Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЭКОЛОГИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ (обзор литературы) 12
1.1. Распространение светящихся бактерий и их роль в симбиозе с высшими организмами 12
1.2. Основы бактериального свечения 16
1.3. Происхождение и биологический смысл бактериальных люминесцентных систем 18
1.4. Значение кислорода в метаболизме светящихся бактерий 22
1.5. Токсические эффекты молекулярного кислорода и его активных форм 23
1.6. Механизмы защиты бактерий от окислительного стресса 26
1.7. Использование бактериальных люминесцентных систем в интегральном анализе 33
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 1 35
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36
2.1. Объекты исследований 36
2.2. Культивирование бактерий. Определение скорости роста и регистрация свечения 38
2.3. Регистрация генерации бактериями активных форм кислорода 39
2.4. Определение активности антиоксидантных ферментов каталазы и супероксиддисмутазы 39
2.5. Определение активности биолюминесцентных ферментов люциферазы и НАДН: ФМН оксидоредуктазы 41
2.6. Индукция у бактерий окислительного стресса. Ингибирование каталазы 42
2.7. Определение содержания малонового диальдегида, показателя интенсивности окислительного стресса 42
2.8. Определение окислительного стресса биолюминесцентным методом в биологических образцах 43
2.9. Регистрация свечения и спектров люминесценции в присутствии малонового диальдегида 45
2.10. Статистическая обработка результатов 45
2.11. Реактивы, материалы и приборы 45
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СИСТЕМ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА 47
3.1. Генерация активных форм кислорода фотобактериями в процессе роста 48
3.2. Активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем в зависимости от фаз роста бактерий 50
3.3. Влияние окислительного стресса на активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi 56
3.4. Активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем темнового штамма Vibrio harveyi 64
3.5. Влияние окислительного стресса на активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi в условиях ингибирования каталазы 66
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 3 72
ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕАКЦИИ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ 74
4.1. Мониторинг окислительного стресса в экстрактах тканей и сыворотке крови крыс с использованием лиофилизированных фотобактерий 75
4.2. Контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках перфузируемой печени гипертермированных крыс с использованием биферментной биолюминесцентной системы in vitro 80
4.3. Изучение малонового диальдегида в качестве возможного субстрата бактериальной люминесцентной реакции 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 4 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
ВЫВОДЫ 91
ЛИТЕРАТУРА 92
- Токсические эффекты молекулярного кислорода и его активных форм
- Определение активности биолюминесцентных ферментов люциферазы и НАДН: ФМН оксидоредуктазы
- Влияние окислительного стресса на активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi
Введение к работе
Актуальность проблемы. Кислород является необходимым условием существования всех аэробных организмов. В биологических реакциях и под действием различных физико-химических факторов окружающей среды образуются продукты неполного восстановления 02, более реакционно-способные и обладающие высокой токсичностью для клетки (Афанасьев, 1984; Владимиров и др., 1991; Зенков, 1993; Владимиров, 1998). В процессе эволюции у некоторых видов бактерий появилась способность к генерации активных форм кислорода (АФК), которую они используют для колонизации других организмов, в межвидовой конкуренции или как сигнальную систему (Denis et.al., 1989; Warren et.al., 1990; Kuo et.al., 1995). Собственную безопасность бактерии обеспечивают с помощью мощных систем антиоксидантной защиты.
Светящиеся бактерии распространены по всему Мировому океану, от тропических до полярных широт, и от поверхностных слоев до глубин в несколько тысяч метров. Фотобактерии выделены свободноживущими из морской воды, с поверхности морских животных и из кишечников рыб, как симбионты из бактериофотофоров рыб и головоногих моллюсков (Nealson, Hastings, 1979). Считается, что существование в морской воде в свободном состоянии является транзитной фазой между хозяевами (Гительзон и др., 1985).
В большинстве случаев из одной рыбы выделялся лишь один штамм фотобактерий (Hastings, Mitchell, 1971; Reichelt, Nealson, 1977). Возможно, бактерии обладают определенной антимикробной способностью, в отношении которой у них есть собственные системы защиты, либо хозяин создает условия, в которых выживает только данный вид бактерий. Такая высокая избирательная способность хозяина селектировать вид и штамм симбионта поразительна. Чрезвычайный интерес представляет выяснение ее механизма.
