Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. структурно-функциональная организация и реактивность гладкой мышечной ткани
1.1 .Ультраструктурная организация гладких мышечных клеток 11
мышечной ткани внутренних органов 14
1.3. Сократительный аппарат гладких миоцитов. Молекулярные основы сокращения 18
1.4. Особенности компенсаторно-приспособительных реакций и механизмы регуляции контрактильной активности гладкой мышечной ткани 24
1.5.Гладкая мышечная ткань бронхов. Особенности организации и реактивности гладкой мышечной ткани бронхов.
1.5.1.Морфо-функциональная организация гладкой мышечной ткани бронхов..
1.5.2. Особенности реактивности бронхиального дерева и механизмы нарушения вентиляции легких при аллергическом воспалении 31
1.6..Гладкая мышечная ткань органов желудочно-кишечного тракта. Особенности организации и реактивности ГМТ тонкой кишки.
1.6.1. .Морфо-функциональная организация гладкой мышечной ткани кишечника 36
1.6.2.Особенности реактивности гладкой мышечной ткани тонкой кишки 39
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 .Материал исследования 44
2.2.Методы исследования 47
Глава 3. Морфо-фуьжциональная организация и реактивность гладкой мышечной ткани бронхов крыс при экспериментальном бронхоспазме
3.1.Структурно-метаболическая характеристика интактной гладкой мышечной ткани бронхов крыс 54
3.2. Ультраструктурные характеристики интактных гладких миоцитов бронхов 56
З.З.Иммуногистохимический анализ ГМТ бронхов 62
ЗАУльтраструктурные характеристики гладких миоцитов бронхов крыс при экспериментальном бронхоспазме 65
3.5.Реактивные изменения гладких мышечных клеток бронхов крыс при экспериментальном бронхоспазме 71
Глава.4. Морфо-функциональная организация и реактивность гладкой мышечной ткани тонкой кишки при обтурационной непроходимости.
4.1. Структурно-метаболическая характеристика интактной гладкой мышечной
ткани тонкой кишки крыс 87
4.2. Ультраструктурные характеристики гладких миоцитов тонкой кишки 91
4.3.Иммуногистохимический анализ гладкой мышечной ткани тонкой кишки 98
4.4.Реактивные изменения гладких мышечных клеток тонкой кишки при экспериментальной обтурационной кишечной непроходимости 100
Глава 5. Цитологические механизмы регуляции сократительной активности гладких миоцитов
5.1.Роль кальция в процессе контрактации гладких мышечных клеток 117
5.2.Энзимная диссоциация гладкой мышечной ткани 117
5.3. Определение уровня жизнеспособности ГМК, полученных методом ферментной диссоциации 119
5.4.Анализ концентрации цитоплазматического уровня кальция с помощью Fura-2AM 121
5.5. Анализ концентрации цитоплазматического уровня кальция в изолированных ГМК с помощью Fluo-З 124
5.6. Динамика изменения уровня цитоплазматического кальция в изолированных ГМК при стимуляции контрактильной
активности 125
Глава 6. Обсуждение полученных результатов
6.1. Структурно-функциональная организация интактной гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки 128
6.2.Трансформация гладкой мышечной ткани бронхов крыс при формировании экспериментального бронхоспастического синдрома 133
6.3.Реактивные изменения гладкой мышечной ткани тонкой кишки крыс при экспериментальной обтурационной кишечной непроходимости 135
6.4. Кальций-зависимые механизмы регуляции функции гладких мышечных клеток 139
Выводы 141
Библиография 143
- Сократительный аппарат гладких миоцитов. Молекулярные основы сокращения
- Ультраструктурные характеристики интактных гладких миоцитов бронхов
- Ультраструктурные характеристики гладких миоцитов тонкой кишки
- Определение уровня жизнеспособности ГМК, полученных методом ферментной диссоциации
Введение к работе
Гладкая мышечная ткань (ГМТ) представляет собой один из основных тканевых компонентов, входящих в состав висцеральных органов и сосудов различного типа. Сокращение гладкой мышечной ткани вызывает, как правило, изменение просвета или диаметра тех органов, в составе которых она находится. Общепризнана ее определяющая роль, как в реализации нормального функционирования органных систем, так и в развитии их реактивных состояний и заболеваний. Расшифровка тканевых, цитологических и молекулярных механизмов работы гладкой мышечной ткани во многом обеспечивает успех в исследовании различных жизнеобеспечивающих систем организма, что, в свою очередь, создает базу для разработки новых эффективных методов лечения. Несмотря на центральную роль ГМТ в патогенезе функциональных расстройств различных органов (респираторный, пищеварительный тракт, мочевыносящая система), до настоящего времени имеются лишь единичные исследования, касающиеся детальных структурно-метаболических особенностей гладких миоцитов.
