего, будет не вполне корректно, а значит и стресс-редуцирующую реакцию отдельных протеиназ следует рассматривать как настройку целого ряда метаболических превращений, охватывающих субклеточное «пищеварение», защиту от патогенных белков, реализацию механизма автолиза клеток, распад эндогенных белков, влияние на проницаемость субклеточных мембран и т.д.
Вышесказанное в полной мере касается и дезоксирибонуклеаз, среди которых нам удалось выявить ферменты, близкие по описанию с эндонуклеазой, фрагментирующей геномную ДІЖ при апоптозе, а таюке ДНКазы, обладающие большим сродством к экзогенной ДНК и являющиеся, скорее всего, пищеварительными ферментами (данные получены и опубликованы совместно с А.П. Поповым и А.С. Коничевым).
В этом отношении кислые фосфатазы — значительно более удобный объект исследования, поскольку характерным признаком кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) является гидролитическая активность в отношении синтетического субстрата (не имеющего природных аналогов), такого как /7-нитрофенилфосфат или а-нафтилфосфат в среде с кислым рН. По этому признаку кислые фосфатазы можно отличить от других гидролитических ферментов. Кроме того, у большинства гидробионтов кислые фосфатазы представлены значительно меньшим числом множественных форм, что облегчает анализ динамики их активности в состоянии стресса, а при необходимости упрощает процедуру их количественной характеристики по энзимограмме или препаративной очистки до гомогенного состояния. Кстати, по этой причине именно качественный и количественный анализ кислых фосфатаз широко используются в клинической диагностике [Baron, 1965; Андреев и Андерсоне, 1978; Li, Jam and Lam, 1970], хотя это, пожалуй, единственная область практического применения знаний о молекулярной гетерогенности ферментов.
