Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Представления об этиологии и патогенезе ДЦП 12
1.2 Роль отдельных звеньев патогенеза в формировании ДЦП 18
1.2.1 Значение патологии перивентрикулярной области в развитии заболевания 18
1.2.2 Гипоксия - патогенетическая основа развития ДЦП 22
1.2.3 Роль иммунных нарушений в патогенезе ДЦП 24
1.2.4 Явление дестабилизации генома при патологии 32
Глава 2 Методы и объем исследований 38
2.1. Общая характеристика обследованных лиц 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Метод клинико - анамнестического обследования 39
2.2.2. Методы нейровизуализации 40
2.2.3.Цитогенетический метод 41
2.2.4. Иммунологические методы 42
2.2.4.1. Метод проточной цитофлуориметрии 42
2.2.4.2. Метод радиальной иммунодиффузии в геле (РИД) 43
2.2.4.3. Тест фагоцитоза. НСТ-тест 43
2.2.4.4. Метод твердофазного иммуноферментного анализа 44
2.2.5. Методы статистического анализа 44
Глава 3 Результаты собственных исследований 47
3.1. Результаты неврологического обследования 47
3.1.1.Факторы риска развития ДЦП у обследованных детей 47
3.1.2. Оценка степени тяжести ДЦП 50
3.1.3 Цитогенетические нарушения в клетках периферической крови у больных ДДП 61
3.2 Результаты иммунологических исследований 69
3.2.1 Результаты исследования иммунного статуса 69
3.2.2 Результаты корреляционного анализа 80
Обсуждение полученных результатов 86
Выводы 104
Практические рекомендации 105
Приложения 106
Список литературы 117
- Представления об этиологии и патогенезе ДЦП
- Явление дестабилизации генома при патологии
- Оценка степени тяжести ДЦП
- Результаты корреляционного анализа
Введение к работе
Актуальность. Проблема изучения перинатальной патологии нервной системы у детей раннего возраста остается актуальной, что обусловлено прогрессирующим ростом частоты церебральных нарушений у новорожденных (Гузева В.И., 2009; Белоусова Е.Д., 2010; Барашнев Ю. И., 2011; Clark S.M., 2008). Среди детей, впервые признанных инвалидами, 57% составляют больные детским церебральным параличом (ДЦП). Результаты популяционно-эпидемиологических исследований свидетельствуют о высокой частоте ДЦП (от 1,9 до 2,7 случаев на 1000 живорожденных детей) в индустриально развитых странах (Никанорова М.Ю., 2009; Hemminki K., 2008; O'Callaghan M.E., 2009).
В патогенезе ДЦП, наряду с непосредственным поражением моторной зоны коры головного мозга, подкорковых образований и пирамидного тракта, большое значение имеет поражение перивентрикулярной области (ПВО), как результат гипоксического воздействия (Ониангет Е.П., 2006; Семенова К.А., 2007; Blumenthal I., 2009; Christos P., 2009; Folkerth R.D., 2011). Многочисленные исследования показали, что генетические программы и средовая регуляция формообразования нервной системы контролируются, прежде всего, матричной перивентрикулярной областью. С нею связаны митоз, миграция нейронов к коре и подкорковым структурам, а также, что, особенно важно в период онтогенеза, аксональный синаптогенез с клетками мишенями и формирование функциональных систем (Скворцов И.А. и др., 2008; Левченкова В.Д., 2012; Deng Y., 2008; Cans C. et al., 2009; Folkerth R.D., 2011).
Гипоксические и ишемические изменения в ПВО приводят чаще к деструктивным, нередко обратимым, процессам, реже - к выраженной деструкции мозгового вещества и лейкомаляции с необратимыми последствиями (Власюк В.В., 2012; Левченкова В. Д., 2012; Nelson K.B., 2008; Folkerth R.D., 2009; Kaur C. et al., 2009). Несмотря на то, что перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ) изучена достаточно хорошо, до сих пор четко не определены ее исходы. В ряде исследований указывается, что последствиями ПВЛ могут быть детский церебральный паралич, судорожные состояния, задержка психического развития. Однако данные о частоте ДЦП при перивентрикулярной лейкомаляции варьируют в широких пределах - от 38 до 100% (Белоусова Е.Д., 2010; Folkerth R.D., 2011; Kinney H.C., 2012).