Исследованиями ряда авторов были значительно расширены имеющиеся представления о морф о-функциональной организации, гистогенезе и реактивности ГМТ (Баженов Д.В., 1988, Зашихин А.Л., 1994, Давиденко В.К., 2000, Кауфман О.Я., 1979). Большое значение для понимания закономерности физиологической регенерации мышечных тканей имеют сведения о пролиферативных свойствах дифферона (Гансбургский А.Н., Павлов А.В., 1998, Stenmark K.R., Mecham R.P., 1997), соотношении процессов пролиферации и дифференцировки (Данилов Р.К., 1994, Ямшиков Н.В., 1991). За последние годы появилось значительное количество работ, свидетельствующих о сложности организации гладкой мышечной ткани (ГМТ) в составе стенок сосудов и висцеральных органов. Многие исследователи полагают о неоднородности популяции гладких миоцитов, входящих в состав различных внутренних органов лабораторных животных, а также о гетероморфии гладких миоцитов (Зашихин А.Л., 2002, Barnes P.J., 2003, 2006, Gabella G., 1994, 2002, Guarino M.P., 2007,
Halayko A.J., 2005), которые отличаются по своим линейным параметрам, форме, организации внутриклеточных органелл (Cook C.L., et al, 1994, Giuriato L.E., at al, 1995, Halayko A.J., 1996, 2001, Neylon C.B., et al, 1995, Roelofs M., 1995), распределению внутриклеточных цитоскелетных и сократительных белов (актина, миозина, десмина, виментина) (Halayko A.J., 1999, 2003, Neylon СВ., 1995, Shirinsky V.P., 1992).
Однако значительная часть этих сведений была получена при исследовании ГМТ кровеносных сосудов различных лабораторных животных, в то же время висцеральной мышечной ткани уделено меньше внимания. Вопросы о характере структурно-метаболических параметров ГМК и механизмов их реактивной трансформации остаются недостаточно изучены и эта тема требует дальнейших исследований.
Известно, что различные висцеральные органы отличаются не только по анатомическому строению, соотношению тканевых компонентов, но и уровню функциональной активности. Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить существование межорганных и внутриорганных особенностей организации ГМТ висцеральных органов. Вопрос о характере структурно-метаболических параметров гладких миоцитов в составе бронхов и тонкой кишки лабораторных животных остается недостаточно изученным, что диктует необходимость их дифференцированного анализа.
Ряд авторов выявили некоторые закономерности морфо-функциональных механизмов реактивности гладкой мышечной ткани желудочно-кишечного тракта (Богач П.Г., 1974, Гладкий А.П., Баженов Д.В., 1976, Gabella G., 1994, 2002, Stanghellini V., et al, 2007) и бронхиального дерева (Barnes P.J., 2003, 2006, Halayko A.J., et al, 2003). Однако эти данные не позволяют оценить реактивные изменения структуры популяции и значение различных типов миоцитов в адаптивных реакциях.
Таким образом, в литературе не удалось обнаружить сведений, дающих точное представление о структуре популяции ГМК и характере ее реактивных перестроек в гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки. Следовательно,
7 представляется актуальным проведение комплексного сравнительного анализа ГМТ висцеральных органов (бронхов и тонкой кишки) лабораторных животных в норме и в процессе развития компенсаторно-приспособительных реакций с позиции клеточно-дифферонной организации ткани.
