Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Изученность вопроса 10
1.1. Токсическое воздействие нитритов на организм рыб 10
1.2. Характеристика липидов рыб и их роль в процессах адаптации 20
1.3. Реакции липидного и белкового обменов на воздействие токсических веществ 36
ГЛАВА II. Экспериментальная часть 42
2.1. Объекты исследования 42
2.2. Постановка эксперимента 43
2.3. Морфометрические измерения 45
2.4. Проведение биохимического анализа 45
2.4.1. Приготовление гомогенатов 45
2.4.2. Экстракция липидов 45
2.4.3. Определение суммарного содержания фосфолипидов 46
2.4.4. Определение общего содержания холестерина 47
2.4.5. Определение малонового диальдегида 47
2.4.6. Определение общей антиоксидантной активности 48
2.4.7. Определение активности каталазы 49
2.4.8. Выделение растворимых белков 50
2.4.9. Электрофоретическое исследование тканевых белков 50
2.5. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 52
3.1.Использование Daphnia magna для оценки токсичности нитрита натрия 52
3.2. Влияние нитрит-ионов на выживаемость, массовые и линейные показатели предличинок севрюги 59
3.3.Сравнительное изучение динамики содержания фосфолипидов и холестерина в условиях нитритной интоксикации русского осетра и кутума в раннем онтогенезе 64
3.4. Сравнительное изучение показателей систем окислительно- антиоксидантной системы личинок русского осетра и сеголеток кутума в условиях нитритной интоксикации 73
3.5.Фракционный состав суммарных водорастворимых белков сеголеток кутума при воздействии различных концентраций токсиканта 85
Заключение 93
Выводы 102
Список литературы 105
- Характеристика липидов рыб и их роль в процессах адаптации
- Определение общей антиоксидантной активности
- Влияние нитрит-ионов на выживаемость, массовые и линейные показатели предличинок севрюги
- Сравнительное изучение показателей систем окислительно- антиоксидантной системы личинок русского осетра и сеголеток кутума в условиях нитритной интоксикации
Введение к работе
Одной из актуальных проблем современной токсикологии является поиск чувствительных биохимических маркеров для мониторинга и тестирования водных экосистем (Овен,2000).
Изучение биохимических показателей на ранних сроках развития токсического процесса является перспективным направлением водной токсикологии, необходимым для выявления предельно допустимых концентраций (ПДК) в среде обитания, а также оценки биохимического статуса гидробионтов на ранних стадиях развития патологического процесса до появления симптомов отравления и гибели рыб.
В последние годы отмечается повышенный интерес исследователей к изучению токсического действия нитритов на организм гидробионтов. Это связано с накоплением нитросоединений в среде обитания рыб и водных беспозвоночных. (Руссо, 1981, Bartlett, Neumann, 1998).
Накопление нитритов в естественных и искусственных водоемах происходит экзогенным путем за счет выброса нитросоединений в сточные воды различных предприятий (Adamsson,1998), а также эндогенным в результате деятельности нитрофицирующих бактерий (Anurada, Subburam,1995).
Проникая через покровы тела и жаберный аппарат в кровь, нитриты образуют метгемоглобин, вызывая гемическую и гистотоксическую гипоксию, сопровождающуюся в тяжелых случаях летальным исходом рыб и других обитателей водоемов. Метгемоглобинемия, а также гистотоксическая гипоксия наносят вред обитателям водоемов и, как показывает мировой опыт, снижают продуктивность прудовых хозяйств
(Велдре, Роома, 1990; Барсукова, 1993; Казанчев, Шахмурзов, 1997; Vedel et.al.,1998). Большую угрозу для гидробионтов представляют канцерогенные нитрозамины, образующиеся из нитритов при длительном поступлении в организм. В то же время, известны факты существования генетически закрепленного расслоения видов рыб по характеру переживания нитритного стресса. Такие виды рыб, как как чукучан (Catostomus commersoni), карпиодес (Carpiodes cyprinus) и подкаменщик (Cottus bairdi) устойчивы к воздействию высоких доз нитрита (Руссо, 1981).