7 Возможность генерации в среду АФК фотобактериями, по аналогии с несветящимися видами, предполагают некоторые авторы (Лабас и др. 1996, 1999). Для устранения токсического эффекта молекулярного кислорода и его активных форм у бактерий имеется «классическая» ферментативная антиоксидантная система (АОС). Бактерии с отсутствием такой системы защиты обладают низкой симбиотической способностью (Martin, Fridovich, 1981; Visick, Ruby, 1998;. Redford et. al.,1990).
Кислород является необходимым компонентом дыхания и люминесцентной реакции. В основе свечения бактерий, как и других живых организмов, лежит катализируемая специфическими ферментами химическая реакция, которая сопровождается излучением квантов видимого света. Ферменты называют люциферазами, а окисляемые ими субстраты - люциферинами (Hastings, Nealson, 1977; Гительзон и др., 1984; Lee, 1985; Tu, Mager, 1995).
Хотя люциферазы разных видов светящихся бактерий отличаются по своим физическим и кинетическим свойствам, все они катализируют одну и ту же реакцию:
люцифераза
OMHH2 + RCHO + 02 OMH + RCOOH + H20 + /*v
Здесь ФМН и ФМНН2 - окисленная и восстановленная форма флавинмононуклеотида, RCHO и RCOOH -длинноцепочечный алифатический альдегид и соответствующая жирная кислота. Восстановление ФМН может осуществляться ферментативным путем с помощью НАДН: ФМН-оксидоредуктазы:
НАДН: ФМН-оксидоредуктаза
ФМН + НАДН + Н+ ФМН Нг + НАД;
В возбуждении биолюминесценции могут участвовать активные кислородные радикалы (Кратасюк и др., 1977; Watanabe, Nakamura, 1976; Watanabe et.al., 1993; Wada, 1997) и алифатические альдегиды, продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран (Берия и др., 1991;
8 Berkovich et. al., 1991; Ulitzur, 1991). Инициация процессов ПОЛ осуществляется при взаимодействии АФК с полиненасыщенными жирными кислотами. В условиях окислительного стресса происходит увеличение интенсивности ПОЛ (Cross et. al., 1987; Gutteridge, Halliwell, 1990; Halliwell, Chirico, 1993). В связи с вышеизложенным, предполагают, что люминесцентная система является аналогом антиоксидантной и участвует в защите бактерий от окислительного стресса. Антиоксидантный генезис биолюминесценции рассматривают для фотобактерий (Лабас, 1990; Gitelson, Labas, 1993; Watanabe,1993); светляков (Barros, Bechara,1998) и морских эукариот (Rees et al.,1998; 2000). Генерация АФК фотобактериями в условиях высокой активности собственных систем защиты создает огромное преимущество в межвидовой конкуренции и способствует колонизации многоклеточных организмов.
Цель исследования. Изучить роль люминесцентной реакции фотобактерий в защите от окислительного стресса.
Задачи исследования:
Исследовать возможность генерации фотобактериями АФК в процессе роста.
Определить активность основных ферментов АОС каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) у светящихся бактерий видов Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi и рекомбинантного штамма Escherichia coli.
Изучить особенности свечения и уровень активности АОС в динамике роста бактерий Vibrio harveyi.
В условиях индуцированного окислительного стресса определить кинетические параметры роста, свечения, активность основных ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi.
Провести сравнительный анализ активностей ферментов антиоксидантнои и люминесцентной систем у светящегося и несветящегося мутантного штаммов Vibrio harveyi.
Исследовать возможность участия малонового диальдегида (МДА) в качестве субстрата бактериальной люминесцентной реакции в отсутствии алифатического альдегида in vitro.
7) На основе выявленных закономерностей изучить возможность
использования бактериальных люминесцентных систем для мониторинга
окислительного стресса в биологических образцах (экстрактах тканей,
сыворотке крови, перфузате).
Научная новизна и теоретическая значимость работы.
Впервые показана генерация АФК фотобактериями в экспоненциальной фазе роста.
Впервые изучена совместная роль антиоксидантнои и люминесцентной систем фотобактерий в механизмах антиоксидантнои защиты. Показано, что окислительный стресс является общим пусковым механизмом для проявления повышенной активности ферментов антиоксидантнои и люминесцентной систем, что подтверждается кинетическими параметрами свечения и активностью люциферазы бактерий Vibrio harveyi, увеличивающейся наряду с увеличением активности ферментов антиоксидантнои защиты.