Цель работы. Изучить структурно-функциональные характеристики гладкой мышечной ткани висцеральных органов лабораторных животных (крыс) в условиях физиологической нормы и выяснить закономерности ее реактивной трансформации.
Задачи исследования.
Провести комплексный сравнительный анализ организации интактной гладкой мышечной ткани бронхов и тонкой кишки.
Изучить структурно-метаболические параметры гладких мышечных клеток бронхов крыс при развитии бронхоспастического синдрома.
Исследовать структуру популяции, пролиферативный потенциал и содержание суммарного белка гладких миоцитов стенки тонкой кишки при развитии частичной обтурационной непроходимости.
Отработать методику ферментной диссоциации для получения изолированных гладких мышечных клеток, позволяющую сохранять их нормальные физиологические параметры. Провести анализ изменения цитоплазматического кальция в разных фенотипах гладких миоцитов при стимуляции сокращения.
Научная новизна исследования.
Впервые на основе интегративного анализа дана сравнительная оценка тканевых и клеточных механизмов реактивной перестройки гладкой мышечной ткани висцеральных органов.
Впервые с помощью анализа изолированных гладких миоцитов бронхов и тонкой кишки установлено, что одним из основных механизмов компенсаторно-приспособительных реакций гладкой мышечной ткани висцеральных органов является динамичное изменение структуры клеточной популяции.
Проведен сравнительный анализ экспрессии маркерных белков интактных гладких мышечных клеток бронхов и тонкой кишки и при изменении их функциональной нагрузки.
Впервые отработана методика ферментной диссоциации гладких миоцитов тонкой кишки для получения живых изолированных клеток. Проведены цитофизиологические исследования базального уровня цитоплазматического кальция в изолированных гладких мышечных клетках и механизма регуляции сократительной активности их разных фенотипов.
Научно-практическая значимость работы.
Полученные в работе комплексные данные о структурно-метаболических параметрах и структуре популяции гладких мышечных клеток интактных бронхов и тонкой кишки и при изменении их функциональной нагрузки имеют существенное значение для расшифровки клеточных механизмов реактивности и адаптационных реакций висцеральной гладкой мышечной ткани.
На основании комплексной оценки получены данные о различии структурно-метаболических параметров гладких мышечных клеток интактной и реактивно измененной гладкой мышечной ткани бронхов при бронхоспастическом синдроме, которые могут служить теоретической основой для понимания патогенеза заболеваний легких, сопровождающихся аллергическим компонентом, и могут быть использованы как объективный критерий оценки эффективности и разработки новых методов лечения патологии органов дыхания.
Полученные морфометрические, цитоспектрофотометрические,
электронно- микроскопические и иммуноцитохимические данные о механизмах регуляции функций гладкой мышечной ткани интактной тонкой кишки и при реактивных изменениях, обусловленных обтурационной непроходимостью, могут быть использованы в научно-практической работе при изучении патогенеза ряда заболеваний тонкой кишки (обтурационная непроходимость), а также для разработки и реализации новых методов лечения.
9 Разработан и апробирован новый метод получения изолированных гладких мышечных клеток, позволяющий сохранять их нормальные физиологические параметры. Использование этой методики можно рекомендовать в практику научных лабораторий для проведения широкого круга цитологических исследований.
Результаты исследования могут быть использованы в учебных программах медицинских и биологических вузов и для разработки новых экспериментальных моделей ряда заболеваний.
Общетеоретические результаты целесообразно использовать в
преподавании соответствующих разделов гистологии, физиологии,
патологической физиологии, патологической анатомии, пульмонологии и
гастроэнтерологии. _ _
Материалы исследования включены в методическое пособие «Материалы итогового контроля студентов по цитологии, общей и частной гистологии».
Основные положения, выносимые на защиту.