В этой связи изучение токсичности нитритов на организм гидробионтов представляет практический интерес, связанный с воспроизводством рыб и увеличением эффективности их выращивания в условиях аквакультуры. Важным аспектом этой проблемы является изучение механизмов патогенеза развития нитритной интоксикации с учетом видовой специфичности рыб, а также выяснение метаболических аспектов толерантности некоторых видов рыб к воздействию нитритов.
Данные о влиянии нитритов на выживаемость, рост и развитие, а также биохимические показатели промысловых рыб Каспийского моря практически отсутствуют. В связи с этим возникает необходимость в ранней комплексной информации об уровне нитритного загрязнения водной среды и реакции гидробионтов на это загрязнение.
Изучение биохимических показателей гидробионтов на воздействие нитритов важно для понимания и углубления представлений о механизмах интоксикации, так как на суборганизменном уровне изменения проявляются раньше, чем на уровне организма.
В настоящей работе изучено воздействие различных концентраций нитрита натрия на выживаемость и обменные процессы представителей карповых - кутума (Rutilus frisii kutum) и хрящевых ганоидов - севрюги
(Acipenser stelatus), русского осетра (Acipenser gueldenstaedti) в раннем онтогенезе. В качестве объекта биотестирования был использован также классический тест-объект токсикологических исследований ветвистоусый рачок Daphnia magna.
Цели и задачи исследования. Основная цель заключалась в изучении организменных и суборганизменных эффектов воздействия нитрита натрия на рост, развитие, выживаемость, некоторые показатели белкового и липидного обменов, перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты тканей русского осетра, севрюги, кутума.
Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние различных концентраций нитрита натрия в острых и
хронических экспериментах на выживаемость, показатели
жизнедеятельности и репродуктивную функцию ветвистоусого рачка Daphnia
magna.
2. Исследовать влияние различных концентраций нитрита натрия на
выживаемость и динамику линейно-весового роста рыб в раннем онтогенезе.
3. Изучить влияние нитритной интоксикации различной степени тяжести на
динамику содержания суммарных фосфолипидов, общего холестерина и
белковых фракций в теле рыб.
4. Исследовать состояние окислительно-антиоксидантной системы в
условиях нитритной интоксикации по накоплению малонового диальдегида,
общей антиоксидантной и каталазной активности.
Научная новизна. Исследовано воздействие различных концентраций нитрита натрия на выживаемость, некоторые показатели жизнедеятельности и репродуктивную функцию представителя зоопланктона Daphnia magna в острых и хронических экспериментах.
Выявлены дозо- и хронозависимые изменения показателей липидного и белкового обменов, перекисного окисления липидов, общей антиоксидантной и каталазной активности промысловых рыб Каспийского моря в раннем онтогенезе.
На основании изучения видовой специфичности
морфофизиологических и биохимических показателей рыб делается заключение о высокой толерантности кутума к нитритной интоксикации по сравнению с представителями хрящевых ганоидов - русского осетра и севрюги.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в настоящей работе данные имеют важное теоретическое значение для понимания механизмов нитритной интоксикации рыб, а также для разработки принципов и методов эколого-биохимического мониторинга. С учетом обнаруженной видовой специфичности рыб к воздействию нитритов могут быть выработаны практические рекомендации к допустимому уровню нитритного загрязнения искусственных водоемов, предназначенных для воспроизводства рыб. Практическое значение результатов работы заключается также в возможности их использования для оптимизации учебного процесса студентов специальности "Водные биоресурсы и аквакультура".
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Нитрит натрия как загрязнитель окружающей водной среды обладает хроноконцентрационным и видоспецифическим действием. Хрящевые ганоиды характеризуются большей чувствительностью к воздействию нитритов по сравнению с карповыми. Низкие дозы нитрита натрия на начальных этапах воздействия не приводят к существенному изменению линейно-весовых показателей молоди рыб, изменению состава липидов и
белков, уровня перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности. Продолжительное воздействие сублетальных концентраций нитрита натрия вызывает торможение линейно-весового роста молоди рыб, накопление конечных продуктов перекисного окисления липидов и уменьшение общей антиоксидантной активности.