Впервые проведен сравнительный анализ активности ферментов антиоксидантнои и люминесцентной систем у светящегося и несветящегося мутантного штаммов бактерий Vibrio harveyi. Показаны более высокие значения активности антиоксидантных ферментов мутантного штамма, вероятно являющиеся признаком адаптации.
Впервые показана возможность участия МДА в качестве субстрата бактериальной люминесцентной реакции в отсутствии алифатического альдегида, что является дополнительным основанием для использования
/
10 биолюминесценции при изучении окислительных патологических процессов в клетке.
Практическая значимость работы. Впервые предложены методы мониторинга окислительного стресса в биологических образцах (материалах), с использованием бактериальных биолюминесцентных систем in vitro и in vivo.
Положения, выносимые на защиту:
1. Экологическая роль биолюминесцентной реакции состоит в защите
фотобактерий от АФК, являющихся результатом собственной
цитотоксической секреции.
2. Окислительный стресс является общим пусковым механизмом
регуляции антиоксидантной и люминесцентной систем светящихся
бактерий.
3. Мониторинг окислительных патологических процессов в биологических
образцах может осуществляться с использованием бактериальной
биолюминесценции.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы доложены и обсуждены на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); 10-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Болония, Италия, 1998); XIII Биофизическом конгрессе (Нью Дели, Индия, 1999); 1-ом Французском собрании по химии окружающей среды (Нэнси, Франция, 2000); 4-й Международной конференции по биологической физике (Киото, Япония, 2001); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); 2-й Европейской конференции по медицинской и биологической инженерии (Вена, Австрия, 2002); Международном Экологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2003); а также на ряде Международных и Всероссийских экологических студенческих конференциях (1999, 2000, 2002).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов и материалов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, двух глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы (234 источника, в том числе 179 - зарубежных). Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., профессору В.А. Кратасюк, научному консультанту к.б.н. Г.А. Выдряковой, сотрудникам лаборатории фотобиологии ИБФ к.ф-м.н. Н.С. Кудряшевой, к.б.н СЕ. Медведевой, к.б.н. Э.К. Родичевой, к.б.н. Н.А. Тюльковой, к.б.н., профессору КрасГУ Н.М. Титовой, к.б.н. Т.Н. Замай, к.б.н. Инжеваткину Е.В. за неоценимую помощь в проведении экспериментальных работ и обсуждении полученных результатов.
Отдельная благодарность - ведущему научному сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, к.б.н. Ю.А. Лабасу и зав. кафедрой экотоксикологии и микробиологии Красноярского государственного университета к.б.н., профессору КрасГУ Ю.С. Григорьеву за идейное вдохновение и ценные советы.
Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН и Красноярском государственном университете, при поддержке Министерства образования Российской Федерации, грант «Университеты России» УР. 11.01.016, Красноярского краевого фонда науки, грант № 10F 233 С и гранта REC -002 программы «Фундаментальные исследования и высшее образование» Министерства образования Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития для независимых государств бывшего Советского Союза.
Токсические эффекты молекулярного кислорода и его активных форм
Как фактор внешней среды Ог воздействует на современные прокариотные организмы двояко: с одной стороны, он может быть абсолютно необходимым, с другой — с молекулярным кислородом и его производными связаны токсические эффекты для клеток.
Молекулярный кислород сам является токсическим соединением, агрессивное действие которого связано со способностью окислять клеточные метаболиты, необходимые для функционирования в восстановленном состоянии (Эрснер, 1986; Fridovich, 1997; Kogure, 1998; Voeikov, 2001). Токсический эффект Ог зависит от условий, при которых происходит взаимодействие с ним организмов: концентрации растворенного Ог, длительности экспозиции, состава окружающей среды (Метелица, 1982; Шлегель, 1982; Афанасьев, 1984; Рубин и Шинкарев, 1984; Фридович, 1979). Например, для проявления токсического эффекта вполне достаточно окисления им какого-либо одного ключевого метаболита или фермента, приводящего к их инактивации (Davies, 1995).