Висцеральная гладкая мышечная ткань лабораторных животных имеет сложную морфо-функциональную организацию, которая различается по структуре популяции, пролиферативному потенциалу и адаптационным' возможностям.
Состояние гиперконтрактации гладкой мышечной ткани бронхов вызывает изменение структуры популяции. Бронхоспастическая реакция стимулирует метаболическую активность малых миоцитов и вызывает реактивную деградацию больших клеток в гладкой мышечной ткани бронхов.
3. При развитии экспериментальной обтурационной непроходимости уровень
реактивной трансформации гладкой мышечной ткани разных отделов тонкой
кишки имеет существенные различия, обусловленные характером изменения
функциональной нагрузки.
10
4. Разные фенотипы гладких миоцитов характеризуются аналогичными
параметрами изменения уровня цитоплазматического кальция при стимуляции сокращения.
Внедрение в практику.
Основные положения диссертации использованы при составлении учебно-методического пособия «Материалы итогового контроля студентов по цитологии, общей и частной гистологии».
Полученные данные включены в учебную программу при изложении материала по темам «Мышечные ткани», «Дыхательная система», «Пищеварительная система» на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии и нормальной физиологии Северного Государственного Медицинского Университета. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы по материалу и методам исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и библиографии, включающей 248 источников, из них 56 отечественных авторов и 192 иностранных. Диссертация содержит 16 таблиц, 62 рисунка, включающих микрофотографии. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста.
Сократительный аппарат гладких миоцитов. Молекулярные основы сокращения
Одним из важных компонентов сократительного аппарата ГМК являются филаменты: тонкие актиновые (Henderson R.M., et al, 1971, Roelofs M., 1995, Small V.J., 1995), которые состоят из гладкомышечного а- актина и связаны с тропомиозином, но, в отличие от поперечно-полосатых мышц, без тропонина; и толстые нити, состоящие из миозина, который, однако, отличается от входящего в состав поперечно-полосатых мышц тем, что он будет связываться с актином, только если его легкая цепь фосфорилирована. Соотношение актиновых и миозиновых филаментов в гладкой мышечной клетке составляет 12:1, тогда как в скелетной - 6:1 (Murakami U., et al, 1985, Small V.J., 1995, Shirinsky V.P., 1992, Somlyo A.V., et al, 2004).
Другим важным компонентом контрактильного аппарата гладких миоцитов являются электронно-плотные структуры (плотные тельца), расположенные свободно в цитоплазме, и тесно связанные с мембраной прикрепительные пластинки. Субмембранные молекулярные комплексы включают в себя винкулин, талин, тензин, фил амин, кальпонин и немышечный актин. Прикрепительные пластинки занимают около 30-50% контура клетки на срезе в ее центральной части в зависимости от типа мышцы. Основными белковыми компонентами плотных телец являются а-актинин, немышечный актин и кальпонин, что позволяет рассматривать их как функциональный эквивалент Z-полосок миофибрилл скелетной мышечной ткани. Актиновые филаменты фиксируются на плотных тельцах и прикрепительных пластинках. В зоне прикрепления к плотным тельцам они имеют положительный заряд (+) и отрицательный (-) на свободном конце. В области их контакта с прикрепительными пластинками формируются муфтообразные соединения из микроволокон диаметром Знм, фиксирующие актиновые пучки. Сокращение клеток гладкой мышечной ткани связано с «решетчатым» расположением актина и миозина, что является существенным отличием от поперечнополосатых мышц (Borrione А.С., et al, 1989, Small V., et al, 1995, Somlyo A.V., et al, 2004). Тонкие и толстые филаменты закреплены в точках фиксации (электронно-плотные тельца и прикрепительные пластинки), пересекая клетку крест-накрест. Плотные тельца выполняют функцию адгезивных соединений. Сокращение выражается в укорочении клетки, которая приобретает складчатую форму, тогда как в состоянии покоя клетка вытянута.