Имеющиеся данные об ассоциированности ДЦП с антигеном В-13 у больных с перивентрикулярной лейкомаляцией, отводят решающую роль в реализации потенциально патогенного воздействия на плод генетически детерминированной индивидуальной реактивности организма ребенка, проявляющейся в виде особой восприимчивости структур перивентрикулярной области к иммунопатологическим реакциям (Гайнетдинова Д.Д., 2010). Изучение состояния генома у больных ДЦП, показывает, что у подавляющего большинства обследованных детей происходит дестабилизация генома - повышается уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах и количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови (Гайнетдинова Д.Д., и др., 2004; Гайнетдинова Д.Д., 2010; Hemminki K. et al., 2008; Nelson K.B., 2008; Wu D., 2011).
В последнее десятилетие широко изучается состояние иммунной системы, изменение энзиматической активности иммунокомпетентных клеток, нейробиохимические маркеры нейродеструктивных и репаративных механизмов при заболеваниях у детей (Окунева М.А., 2008; Громада Н.Е., 2009; Hemminki K., 2008; Blumenthal I., 2009). Среди маркеров воспаления, исследуемых в последнее время, обращается внимание на цитокины (Громада Н.Е., 2009; Okazaki K. et al., 2006; Schmitz T., 2008; Schmid M., 2012). Исследования подтверждают гипотезу о том, что провоспалительные цитокины IL-1 и TNF-, быстро появляющиеся в поврежденном мозге, ответственны за прогрессирующее повреждение нейронов, и что эти медиаторы являются важными пусковыми факторами в нейропротективной интервенции после острого периода повреждения мозга (Громада Н.Е., 2009; Khwaja O., 2008; Kadhim H., 2009; Schmid M., 2012).
Как показывают исследования последних лет, не у каждого ребенка, развивающегося в неблагоприятных внутриутробных условиях, формируется ПВЛ (Cкворцов И.А., 2008). Очевидно, решающую роль в реализации потенциально патогенного воздействия на плод играет генетически детерминированная индивидуальная реактивность организма ребенка, определяющая повышенную “восприимчивость” структур перивентрикулярной области и других отделов головного мозга плода и новорожденного к гипоксии. В литературе имеются доказательства того, что одним из провоцирующих моментов стойкости двигательного дефицита при ДЦП, является нестабильность генома, проявляющаяся повышением уровня эритроцитов с микроядрами и лимфоцитов с перестройками хромосом в периферической крови (Гайнетдинова Д.Д. и соавт., 2004; Гайнетдинова Д. Д. 2010; Hemminki K., 2008; Nelson K.B., 2008; Kaur C., 2009; Wu D., 2011; Nuk M., 2012). Предполагается, что в основе этого явления лежит интенсификация в организме больных ДЦП процессов мутагенеза, за счёт усиленной генерации эндомутагенов. В то же время, как сами механизмы дестабилизации генома, так и процессы, их поддерживающие, остаются неясными. Изучение некоторых патогенетических звеньев заболевания поможет уточнить механизмы, поддерживающие тяжесть заболевания и препятствующие эффективности лечебных мероприятий. Это позволит целенаправленно воздействовать на выявленные процессы, обоснованно назначать медикаментозную терапию и улучшать качество жизни пациента, больного ДЦП.
Цель работы. Исследовать особенности неврологических и иммунологических нарушений при нестабильности генома у больных спастическими формами детского церебрального паралича в исходе перивентрикулярной лейкомаляции.