2. Предложенный комплекс тестов позволяет провести современную дифференциальную диагностику степени нитритной интоксикации ихтиофауны, так как дает возможность оценки метаболических нарушений на различных стадиях патологического процесса.
3. Уровень интенсивности перекисного окисления липидов, общей антиоксидантной и каталазной активности являются чувствительными и информативными биоиндикаторами нитритной интоксикации.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
докладывались на IV Ассамблее университетов прикаспийских государств
(Махачкала, 1999); Международной научной конференции ДНЦ РАН
(Махачкала, 1999); Международной научной конференции «Новые
технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва,
МГУ, 2002); Республиканской научно-практическая конференции
«Проблемы сохранения, рационального использования и воспроизводства
природно-ресурсного потенциала Республики Дагестан» (Махачкала,
2001); Международной научной конференции (Баку, 2004); трудах
Международного биотехн.центра МГУ «Биотехнология - охране
окружающей среды» (Москва, 2004г); Международной
биотехнологической конференции (Канада, 2005г.); ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава.
Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Общий объем диссертации - 122 листа с 12 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 165 источников.
Характеристика липидов рыб и их роль в процессах адаптации
Основная масса липидов рыб по своей химической природе относится не к собственно жирам, а к сопутствующим им веществам (например, алкоксидиглицериды, углеводороды) (Рипатти и др., 1996; Ржавская, 1976). Например, тихоокеанская треска и некоторые пресноводные рыбы имеют липиды, содержащие 5-8 % углеводородов (Ржавская, 1976), а для липидов костистых рыб даже при большой неомыляемой фракции характерно незначительное содержание алкоксидиглицеридов (Kaneko et al., 1967). У некоторых видов рыб основную массу липидов составляют воска. Так, липиды мышечной ткани Ruvettus pretiosus содержат более 90 % восков (Nevenzel et al., 1965). Богаты восками (67%) липиды икры кефали (Igengar, Schlenk, 1967). В липидах мышечной ткани кефали и других ее органах воски не зафиксированы (Ржавская, 1976).
Жирнокислотный состав липидов рыб отмечается особым разнообразием компонентов (Погосян, Налбандян, 1983; Cruger et al., 1964; Repine et.al., 1979; Hjell et.al., 1983). Отличительной особенностью рыб является высокий уровень полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). В состав липидов рыб входят полиненасыщенные эссенциальные кислоты, которые играют существенную роль в процессах адаптации организма к любым внешним воздействиям, а также высокомолекулярные высоконенасыщенные кислоты, которые не обнаружены в липидах наземных животных (Рипатти и др., 1996; Ржавская, 1976). Высокий уровень этих соединений и их состав в значительной мере зависит от жирнокислотного состава их пищи (Гершанович и др., 1991). При недостаточном питании или высоких энергозатратах, связанных с адаптацией к неблагоприятным условиям водной среды происходит активный транспорт липидов из депонирующих тканей в кровь в виде жирных кислот (ЖК), которые служат критерием мобилизации липидов (Васильева, 1977). Жир активных рыб обладает большей степенью ненасыщенности и, следовательно, реакционной способностью (Яковлева, Шульман, 1973). В липидах пресноводных рыб, обитающих в холодных водах северных рек (сиговых, лососевых, осетровых), преобладают длиноцепочечные остатки ЖК с 5-6 двойными связями (Kaitaranta, Liuko, 1979; Lizenko et al., 1973), что сближает их с липидами морских организмов (Акулин, 1969; Cruger et.al.,1964) У морских рыб незаменимые ЖК не играют столь важной роли для нормального роста как у пресноводных. Вследствие низкой активности ферментов, принимающих участие в удлинении молекулы ЖК (элонгации) и образовании двойных связей (десатурации), морским рыбам свойственна незначительная способность превращения линоленовой кислоты в ПНЖК, необходимые для функционирования клеток. Поэтому для указанных рыб роль незаменимых ЖК играют экозапентаеновая и докозагексаеновая (Watanabe, 1982). В работе Saito Hiroaki et al.(1996) показано, что главной ненасыщенной кислотой в липидах всех органов желтоперого и макрелевых тунцов является докозагексаеновая, которая составляет более 20 % от общего количества ЖК. В настоящее время существует гипотеза об универсальном значении докозагексаеновой кислоты, самой насыщенной и лабильной из ЖК, в любых адаптациях организма (Шульман, Яковлева, 1983). Например, в полярных липидах различных органов и тканей рыб при увеличении солености среды растет доля высоконенасыщенных жирных кислот линоленового ряда, в особенности докозогексаеновой кислоты (Шульман, Юнева, 1990; Diakoku et. al., 1982). Считают, что за счет изменений состава ЖК обеспечивается гомеостаз у эктотермных животных, к которым относятся и рыбы, способные компенсировать влияние температуры (Хачачка, Сомеро, 1977).