Механическое напряжение, вызванное сокращением, передается через прикрепительные пластинки к окружающей клетку базальной мембране, позволяя массе клеток ГМТ функционировать как единое целое. В сравнении со скелетной, гладкая мышечная ткань примечательна тем, что способна развивать значительное сокращение при малых затратах АТФ.
Филаменты промежуточного класса, включающие десмин и виментин, формируют опорный каркас гладкого миоцита и обеспечивают связи между плотными тельцами и плазмолеммой (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., 1996, Duquette R.A., et al, 2005, Paulin D., et al, 2004, Small V., et al, 1995). Согласно мнению большинства авторов, в висцеральных гладких миоцитах они состоят преимущественно из десмина, а в гладких мышечных клетках сосудов из виментина и десмина или только из виментина (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., 1996, Campbell G.R., 1988, Paulin D., et al, 2004).
По мнению Gabella G. (1984), напряжение и сокращение ГМК осуществляется путем взаимодействия актиновых и миозиновых филаментов, триггерным механизмом которого является изменение уровня концентрации ионов кальция. Perry S.V., Grand R.A. (1984) предприняли попытку систематизировать представления о белковых комплексах сократительной системы поперечно-полосатой и гладкой мышечной ткани путем проведения аналогии между ними по критерию функциональной значимости. Они выделили Са2+ - депонирующую систему, к которой в ГМТ они отнесли саркоплазматический ретикулум, митохондрии, ядро, поверхностные микровезикулы, систему сокращения (тонкие и толстые филаменты- актин, миозин), систему регуляции (тропомиозин, тропонин, лейотонин, белки Са2+ мишени, тропонин С, кальмодулин-связанные белки), другие белки, заинтересованные в процессе сокращения (М-белок, а-актинин, филамин, скелетин), дали характеристику каждому из компонентов и описали их функциональную значимость (Perry S.V., et al, 1984, White С, et al, 2000).
Важнейшим фактором, который играет роль триггера для сокращения ГМК является изменение концентрации цитоплазматического Са (Allen B.G., et al, 1994, Amrani Y., et al, 2002, Chung S-S., et al, 2005, Gabella G., 1994, Espelt M.V., et al, 2005, Sweeney M., et al, 2002). В цитолемме клеток гладкой мышечной ткани существуют различные кальциевые каналы, некоторые из них активируются гормонами, в то время как открытие других вызывается деполяризацией мембраны (Allen B.G., et al, 1994, An S.S., 2000). Стимуляция ГМК может происходить как при передаче возбуждения от других гладких миоцитов через нексусы, так и путем воздействия нейромедиаторов или гормонов с рецепторами плазмолеммы (Allen B.G., et al, 1994, Sieck G.C., et al, 1998).
Ультраструктурные характеристики интактных гладких миоцитов бронхов
Гладкая мышечная ткань бронхов представлена пучками гладких миоцитов, имеющих косо-циркулярную ориентацию. Традиционные методы светооптического микроскопического анализа позволяют получить достаточно ограниченную информацию, касающуюся организации этой ткани. Гладкие мышечные клетки в составе кластеров имеют вытянутую форму, незначительное количество отростков (Рис.2) и взаимодействуют друг с другом, формируя многочисленные связи. Они контактируют с помощью отростков (Рис.3) «конец в конец» или «бок в бок», образуют пальцевидные вдавленняплазмалеммы одной клетки в комплементарное углубление контактирующего миоцита. Ядро локализуется в центре, органоиды концентрируются в области полюсов (Рис.4). Контрактильный аппарат представлен многочисленными филаментами, образующими единый комплекс с прикрепительными пластинками и плотными тельцами (Рис.5). В области тесного сближения мембран гладких миоцитов базальная мембрана отсутствует и формируются различные типы специализированных соединений. Электронно-микроскопический анализ гладкой мышечной ткани бронхов свидетельствует о том, что гладкие миоциты в ее составе имеют различную электронную плотность цитоплазмы. В мышечном пласте четко идентифицируются "темные" и "светлые" клетки (Рис.6). Наряду с этим необходимо отметить, что организация контрактильных структур у темных и светлых клеток различается. Для "темных" клеток характерна упорядоченная организация филаментов, которая проявляется в их параллельной ориентации более плотном расположении и однонаправленной локализации. В "светлых" клетках эти элементы расположены более рыхло, ориентированы беспорядочно по периферии клеток, под плазмалеммой формируются зоны цитоплазмы, лишенные филаментов. Везикулярные элементы в "светлых" клетках не только более развиты по сравнению с "темными", но также имеет место формирование наряду с везикулами особых тубулярных структур (Рис.7), ориентированных перпендикулярно цитомембране и проникающих в глубину цитоплазмы клетки. Структура митохондрий и эндоплазматического ретикулума существенно не различается. "Темные" и "светлые" гладкие миоциты интегрированы в единую систему, располагаются внутри пласта беспорядочно и не формируют обособленных скоплений.