Задачи исследования:
1. Изучить факторы риска, структуру и клинические особенности течения ДЦП у детей, перенесших перивентрикулярную лейкомаляцию, с использованием оценочных шкал спастичности Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид, адаптированных к детскому возрасту.
2. Установить взаимосвязь тяжести ДЦП и уровня цитогенетических нарушений в периферической крови детей, перенесших перивентрикулярную лейкомаляцию.
3. Оценить показатели иммунного статуса и содержания TNF- в периферической крови и слюнной жидкости в зависимости от степени тяжести ДЦП в исходе перивентрикулярной лейкомаляции.
4. Выявить взаимосвязь уровня нестабильности клеточного генома и иммунологических показателей.
Научная новизна. Впервые для оценки степени тяжести ранней резидуальной стадии ДЦП использованы шкалы спастичности Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид, адаптированные к детскому возрасту. Рассмотрена взаимосвязь иммунологических показателей, количественного содержания TNF- и нестабильности генома у больных ДЦП различной степени тяжести, неиндуцированного внутриутробной инфекцией. Выдвинута гипотеза участия цитокина TNF- в механизмах нейроиммунного взаимодействия у больных ДЦП с нестабильностью генома. Оценена возможность использования метода количественного определения TNF- в слюнной жидкости для использования в клинических условиях.
Практическая значимость. По результатам проведенного исследования определены факторы, влияющие на формирование повреждений центральной нервной системы, которые являются управляемыми и могут быть предупреждены при дальнейшем развитии перинатальных технологий.
Использование адаптированных к детскому возрасту шкал балльной оценки спастичности двигательных нарушений Ashworth, Клуба Моторики и Ривермид у больных ДЦП, позволит объективизировать степень тяжести заболевания у детей раннего возраста. Более объективной является шкала Ривермид.
Практическую значимость для неонатологов, педиатров, неврологов перинатальных центров, организаторов здравоохранения имеют:
- выявленные особенности иммунных реакций, показатели уровня TNF- и определение степени дестабилизации клеточного генома позволят педиатрам и неврологам объективно оценить, прогнозировать неврологические исходы у детей с ДЦП, разработать индивидуальные схемы наблюдения и профилактику заболеваний у указанного контингента детей;
- определение уровня TNF- в слюнной жидкости может быть использовано как альтернатива инвазивному методу определения TNF- в сыворотке крови.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику неврологических отделений ГАУЗ «Детская Республиканская клиническая больница МЗ РТ», ГАУЗ «Республиканский детский психоневрологический санаторий», ГБУ РМЭ «Параньгинская центральная районная больница», а также используются в учебном процессе кафедры неврологии с курсом медицинской генетики ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на ежегодной научно-практической конференции молодых ученых ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (Казань, 2009, 2010, 2011, 2012), научно-практической конференции «Актуальные проблемы управления здоровьем населения» (Нижний Новгород, 2009), научно-практической конференции неврологов Северо-западного федерального округа «Актуальные проблемы неврологии» (Сыктывкар, 2009), республиканской научно-практической конференции со всероссийским участием, посвященной 5-летию организации Центра экстрапирамидной патологии г. Казани «Дегенеративные и сосудистые заболевания экстрапирамидной нервной системы. Высокие технологии в диагностике и лечении» (Казань, 2009), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков «Молекулярные основы наследственной патологии» (Ростов-на-Дону, 2010), всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 1000-летию г. Ярославля «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2010), заседании сотрудников кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (г.Казань, 2012), заседании сотрудников кафедры иммунологии с курсом аллергологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» (г.Казань, 2012), II ежегодной междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Детский церебральный паралич и другие нарушения движений у детей» (г. Москва, 2012), X-м Всероссийском съезде неврологов с международным участием (г. Нижний Новгород, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 5 работ опубликованы в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Положения, выносимые на защиту:
-
Степень тяжести клинических проявлений ДЦП обусловлена структурными нарушениями в ПВО, уровнем нестабильности генома и иммунопатологическими реакциями.