Температурный режим существенно влияет на обмен липидов рыб. Температурная акклимация приводит к заметному повышению интенсивности как окисления, так и синтеза ЖК (Александров, 1975). У рыб, обитающих при низкой температуре воды, а также у особей, акклимированных в условиях опыта к холодной воде, снижается доля насыщенных и возрастает доля высоконенасыщенных ЖК, особенно с углеродной цепью, состоящей из 20 и более углеродных атомов (Гершанович и др, 1991) и уменьшение длины углеводородных цепей (Khuller, Goldfine, 1974).
Липиды большинства рыб представлены в основном триацилглицеридами и фосфолипидами. У активных рыб преобладают легко мобилизуемые триацилглицерины, а у малоактивных - стерины, фосфолипиды (Щепкин, 1972). Триацилглицериды водных организмов представлены большим разнообразием ЖК, отличающихся друг от друга длиной углеводородной цепи, степенью ненасыщенности, числом и положением двойных связей, структурной конформацией, характером ветвления, наличием различных группировок (Анисимов, 1986). Триацилглицериды являются конечными или временными запасными продуктами и сосредоточены в основном в подкожной жировой ткани или в тканях, окружающих внутренние органы (например кишечник), а также в мышцах печени и гепатопанкреасе рыб (Верещагин, 1972). Будучи плохими проводниками тепла, они участвуют в процессах терморегуляции (Ржавская, 1976). Триацилглицериды - главный энергетический резерв организма (Lowern, 1964; Шатуновский, 1967) Нейтральные липиды относительно быстро обмениваются при мобилизации и ресинтезе и поэтому являются наиболее удобной формой аккумуляции жировых резервов (Kinsella, 1966) и составляют до 75% всей массы резервного жира рыб (Linko, 1964). Однако у некоторых видов рыб (тресковые) нейтральные жиры составляют лишь незначительную часть жирового депо (менее 20%), основная же масса представлена фосфолипидами (Шатуновский, 1967; Addison et al., 1968). Липиды икры осетровых тоже в основном представлены триглицеридами и фосфолипидами при значительном преобладании триглицеридов (65-73%) (Ржавская, 1976). Смена солености требует от рыб серьезной перестройки обмена веществ. Это сопряжено со значительными потерями энергии, проявляющимися в снижении содержания липидов в депонирующих органах. При этом расходуются главным образом триацилглицерины. Доля же эфиров стеринов существенно повышается и остается высокой до завершения адаптации, после чего вновь падает (Гершанович и др., 1991).
Определение общей антиоксидантной активности
Опыты проводили на личинках весом 50 -70 мг и сеголетках весом 400 -500 мг. Ввиду малого веса личинок объединяли по 6-9 особей в одну навеску, промывали 0.65% раствором NaCl затем с помощью гомогенизатора готовили 10 % гомогенат.
Для получения экстракта липидов навеску ткани или тотального препарата тела личинок массой 250 мг помещали в гомогенизатор с теф-лоновым пестиком и приливали туда 4 мл смеси хлороформ / метанол (2:1), после чего ткань гомогенизировали в течение 5 мин. К гомогенату добавляли ещё 1 мл смеси для получения конечного разведения 1:20 и спустя 15 минут фильтровали в мерную колбу. Фильтрат доводили до первоначального объёма.