Наряду с этим, в составе ГМТ бронхов выявляются отдельные клеточные элементы, располагающиеся в тесном взаимодействии с контрактильными миоцитами (Рис.8). Они имеют развитые отростки, не содержат развитых контрактильных элементов, в цитоплазме располагаются компоненты синтетического аппарата и отдельные митохондрии. Отростки этих клеток формируют тесные мембранные контакты с гладкими миоцитами (Рис.9). Их строение и локализация позволяет рассматривать данный тип клеток, как разновидность интерстициальных клеток Кахаля (Зашихин А.Л., 2002, Der Silaphet Т., 1998, Huizinga J.D., 1998, Won K-J ., 2006).
В настоящем исследовании был использован иммуногистохимический метод, который позволил оценить экспрессию маркерных и фенотипических белков в ГМТ бронхов крыс. Для выявления а- гладкомышечного актина, гладкомышечного миозина, десмина и виментина были использованы моноклональные антитела к соответствующим белкам ткани. В качестве объектов исследования использовалась интактная мышечная ткань бронхов крыс. Визуализацию иммунореактивности проводили с помощью ПАП и флуоресцентного методов.
Анализ полученных данных свидетельствует о положительной иммуногистохимической реакции на а- гладкомышечный актин, гладкомышечный миозин (Рис.10) и десмин в гладкой мышечной ткани бронхов крыс (Рис.11,12). При постановке иммуногистохимической реакции на виментин
Ультраструктурные характеристики гладких миоцитов тонкой кишки
По данным электронной микроскопии гладкие миоциты в стенке тонкой кишки интегрированы в пласты, где располагается большое количество клеток, тесно прилежащих друг к другу (Рис. 32). Межклеточное вещество развито слабо, в нем локализованы нервные терминали и небольшое количество коллагеновых фибрилл (Рис.33).
Контрактильные ГМК имеют вытянутую веретенообразную форму (Рис.34). Клетки покрыты базальной мембраной, в центре располагаются ядра. Большая часть объема цитоплазмы гладких миоцитов занята сократительным аппаратом, представленным многочисленными пучками миофиламентов различного типа, плотными тельцами и прикрепительными пластинками. В области полюсов ядра располагаются митохондрии, гранулярная эндоплазматическая сеть, элементы ГЭР. Вдоль контура цитоплазматической мембраны локализуются прикрепительные пластинки и группы кортикальных везикул (Рис.34). Гладкие мышечные клетки взаимодействуют с помощью множественных контактов — «конец в конец» или с помощью боковых отростков, образуя пальцевидные вдавливания плазмолеммы одной клетки в комплементарное углубление контактирующего миоцита. В зоне контактов отростков ГМК с цитолеммой других гладких миоцитов мембраны располагаются строго параллельно и характеризуются повышенной электронной плотностью. Данная организация взаимодействия гладких миоцитов является важным условием, обеспечивающим координированную деятельность ГМТ различных слоев при разных видах перистальтики. В области тесного сближения плазмолемм гладких мышечных клеток базальная мембрана отсутствует, и формируются различные типы специализированных соединений. Некоторые из них представлены параллельно расположенными мембранами, расстояние между которыми составляет 35-40 нм. В щели содержится материал незначительной электронной плотности. Со стороны цитоплазмы у плазмолеммы в зоне контакта отмечается концентрация электронно-плотного материала. Данный тип связи выполняет адгезивную функцию и представляет собой вариант десмосомы. Внутри пластов ГМТ цитолеммы контактирующих гладких миоцитов формируют многочисленные щелевые соединения - нексусы (Рис.35), характеризующиеся близким расположением контактирующих поверхностей. Расстояние в зоне контакта составляет 5 нм. Контрактильные миоциты в составе ГМТ кишечника обладают различной электронной плотностью цитоплазмы. В составе пластов идентифицируются «темные» и «светлые» клетки, формирующие между собой плотные мембранные соединения. Для «темных» миоцитов характерно более плотное и упорядоченное расположение филаментов по сравнению со «светлыми» клетками.