-
У детей с ПВЛ TNF- является важным показателем, отражающим участие иммунной системы в патогенезе ДЦП.
-
Дестабилизация генома у детей с ПВЛ происходит на фоне повышенной продукции TNF-. В условиях повышения выработки TNF- возрастает его мутагенное действие на геном организма в целом и кроветворных клеток в частности.
Представления об этиологии и патогенезе ДЦП
Детский церебральный паралич - это полиэтиологические заболевание нервной системы, развивающееся в результате воздействия на мозг ребёнка различных неблагоприятных факторов в период внутриутробного развития, во время родов или в первые недели жизни. Заболевание сопровождается грубым двигательным дефицитом, а также нарушением программы нормального развития движений. Определяющую роль в развитии картины болезни играет время воздействия неблагоприятных факторов, меньшую -характер воздействующих факторов. Согласно литературным данным частота ДЦП составляет 1,9 до 4,7 случаев на 1000 детей [Гузева В.И., 2008; Семенова К.А., 2012, Левченкова В.Д. 2012, Camacho-Salas А., 2007; Jacobsson В., 2010]. Однако в зарубежной литературе существуют сведения о более высокой распространенности больных с ДЦП, до 10 случаев на 1000 живорожденных [Volpe J.J., 2012].
Решающую роль в развитии церебральных нарушений в настоящее время отводят действию на мозг комплекса вредных факторов, поэтому заболевание рассматривается, как мультифакториальное. В качестве основных факторов этиопатогенеза ДЦП принято выделять следующие: преждевременные роды, внутриутробное инфицирование (ВУИ), низкую массу тела при рождении, генетические причины, морфологические изменения мозговых структур, асфиксию в родах. До недавнего времени родовой асфиксии, как основному интранатальному фактору развития ДЦП, придавалось большое значение, но сейчас эта точка зрения считается малозначимой [Скворцов, И.А., 2008; Власюк В.В., 2009; Худоерков P.M., 2009; Алексеева Г.Ю., 2011; Clark S.M., 2008; Maurer U., 2008; Day R.E., 2010]. Частота асфиксии в родах, как фактора риска формирования ДЦП, по данным некоторых авторов колеблется от 3 до 18% [Петрухин А.С., 2010; Барашнев Ю.И., 2011; Nielsen L.F., 2008; Phelan J. P., 2008; Nelson K.B.2009].
К «материнским» факторам риска развития церебральных нарушений относят острые и хронические заболевания матери, прием медикаментов во время беременности, различные интоксикации, а также иммунологическую несовместимость матери и плода (АВО- и резус-несовместимость), физические травмы беременной, многоплодную беременность [Пронин И.Н., 2005; Оразмурадов А.А., 2007; Громада Н.Е., 2009; Clark S.M., 2008; Himmelmann К., 2011; Yokochi К., 2012]. В литературе упоминается и о наследственной составляющей в этиологии церебральных нарушений при ДЦП. У мальчиков ДЦП встречается в 1,3 раза чаще, и имеет более тяжелые клинические проявления, чем у девочек, что пытаются объяснить наличием наследственного фактора, сцепленного с полом [Белоусова Е.Д., 2010; Nelson К.В., Dambrosia J.M., 2008; Пальчик А.Б., 2010; Wu D., 2011], а также внутриутробным поражением нервной системы в результате гипоксии плода, развивающейся в исходе фетоплацентарной недостаточности [Володин Н.Н., 2010; Устинова А.В., 2010; Nelson К.В., 2008; Blair Е., 2011].