Затем проводили промывку экстракта для удаления белков и других примесей. Для этого к фильтрату прибавляли 1 мл 0.73% раствора NaCl, энергично встряхивали и центрифугировали в течении 15 мин при 2400 об/мин. После центрифугирования верхнюю фазу декантировали шприцем или пастеровской пипеткой. Внутренние стенки центрифужной пробирки и поверхность нижней фазы трижды ополаскивали смесью - хлороформ / метанол / вода (3:48:47), всякий раз удаляя промывную смесь. К хлороформному раствору липидов (нижняя фаза) прибавляли по каплям метанол до образования однофазной системы (Folch, 1957).
О содержании липоидного фосфора судили по интенсивности окрашивания раствора молибденовой сини, образующейся в процессе восстановления аскорбатом фосфорно-молибденовой кислоты, которая образуется при взаимодействии неорганического фосфата с молибдатом аммония в кислой среде.
Определение фосфора в пробе происходит следующим образом: 0.1 мл липидного экстракта помещали в термостойкую пробирку, выпаривали хлороформ досуха и прибавляли 1.5 мл 42%-ного раствора хлорной кислоты. Пробирки ставили на 3-3.5 часа на песчаную баню для сжигания фосфолипидов до неорганического фосфата. После охлаждения в пробирки добавляли по 2.5 мл воды, 1 мл молибдата аммония и 1 мл раствора 1% аскорбиновой кислоты, пробы кипятили в течение 7 минут на водяной бане, затем фотометрировали при длине волны 830 нм. Содержание фосфора в пробе вычисляли по калибровочной кривой (Кушманова, Ивченко, 1983).
Для определения холестерина в теле рыб брали измельчённую навеску в 300 мг, переносили в мерную колбу с притёртой пробкой ёмкостью в 25 мл, в которую предварительно налили 15 мл спиртово-эфирной смеси (3:1). Затем после энергичного встряхивания колбу помещали на кипящую водяную баню и смесь кипятили в течение 30 сек. После охлаждения в колбу добавляли спиртово-эфирную смесь до метки, содержимое колбы взбалтывали и фильтровали. Экстракт (10 мл) переносили в пробирки и выпаривали на кипящей водяной бане досуха. Осадок растворяли в 10 мл хлороформа. Для получения цветной реакции в пробирки вносили по 5 мл хлороформного раствора холестерина, прибавляли 1 мл уксусного ангидрида и 4 капли концентрированной серной кислоты. Смесь тщательно перемешивали и помещали в темное место для развития окраски. Через 30 мин. измеряли оптическую плотность пробы. По калибровочной кривой, построенной на стандартном растворе холестерина, определяли количество холестерина в пробах. Содержание холестерина выражали в мг% (Прохорова, 1982).
Метод основан на реакции между МДА и тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса. К 0.2 мл 1 % гомогената добавляли 3 мл 1% фосфорной кислоты , 1 мл 0.6 % ТБК и 0.1 мл раствора FeS04. Пробирки ставили в кипящую водяную баню на один час. После охлаждения добавляли 4 мл бутанола, тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин. при 3000 об / мин. Измеряли оптическую плотность верхней фазы опытных и контрольных проб при длине волны 515, 532 нм против бутанола. Расчет содержания МДА производили с учетом коэффициента молярной экстинкции МДА. равного 1.56 10 моль А - содержание МДА в мкМоль / г влажной ткани; 4 - объем бута-нольной фазы; 0.2 - объем гомогената;
О суммарной антиоксидантной активности судили по степени торможения гомогенатами ткани перекисного окисления экзогенного субстрата (линоленовой кислоты) за один час инкубации.