Среди типичных гладких миоцитов располагаются единичные клетки, тесно интегрированные в состав мышечного пласта. Они характеризуются малыми размерами, по сравнению с окружающими гладкими миоцитами, имеют овальную или полигональную форму и короткие отростки (Рис.36). Крупные ядра расположены в центре, мелкодисперсный хроматин равномерно заполняет всю нуклеоплазму, незначительное количество гетерохроматина располагается преимущественно под кариолеммой. Отдельные канальцы гранулярной эндоплазматической сети расположены беспорядочно и содержат гомогенный материал умеренной электронной плотности. Митохондрии небольшого размера, овальной формы с развитыми кристами. Свободные рибосомы распределены равномерно, пластинчатый комплекс развит незначительно, единичные вакуоли и липосомы локализованы в различных участках цитоплазмы. В цитоплазме располагается слабо структурированный филаментозный материал. Электронно-микроскопические характеристики позволяют предположить, что данный тип клеток представляет собой премиобласты и может рассматриваться в качестве камбиальных элементов гладкой мышечной ткани (Рис.37).
В гладкой мышечной ткани кишки присутствуют клетки, которые значительно отличаются от гладких миоцитов. Данные клеточные элементы могут быть интегрированы в мышечные пласты или располагаться в соединительнотканных прослойках между слоями ГМК (Рис.36), тесно
взаимодействуя друг с другом и миоцитами с помощью специализированных мембранных контактов. Данные клетки различаются по характеру ультраструктурной организации, однако все они демонстрируют отсутствие организованного контрактильного аппарата. Часть из них характеризуется равномерным расположением органоидов в цитоплазме, умеренным развитием комплекса Гольджи и ЭПС. Митохондрии локализуются в перинуклеарной области. Многочисленные вакуоли заполнены гомогенным содержимым умеренной электронной плотности. Обнаруживаются лизосомы и отдельные рибосомы. Эндоплазматическая сеть преимущественно гладкая. Локализация и ультраструктурные признаки позволяют отнести описанные клетки к интерстициальным клеткам Кахаля (Bassotti G., et al, 2006, Henry M., et al, 1998, Sanders K.M., 1996, Young H.M., et al, 1996, Won K-J., et al, 2006) (Рис.38).