Преждевременные роды рассматриваются как существенный фактор риска развития ДЦП многими исследователями [Аронскинд Е.В., 2005; Власова И.В., 2009; Himmelmann К., 2011]. Показано, что от 30 до 57% детей с ДЦП рождаются раньше срока [Власова И.В., 2009; Володин Н.Н., 2010;. Алексеева Г.Ю., 2011; Clark S.M., 2008; Crawford С. L., 2010]. По данным некоторых авторов, риск развития ДЦП в 8 раз выше среди недоношенных детей по сравнению с доношенными [Maurer U., 2008]. Трактуя механизмы влияния преждевременных родов как фактора риска формирования ДЦП, исследователи большое внимание уделяют морфологическим изменениям мозга, проявляющимся нарушениями миелинизации и глиогенеза [Ellison V.J., 2008; Folkerth R.D. 2009; Blair E., 201 l;VolpeJ.J., 2011]. При изучении факторов риска формирования ДЦП немалый интерес уделяется внутриутробной инфекции. Особенно выделяют роль врожденной краснухи, цитомегаловирусной инфекции, токсоплазмоза.
Патоморфологические исследования обнаруживают в ЦНС ангиоматоз различных отделов полушарий, продуктивно-некротический энцефалит с образованием кист и кальцификатов, очаги пролиферации глии, преимущественно в белом веществе больших полушарий, продуктивные васкулиты с поражением эндотелия при ВУИ [Попова О.В., 2006; Беликова М.Э., 2008; Власюк В.В., 2012]. Внутриутробная инфекция в высоком проценте случаев (до 52%) ведет к развитию ПВЛ с последующим поражением белого вещества мозга, гибели нейронов и риску развития ДЦП [Resi В., 2008; Folkerth R.D., 2009].
Большой риск развития ДЦП имеет место при инфекции мочевых путей у матери - в 23% случаев выявляется ДЦП среди потомства у страдающих данными заболеваниями матерей, в то время как у детей здоровых матерей — в 5%. Вышеуказанное позволяет возможным рассматривать инфекцию мочевых путей у матери как существенный фактор риска развития ДЦП с последующим нарушением эмбриогенеза и развития нервной системы [Попова О.В., 2006; Folkerth R.D., 2009; Maurer U., 2008].
Существенное значение для развития представлений о природе ДЦП может иметь накопленные данных о морфологических изменениях мозговых структур. В ряде исследований было показано большое разнообразие приспособительных и репаративных процессов, возникающих в ответ на деструктивные изменения в мозгу у детей с ДЦП. Установлено, что морфологические изменения в мозгу у них выявляются в 70% случаев [Власюк В.В., 2010]. Касаясь конкретных морфологических сдвигов, необходимо отметить, что наиболее часто выявляются: гипоплазия мозолистого тела (29%), поражение таламуса и базальных ганглиев таламуса (4-7%), врожденные аномалии мозга (8%), в совокупности приводящие к нарушению моторных и когнитивных функций [Василенко Ф.И., 2009]. При изменениях в базальных ганглиях возможно развитие картины хореоатетоза [Залялова З.А., 2008]. При этом клинические проявления некоторых морфологических нарушений коррелируют с отдельными клиническими формами ДЦП. Наконец, следует отметить ряд патоморфологических нарушений по типу мальформаций, в их числе микрогирия, пахигирия, гетеротопия, агирия, лиссэнцефалия, порэнцефалия [Умнов В.В., 2007; Левченкова В.Д., 2012; Kulak W., 2005; Jacobsson В., 2010].