В опытные пробы помещали 0.5 мл суспензии линоленовой кислоты, 0.2 мл 1 % гомогената, 0,1 мл раствора FeS04. В слепые пробы вместо гомогената добавляли соответствующее количество воды. Пробы инкубировали в течение 1 часа при температуре 37С. По окончании
инкубации в каждой пробе определяли содержание МДА (Андреева и др., 1988), используя для этой цели 0.2 мл инкубационной среды. Антиоксидантную активность вычисляли по формуле, где за 100 % принимается активность такого антиоксиданта, который полностью подавляет образование МДА в модельной системе за час инкубации. АРА = 1 - Г МДА оп 1 60 -Г МДА оп 1 0 х 100 [МДАст]60 -[МДАст]0 где: / МДА on / - содержание МДА (в един. экстинции)в опытной пробе. / МДА ст / - содержание МДА в контроле, соответственно, в начальный момент времени 0 и после часовой инкубации 60 (Демчук, 1990).
Влияние нитрит-ионов на выживаемость, массовые и линейные показатели предличинок севрюги
Результаты наших исследований позволили выявить высокую чувствительность предличинок севрюги к действию нитрит-ионов (NO2"). Использование различных концентраций NO2" в остром эксперименте на этапах раннего онтогенеза показало, что концентрации 2,0 и 4,0 мг/л не повлияли на выживаемость предличинок, а более высокие (8,0 и 16,0 мг/л) оказали остролетальный эффект. Так, в среде с содержанием 8 мг/л нитрит-ионов через 96 часов была выявлена 50 % гибель опытных особей, а увеличение этой концентрации в два раза (до 16,0 мг/л) привело к 100 % гибели предличинок.
Продолжительная, в течение всего периода эндогенного питания, интоксикация предличинок сопровождалась незначительным, по сравнению с контролем (7,5% и 5%) отходом особей при содержании NCb" 2,0 и 4,0 мг/л соответственно, а при 8,0 мг/л 100% гибелью.
Одним из важных показателей развития рыб являются параметры их массового и линейного роста, которые в общем виде отражают изменения обменных процессов, происходящих в организме (Глубокое, 1990).
Характерной особенностью роста и развития контрольных особей является максимальное увеличение массы тела на 7-й день, а затем снижение этого параметра на фоне нарастания линейных размеров (табл. 6,7). Максимальная скорость линейного и массового роста отмечалась в первые 5 дней развития (1,2 ± 0,2 мм/сут. и 1,6 ± 0,2 мг/сут. соответственно).
Увеличение линейного роста рыб на 7-10 день происходит на фоне снижения массы тела, что, очевидно, связано с уменьшением запасов желточного мешка.
При воздействии различных концентраций нитрита в течение первых 3 дней не выявлены расхождения в показателях роста предличинок по сравнению с контролем. Отклонения в показателях массового и линейного роста начали проявляться лишь на 5-е сутки предличиночнои стадии в среде, содержей 8,0 мг/л нитрит-ионов. В течение же двух последних дней инкубации, у остававшихся в живых особей этой опытной группы, наблюдали торможение линейного и массового роста. На наш взгляд, это связано с высокими энергетическими затратами в условиях нитритной интоксикации, истощением запасов эндогенного питания и развитием катаболических процессов.
Картина динамики ростовых показателей предличинок севрюги в наших экспериментах при нитритной интоксикации может быть описана триадой Селье (Селье, 1960).
Очевидно, реакция тревоги на начальных этапах развития нитритного стресса приводит к усилению обменных процессов и энергозатрат, в результате ускорения утилизации запасов желточного мешка. Это обеспечивает сопоставимые с контролем показатели роста в первые дни действия различных концентраций токсиканта. Стадия резистентности проявляется при действии относительно низких концентраций нитрита и выражается в стабилизации линейного роста и дальнейшем нарастанием его на фоне снижения массы тела. Предличинки, подвергшиеся действию высоких концентраций нитрита, не справляются с продолжительной интоксикацией и гибнут с наступлением стадии истощения.
Обнаруженное нами 3-фазное течение токсического процесса у предличинок было показано также при действии других токсических веществ, как фенол (Глубокое, 1990), пестициды (Мороз, 1990) и нефтепродукты (Исуев и др.,2000; Михайлова, 1991). Поскольку реакция рыб на различные токсиканты сходна с общим адаптационным синдромом Селье, правомерно применение теории стресса в ихтиотоксикологии.