Пучки нервных волокон располагаются в прослойках соединительной ткани по периферии кластеров гладких миоцитов (Рис.39). Более мелкие группы терминал ей, включающие от 3 до 7 отростков, локализуются вблизи от поверхности гладких миоцитов, причем их варикозно расширенные участки частично или полностью утрачивают глиальную оболочку. Расстояние между мембраной гладкого миоцита и аксоном в этих зонах колеблется от 80 до 1600 нм. Отдельные варикозно расширенные нервные терминали располагаются в межклеточных пространствах. Часть нейромышечных контактов сформирована варикозными расширениями аксонов, содержащих пузырьки с электронно-плотной сердцевиной. Вместе с тем, ряд терминалей содержит электронно-прозрачные пузырьки или везикулы обоих типов. Возможность локализации в одном варикозном расширении пузырьков различной структуры и размеров рассматривалась в ряде работ (Говырин В.А., с соавт., 1983, Chan-Palay V., 1984). При сочетании двух видов нейротрансмиттеров адренергическая регуляция может осуществляться посредством действия катехоламинов в качестве пресинаптического модулятора парасимпатического влияния
Определение уровня жизнеспособности ГМК, полученных методом ферментной диссоциации
Индикация жизнеспособности изолированных гладких мышечных клеток проводилась в 2 этапа. Первый этап включал в себя окраску трипановым голубым (Trypan Blue, BDH, Chemical Ltd, England) после инкубации ткани в растворе энзимов и до остановки реакции действия фермента. При этом клетки, получившие деструктивные изменения мембран в процессе диссоциации окрашивались красителем (Рис.57А), а миоциты, сохранившие целостность мембран, не воспринимали краситель. Диссоциацию фрагментов ткани проводили до получения живых клеток порядка 92-95% (Рис.57В). После этого останавливали реакцию переваривания ткани и очищали взвесь клеток от ферментов.
Другим вариантом индикации качества диссоциации была иммуноцитохимическая реакция на специфические маркеры i гибели клеток:
Propidium Iodide (PI, Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon, USA), промежуточный агент, флуоресцентная молекула, которого имеет молекулярную массу 668,4Da, используется для окраски ДНК клеток и для определения клеточной гибели путем некроза, и Annexin V:FITC (BioVision Inc, USA), флуоресцентный маркер апоптоза, молекулярная масса которого 35-36kDa, используемый для идентификации клеток, подвергщихся апоптозу на ранних стадиях процесса. Позитивная реакция на данные маркеры в изолированных ГМК при данном типе диссоциации была выявлена в 5-8% клеток. Таким образом, основная масса гладких миоцитов, полученных данным методом сохраняла свои прижизненные структурно-функциональные параметры.
Оценку уровня активности митохондрий в полученных живых изолированных клетках осуществляли методом окраски их MitoTraker Red (Molecular probes Inc, Eugene, Oregon, USA). MitoTraker Red (C32H32CI2N2O, Mw-531,52) трансмембранный белок-краситель, который способен селективно связываться с циторецепторами митохондрий в живых клетках. Этот селективный краситель хорошо сохраняется во время фиксации клеток. Инкубацию ГМК с 70нМ MitoTraker Red проводили в течение 15 минут в темноте при температуре 37С. Затем следовала промывка препаратов в буфере (KRBB), после чего препараты переносили в перфузионную камеру лазер сканирующего конфокального микроскопа Leica SP2 (Confocal laser scanning microscopy, CLSM, Leica Microsystems, Mannheim, Germany), где поддерживалась постоянная температура 37С. Клетки были визуализированы на экран компьютера с помощью сканирующей системы микроскопа. Для работы использовали масляную иммерсионную линзу Leica (хбЗ, увеличение 4) при числовой апертуре 1,3. Изображения красной эмиссии были получены с применением длины волны возбуждения 543нм и 590нм через длинные проходные фильтры. Выполнена серия сканирующих послойных срезов каждой клетки 0,6мкм толщиной с расстоянием между слоями 0,5мкм (Рис.58). Исходя из подсчетов, область митохондрий в срезах определяли как проецируемую зону 60-70%, которая соответствует 3-4,5% клеточного объема (Рис.59). Интенсивность окрашивания была различной в зависимости от размера клеток. Митохондрии располагались по длиннику клетки.
Живые изолированные гладкие миоциты тонкой кишки мышей были инкубированы с Fura-2AM (Fura-2-acetoxymethyl ester, Molecular probes Inc, Eugene, Oregon, USA) для анализа изменения уровня цитоплазматического кальция. Fura-2AM (044 17 024, Mw-1001,85Da) - трансмембранный флуоресцентный индикатор кальция, который в несвязанном состоянии