Помимо существования в основной форме в биологических реакциях и под действием различных физико-химических факторов возникают продукты неполного восстановления 02, более реакционно-способные и обладающие высокой токсичностью для клетки. Как известно, для полного восстановления молекулярного кислорода, приводящего к образованию молекулы воды, требуются 4 электрона: 02 + 4Н4" + 4е —+ 2Н20.
У большинства прокариот имеются ферменты, катализирующие реакции одновременного переноса 4 электронов на 02, при которых не обнаружено каких-либо промежуточных продуктов восстановления 02. Это цитохромоксидазы и некоторые медьсодержащие ферменты. Возможно, что в этих реакциях и возникают короткоживущие продукты неполного восстановления 02, но они остаются связанными с ферментами, не выходят в цитоплазму и практически не наносят вреда клетке (Виноградова, 1978; Владимиров и др., 1991; Владимиров, 1998; Kanter, 1998).
Если восстановление молекулярного кислорода происходит ступенчато, то образуются высоко реакционно-способные нестабильные метаболиты. Наиболее известными и хорошо изученными АФК являются супероксидный анион - радикал (02 ) , который может протонироваться с образованием нейтрального гидропероксидного радикала ( Н02); гидроксидный радикал ( ОН), превосходящий 02 по окислительной активности и токсичности; пероксид водорода (Н202); синглетный кислород (CV); перекисный радикал (R02 ); алкоксильный радикал (RO ) и оксид азота (NO) (Каган и др, 1985; Cadenas, 1989; Владимиров, 1998; Fridovich, 1998; Demple, 1999; Chenet.al., 1999; Haliwell, 2003).
Супероксидные анионы генерируются при взаимодействии с молекулами 02 различных компонентов (восстановленные флавины, хиноны, тиолы, FeS-белки), а также в реакциях, катализируемых рядом флавопротеиновых ферментов. Помимо реакций биологической природы 02 могут возникать вне клетки в водных растворах при воздействии на них ультразвуком, в результате фотохимических, химических и электрохимических процессов (Фридович, 1979; Nunoshiba et.al., 1999). Экзогенно возникшие Ог могут проникать в клетку и (наряду с эндогенными) участвовать в реакциях, приводящих к различным повреждениям: перекисном окислении ненасыщенных жирных кислот, окислении SH-групп белков, повреждении ДІЖ и др. (Bollomo, 1987; Барабой и др., 1992; Keyer et.al., 1995; Beckman, Ames, 1997; Henle, Linn, 1997; Douki et.al., 1998; Mclntyre et.al., 1999; Takeuchi et.al., 1999). Токсичность супероксидных анионов может увеличиваться за счет вторичных реакций, ведущих к образованию гидроксидных радикалов ( ОН) и синглетного кислорода. Источником возникновения ОН могут служить также реакции одноэлектронного окисления перекиси водорода, катализируемые железосодержащими соединениями, всегда имеющимися в клетках (Зенков, 1993; Button et.al., 1998; Haliwell, 2003).
Источником H2C 2 могут быть реакции автоокисления некоторых негемовых FeS-белков, реакции дисмутации супероксидных радикалов. Перекись водорода образуется у всех аэробов и факультативных анаэробов, растущих в аэробных условиях, может быть обычным продуктом метаболизма некоторых бактерий, так что ее возникновение в клетках прокариот — естественный процесс (Denis et. al., 1989; Halliwell, 1996). У большинства аэробных прокариот Н2О2 быстро разлагается с помощью гемсодержащих ферментов каталазы и пероксидазы. В отсутствие их Н2О2 может накапливаться в летальных для организма концентрациях. Перекись водорода наиболее стабильная и менее реакционноспособная форма активного кислорода, она опасна не из-за прямого взаимодействия с компонентами клетки, а тем, что, реагируя с 02 или ионами Fe2+, может приводить к образованию гидроксидного радикала. Синглетный кислород агрессивен в отношении биосубстратов, в особенности в отношении молекул с двойной связью; конечным итогом таких реакций обычно является образование гидроперекисей органических молекул — один из важнейших этапов в процессах перекисного окисления ненасыщенных липидов в биомембранах (Gutteridge, Halliwell, 1990; Halliwell, Chirico, 1993; Dix, Aikens, 1993; Porter et. al., 1995; Steinberg, 1997). Кроме жирных ненасыщенных кислот, окислительной модификации подвергаются и функционально значимые белки, что ведет к повреждению структуры, и в конечном счете потере активности (Davies et.al., 1987; Дубинина, Шугалей, 1993; Tamarit et.al., 1998; Chang et.al., 2001; Дубинина и др., 2002).