Изучены дозо- и хронозависимый эффект воздействия нитрит-ионов в аквариальном эксперименте на содержание фосфолипидов и холестерина в теле сеголеток кутума и личинок русского осетра. Полученные результаты представлены в таблицах 8 и 9, а также отражены на рис. 4, 5, 6 и 7. Показано, что на ранних стадиях онтогенеза кутума динамика содержания фосфолипидов и холестерина при продолжительном (15, 25, 45 суток) воздействии возрастающих концентраций нитрит-ионов (2,0; 4,0; 8,0 и 16,0 мг/л) характеризуется фазными и разнонаправленными изменениями. Экспозиция сеголеток кутума в течение 15 дней в среде, содержащей 2,0 и 4,0 мг/л нитрит-ионов, приводит к снижению количества фосфолипидов на 15% и 23 %, соответственно. Контакт сеголеток с более высокими концентрациями токсиканта (8,0 и 16,0 мг/л нитрит-ионов) сопровождается увеличением содержания фосфолипидов (на 36% и 52 %) по отношению к значениям контроля. Следует отметить, что повышение фосфолипидов положительно коррелирует с содержанием нитрит-ионов в среде: чем выше их концентрация, тем выше уровень фосфолипидов. В условиях увеличения токсической нагрузки в течение 15-дневного контакта сеголеток с нитрит-ионами уровень холестерина снижается. Характер изменения содержания холестерина обнаруживает следующую особенность - чем меньше концентрация токсиканта, тем более значительно снижение холестерина. При концентрациях нитрит-ионов 2,0; 4,0; 8,0 и 16,0 мг/л количество холестерина уменьшается до уровня ниже контрольных значений на 75%, 54%, 52% и 30%, соответственно. При это молярное соотношение холестерина к фосфолипидам, который является важным показателем, характеризующим состояние клеточных мембран, при концентрациях 2,0 и 4,0 мг/л нитрит-ионов в среде составляет 0,08 и 0,11, что ниже уровня контроля (0,21). При продолжительной (25 и 45 суток) токсической нагрузке динамика изменения содержания фосфолипидов и холестерина носит разнонаправленный характер. В условиях 25-дневной экспозиции сеголеток кутума в среде, содержащей 2,0 и 4,0 мг/л нитрит-ионов,
Сравнительное изучение показателей систем окислительно- антиоксидантной системы личинок русского осетра и сеголеток кутума в условиях нитритной интоксикации
Однако, при тех же концентрациях нитрит-ионов в среде (2,0; 4,0; 8,0 и 16,0 мг/л) сеголетки кутума выдерживали более длительную (до 45 суток) экспозицию.
В патогенезе развития нитритной интоксикации не исключена роль свободнорадикальных процессов и, в первую очередь, реакций перекисного окисления липидов. Свободнорадикальные соединения могут быть инициированы непосредственно нитрит-ионами, а также развивающейся в условиях нитритного стресса вторичной гистотоксической гипоксией (Таранова, 1988). На возможность образования свободнорадикальных соединений в условиях гипоксии указывает ряд работ (Владимиров, Арчаков, 1972; Чернышов, Телитченко, 1973; Абрамова, Оксегендлер, 1989).
Окислительно-восстановительные процессы (в том числе и реакции перекисного окисления) являются, как известно, непременным атрибутом различных форм жизнедеятельности (Козлов, 1973). Однако, в тех случаях, когда уровень и динамика процессов пероксидации превышает определенные физиологические пределы и они не могут быть нейтрализованы компенсаторными и защитными механизмами клетки, развивается состояние так называемого внутриклеточного оксидативного стресса. Стресс-индуцированные метаболические сдвиги, развивающиеся по типу оксидативного стресса, приводят к усилению пероксидации липидов, нарушению липидных структур клеток, истощению антиоксидантних систем потенцированию синдрома эндогенной интоксикации.