Наряду с отмеченными этиологическими факторами ДЦП в последнее время выделяют дополнительные и неожиданные факторы, приводящие к возникновению данного заболевания. Так, внимание исследователей привлекает проблема многоплодной беременности, которая расценивается как фактор, предрасполагающий к развитию ДЦП, и составляет 12% от всех случаев заболевания [Сичинава, Л. Г., 2006; Оразмурадов А.А., 2007; Сичинава, Л. Г., 2010; Ахмадеев Н.Р., 2012]. ДЦП в случае многоплодной беременности развивается в 6—7 раз чаще, чем при нормальной, и составляет 7,1 - 9,8 случаев на 1000 живорожденных. В двойнях частота ДЦП колеблется от 6,7 до 8,9 на 1000 новорожденных детей, а в тройнях -28 на 1000. При многоплодной беременности риск возникновения церебрального паралича для маловесных детей такой же, как у мледенцев с низким весом, родившихся от одноплодной беременности, и, наоборот, для детей из двойни с нормальной массой тела частота ДЦП выше, чем у детей с нормальным весом, родившихся при обычной беременности (4,2 на 1000 новорожденных). Специальное изучение вопроса о частоте развития ДЦП у 30 пар близнецов показало, что в 24 случаях из 30 роды были преждевременными [Оразмурадов А.А., 2007; Сичинава, Л. Г., 2010; Ахмадеев Н.Р., 2012].
Высказывается мнение об особом факторе риска развития ДЦП, недостаточность фермента аргиназы, участвующего в реакции расщепления аргинина и связанный с этим подъем уровня аргинина в плазме. Клиническая картина начинает проявляться после 6 месяцев в виде раздражительности, рвоты, задержки психомоторного развития. К частым симптомам у старших детей относят прогрессирующую спастичность с перекрещиванием ног, спастическую диплегию, атаксию, хореоатетоз и судороги. Симптомы заболевания обусловлены хронической аммиачной интоксикацией. Играет роль токсический эффект накопления аргинина, являющийся основной причиной умственной отсталости после 2-го года жизни. Благоприятный прогноз при данном состоянии может быть достигнуто с помощью диетотерапии [Лильин Е.Т., 2011].
Показана связь неонатального интерферона со спастическим параличом. Увеличение уровня неонатального интерферона сочетается со спастической диплегией и рядом биохимических и клинических показателей воспаления [Пальчик А.Б., 2009; Camacho-Salas А., 2007; Crawford C.L., 2010].
В причинной связи с ДЦП рассматривают тип глюкариковой ацидурии [Темин П.А., Николаева Е.А., 1999] и снижение уровня фумаровой кислоты в моче. Согласно данным отечественной и зарубежной литературы, неспецифичность клинической симптоматики часто приводит к тому, что дети с органическими ацидуриями наблюдаются и лечатся невропатологами с диагнозами детского церебрального паралича, врожденной миопатии, неуточненной умственной отсталости. Органические ацидурии (или ацидемии) - большая группа наследственных заболеваний, обусловленных нарушением обмена органических кислот и их накоплением в биологических жидкостях организма. Органические кислоты представляют собой низкомолекулярные соединения, являющиеся продуктами обмена аминокислот, углеводов, липидов, стероидов и биогенных аминов.
Явление дестабилизации генома при патологии
В настоящее время известно - нестабильность генома проявляется различными нарушениями генетического аппарата и индуцируется многими экзо- и эндогенными факторами. О патологии судят по отклонению от популяционного среднего уровня хромосомных аберраций и микроядер в клетках периферической крови обследованных [Гайнетдинова Д.Д., 2005; Громада Н.Е., 2009; Moore F.R., 2006; Talkowski М.Е., 2012].
Явление нестабильности генома организма человека может возникать в результате усиления интенсивности процесса эндомутагенеза в организме за счёт усиленной генерации метаболитов-эндомутагенов, а также и за счет ослабления систем защиты генома от повреждения. Наиболее важная из них первая составляющая - резкое повышение в организме уровня эндомутагенов. Это, как правило, происходит в условиях, которые создает патологический процесс. Причинно-следственные отношения при развитии подавляющего числа заболеваний, приводящих к развитию нестабильности генома, представляется следующим образом. Патогенный фактор инициирует в организме цепочку событий, которые, с одной стороны нарушают хорошо сбалансированную организацию физиологических процессов и имеют деструктивное течение. С другой - параллельно формируются защитные механизмы, охватывающие практически все жизненно важные системы организма. Это приводит к дизрегуляции интегративных систем, нарушаются обратные связи, многие системы выходят из-под этого контроля и становятся гиперреактивными. В организме повышаются количество метаболитов, которые раньше находились в следовых количествах. Если эти метаболиты обладают потенциальной способностью повреждать ДНК, то в больших дозах они существенно повышают интенсивность процессов мутагенеза, вызывая дестабилизацию его генома [Водунон А.С, 2008; Калаев В.Н., 2009; Ильинских Н.Н., 2011].