В процессе эволюции у некоторых видов бактерий появилась способность к собственной генерации АФК, которую они используют для колонизации других организмов, межвидовой конкуренции и как сигнальную систему (Kalyanaraman, Sohnle, 1985; Hoehler et. al., 1996; Fidopiastis et. al., 1998, 1999; Nishiguchi et. al., 1998; Ruby, Lee, 1998; Ruby, McFall-Ngai, 1999; Ruby, 1999; Hastings, , Greenberg, 1999; Steinert et. al., 2000).
Определение активности биолюминесцентных ферментов люциферазы и НАДН: ФМН оксидоредуктазы
Активность люциферазы оценивали по максимальной интенсивности люминесценции при 25 С в реакции, инициированной впрыскиванием 0,5 мл фотовостановленного ФМН (5хЮ"5М в растворе 10"2М ЭДТА, рН 6,8) в кювету, помещенную перед фотоумножителем ФЭУ 64 и содержащую 10 мкл образца, 0,440 мл 0,02 М Калий-фосфатного буфера (рН 7,0) и 50 мкл 0,025% водного раствора альдегида (Hastings, Gibson, 1963). Интенсивность сигнала регистрировали, используя самопишущий потенциометр LKB (Bromma). За единицу активности люциферазы принимали сигнал в 1 квант/сек. Удельную активность определяли в относительных единицах.
Активность НАДН: ФМН оксидоредуктазы определяли спектрофотометрическим методом по начальной скорости убыли поглощения НАДН при 340 нм (Петушков и др, 1984). Реакционная смесь содержала 0.1 мл исследуемого экстракта, 0,1 мл 5 10"4 М ФМН, 0,9 мл. 0,05 М Калий-фосфатного буфера (рН 7.0). Реакцию запускали добавлением 0,02 мл. 10" М НАДН. За единицу активности принимали убыль 1 мкмоля НАДН за 1 мин. От полученной скорости реакции вычитали фоновую скорость неферментативного окисления ФМН. Активность рассчитывали по формуле:
А=(АУрЄакц- АУфОН) /є, где V - скорость реакции; s - коэффициент молярной экстинкции, равный для НАДН при 340 нм 6.22 місМ см"1.
Активность фермента рассчитывали, учитывая количество белка в реакционной пробе.
Индукцию окислительного стресса и ПОЛ у бактерий осуществляли следующим образом: в среду культивирования бактерий вносили ионы двухвалентного железа в форме 1,5 мМ FeS04 и перекись водорода Н202 в концентрациях 1 мМ и 2,5 мМ. Железо вносили до инокуляции бактерий, Н2О2 вносили в среду в экспоненциальной фазе роста в точке максимального свечения. Аналогичным образом вносили в среду культивирования и ингибитор каталазы 3-амино 1,2,4 триазол. Пробы для определения активности ферментов отбирали до внесения Н2О2 и ингибитора, и через час последующего культивирования. Пробы в экспериментах с ионами железа отбирали в фазе экспоненциального роста (в точках максимума интенсивности свечения, на спаде свечения) и фазе замедления роста бактерий
Интенсивность окислительного стресса оценивали по содержанию вторичных продуктов процессов ПОЛ активных в отношении тиобарбитуровой кислоты (ТБК- активные продукты), в частности малонового диальдегида.
Определение содержания малонового диальдегида, показателя интенсивности окислительного стресса В основе метода лежит определение окрашенных продуктов, образующихся в результате взаимодействия малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей с 2 - тиобарбитуровой кислотой (ТБК) при нагревании пробы в кислой среде, которые имеют максимум поглощения в красной области видимого спектра при длине волны X = 532 нм и 600 нм (Ко, Godin, 1990).
Ход определения: К 0,2 мл исследуемого образца добавляли 0,8 мл калий - фосфатного буфера с рН = 7,0 и 0,5 мл 30% тетрахлоруксусной кислоты (ТХУ), перемешивали и оставляли на льду 1 час. Затем центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин.