Сравнительное изучение суборганизменных эффектов воздействия нитрит-ионов позволило выявить видовые особенности в динамике изменения содержания структурных компонентов клеточных мембран -фосфолипидов и холестерина. Учитывая, что ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов являются важнейшими субстратами свободнорадикального окисления, представлялось интересным изучение процессов перекисного окисления липидов, а также систем антиоксидантной защиты у рыб с различной чувствительностью к нитритам. Состояние окислительно-антиоксидантной системы у сеголеток кутума и личинок осетра оценивали по накоплению малонового диальдегида (МДА), общей антиоксидантной активности (ОАА) и активности каталазы. Полученные результаты представлены в таблицах 10 и 11, а также отражены на рисунках 8-13. Анализ показателей окислительно-антиоксидантой системы кутума и русского осетра в раннем онтогенезе позволил выявить различия исходного эндогенного уровня малонового диальдегида и общей антиоксидантной активности. Так, у интактных сеголеток кутума, по сравнению с осетром, значительно выше содержание МДА, а также ОАА. Вместе с тем, активность антиперекисного фермента каталазы имеет сопоставимые значения (0,689±0,0042 мкмоль Н20г/г влажной ткани у кутума и 0,605±0,0011 у осетра). На более поздних сроках воздействия токсиканта (45 суток) уровень МДА стабилизируется и приближается к контролю. Очевидно, имеющее при этом место увеличение каталазной активности (на 34 %) можно рассматривать как фактор, сдерживающий активацию ПОЛ и накопление МДА. При увеличении токсической нагрузки на организм сеголеток кутума до 8,0 мг/л даже при непродолжительном (до 15 суток) контакте происходит значительное повышение количества МДА (на 62 %) относительно контроля. Адекватно с увеличением МДА активируются системы антиоксидантной защиты: активность каталазы увеличивается на 27%,аОАА-на17%. Сохраняющаяся на достаточно высоком уровне активность суммарной антиоксидантной системы организма рыб при дальнейшей (25 80 дневной) экспозиции приводит к снижению количества МДА (на 29%). На более поздних сроках (45 суток) воздействия токсиканта значительно активируется и каталаза: ее активность превышает уровень интактных сеголеток на 42%. Компенсаторный характер реакции системы антиоксидантной защиты сеголеток кутума при воздействии более высоких концентраций нитрит-ионов (16,0 мг/л) в течение 15 и 25 суток проявляется в повышении ОАА (на 15% и 14 %, соответственно), а также в сохранении активности каталазы на уровне контрольных значений. Дальнейшая (45-дневной) экспозиция сеголеток кутума сопровождается значительным повышением содержания МДА (на 60 %), при этом ОАА и активность каталазы приближаются к контролю. Таким образом, реакция кутума на нитритную интоксикацию характеризуется активацией процессов ПОЛ и компенсаторными изменениями систем антиоксидантной защиты, степень которых определяется дозой и продолжительностью действия токсиканта. Об активации процессов ПОЛ свидетельствует и снижение содержания фосфолипидов в теле кутума, связанное, очевидно, с повышением расходования полиненасыщенных жирных кислот в условиях нитритного стресса. Барабой (1991), развивая представления о продуктах ПОЛ как первичных и вторичных медиаторах стресса, отмечает, что первичный подъем ПОЛ мобилизует стресс-реализующие системы и повышает антиоксидантныи потенциал клеток. Истощение этого потенциала знаменует вторичный подъем ПОЛ. Первичная активность ПОЛ соответствует первой фазе стресса (фазе тревоги), усиление антиоксидантного ответа - второй фазе - фазе резистентности, а вторичная активация ПОЛ - третьей фазе стресса (фазе истощения). Имеющее место в наших исследованиях повышение активности антиоксидантной системы в условиях интоксикации, по-видимому, указывают на адаптационную фазу стресса, характеризующуюся мобилизацией энергетических ресурсов, необходимых для жизнеобеспечения и выживания рыб в токсической среде. Иной характер динамики содержания МДА и показателей антиоксидантной системы обнаруживается при воздействии различных концентраций нитрита натрия на личинок русского осетра. Исследования показали, что 3-дневное пребывание в среде, содержащей 2,0 мг/л нитрит-ионов, приводит к снижению МДА (на 10%), значительному угнетению ОАА и активности каталазы (на 59% и 45% соответственно).