1 мл супернатанта переносили в сухую пробирку, добавляли 0,075 мл 0,1 М раствора ЭДТА, 0,25 мл 1% раствора ТБК, и ставили в кипящую водяную баню на 15 минут. В контрольной пробе супернатант заменяли равным количеством дистиллированной воды. Затем пробирки охлаждали до комнатной температуры и измеряли поглощение при X = 532 нми1 = 600 нм. Расчет концентрации МДА производили по формуле: С = (D532 -D6oo) f7s5 где D532—оптическая плотность при X = 532; D6oo—оптическая плотность при X = 600; f—коэффициент разведения; е—коэффициент молярной экстинкции хромогена, равный 1,56 105 М см"1. Расчет концентрации ТБК - активных продуктов производили по формуле: С = (D532+D6oo) s.
Концентрацию МДА выражали в мкмоль на 1 мл исследуемого образца.
Влияние окислительного стресса на активность ферментов антиоксидантной и люминесцентной систем бактерий Vibrio harveyi
Для доказательства взаимного участия антиоксидантной и люминесцентной систем в механизмах антиоксидантной защиты бактерии подвергали окислительному стрессу. Окислительный стресс вызывали добавлением в среду культивирования бактерий двухвалентного железа и пероксида водорода.
В экспериментах с добавлением в среду культивирования двухвалентного железа было показано, что при совпадении кривых роста опыта и контроля, индукция люминесценции в присутствии железа начинается раньше, а интенсивность люминесценции достоверно выше (рк 0,001) (Рис.3.5.). Абсолютные значения по активности ферментов в условиях окислительного стресса приведены в таблицах 3.5.; 3.6. Активность люциферазы в точке максимальной интенсивности свечения превышала контрольные значения почти в 2 раза (рк 0,01), постепенно снижаясь к фазе замедления роста (Рис. 3.6.). Повышенную активность антиоксидантных ферментов регистрировали на протяжении всего периода культивирования. Особенно высокой была активность СОД (рк 0,001), что не удивительно, учитывая образование в среде культивирования, главным образом, супероксидного анион-радикала (Ог") в реакциях с участием ионов двухвалентного железа (Каган и др., 1986) и генерацию этой же формы АФК самими бактериями. К контрольным значениям активность СОД приближалась только к фазе замедления роста. Содержание МДА в этот период превышало контрольные значения (рк 0,01).
Еще одним подтверждением гипотезы взаимного участия антиоксидантной и люминесцентной систем в защите бактерий от окислительного стресса являются данные по активности антиоксидантных ферментов у темнового (мутантного по альдегиду) штамма бактерий V. harveyi.
На рис.3 Л 4. показана удельная скорость роста светящегося и темнового штаммов бактерий. Как видно из рисунка фазы роста темнового и светящегося штаммов совпадают, но скорость роста светящегося штамма намного выше. Плохой рост мутантов наблюдали и ранее (Гительзон и др. 1985).
На рис. 3.15. показана зависимость активности ферментов темнового штамма V. harveyi от фазы роста. Люциферазной активности у этого штамма нет. Значения активности ферментов представлены по отношению к значениям светящегося штамма. Пробы для определения активности ферментов и содержанию МДА отбирали в точках аналогичных предыдущим экспериментам.
Показано, что активность антиоксидантных ферментов, и каталазы, и СОД мутантов на фоне повышенного содержания МДА увеличивается в зависимости от фазы роста в 2-6 раз (р 0.001). Очевидно, при потере люминесцентной системы бактерии вынуждены адаптироваться к повышенному содержанию АФК только с помощью АОС. Содержание оксидоредуктазы не намного ниже светящегося (р 0.05).
Темновой штамм теряет резистентность к окислительному стрессу. При летальных концентрациях перекиси водорода для темнового штамма, светящийся не погибает.
Для изучения активности люминесцентной системы в условиях ингибирования одного из ферментов антиоксидантной системы — каталазы, в среду культивирования бактерий вносили специфический ингибитор каталазы 3 - амино - 1,2, 4 триазол. При этом повторяли эксперименты с индукцией окислительного стресса. Ингибитор в концентрации 1 мМ вносили в экспоненциальной фазе роста, в точке максимальной интенсивности свечения. Условия эксперимента оставались прежними.