К метаболитам-эндомутагенам относятся химические соединения, которые принимают участие в метаболических процессах. В нормальных условиях метаболиты-эндомутагены не представляют опасности, но в условиях патологии их концентрация в крови и других тканях возрастает, и они начинают представлять реальную угрозу для генома больного. Среди эндогенов-метаболитов можно выделить две наиболее обширные группы мутагенов - свободные радикалы и цитокины [Ильинских Н.Н., 2011].
Свободные радикалы - структурные фрагменты молекул, которые несут на своей внешней орбитали неспаренный электрон. Так как для устойчивости молекулы на наружной орбитали должны содержаться два электрона, свободные радикалы стараются отделить от других молекул недостающий электрон, что усиливает их реакционную способность. Среди свободных радикалов выделяют группу «активных форм кислорода», которая представляет наибольшую опасность для человека. Эффекты свободных радикалов в живых системах неоднозначны. С одной стороны, они могут являться компонентами физиологических систем организмов и участвовать в различных жизненно важных ферментативных реакциях. С другой стороны, они могут проявлять выраженное токсическое действие на структуры клетки. По данным ряда авторов [Болдырев А.А., 2009; Коган А.Х., 2009; Валеева И.Х., 2011], выраженность нарушений свободно-радикального окисления влияет на характер и степень тканевых изменений, а также на течение биохимических процессов. При физиологическом уровне свободно-радикального окисления происходит нормальное течение биохимических процессов, функций тканевых структур, но его изменения оказывают повреждающее действие. Действие активных форм кислорода на ДНК, РНК приводит к хромосомным аберрациям с накоплением в клетках мутаций. Практически все активные формы кислорода являются сильными мутагенами, тератогенами и канцерогенами. Помимо свободных радикалов, эндомутагенами могут быть биологически активные вещества в высокой концентрации (кинины, цитокины, биогенные амины и др) [Болдырев А.А., 2009; Коган А.Х., 2009; Валеева И.Х., 2011].
Одним из важных вопросов медицины, на наш взгляд, является проведение исследований, касающихся изучения фундаментальных процессов формирования микроядер, поскольку обнаружение таких структур позволяет использовать их не только в качестве информативного признака воспалительных изменений, но и дает возможность косвенно судить о причинах, вызывающих их образование. Выявление микроядер в клетках широко используются в клинической практике для диагностики воспалительных заболеваний и прогнозирования их течения [Водунон А.С., 2008; Калаев В.Н., 2009], а также при проведении исследований, связанных с уточнением роли воспалительного процесса в развитии данной патологии [Moore F.R., 2006; Yan В., 2009].
Микроядра являются небольшими структурами, состоящими из фрагментов хромосом, которые на стадии телофазы входят в дочерние клетки, или формируют микроядра в цитоплазме исходной клетки. Известно, что крупные микроядра образуются при патологических митозах, мелкие встречаются главным образом при структурных аберрациях хромосом [Ильинских Н.Н., 2011]. Показано, что микроядра могут появляться и при апоптозе [Voitovich A.M. 2003]. Эти процессы свидетельствуют в первую очередь о снижении жизнеспособности таких клеток, нестабильности их функционирования и активизации процессов воспаления [Калаев В.Н., 2009] и апоптоза [Voitovich A.M. 2003]. По данным некоторых авторов уровень повышения концентрации цитокинов и степень активности макрофагов коррелировали с увеличением показателя количества клеток, содержащих микроядра, что, объясняет появление подобных клеток при воспалении [Yan В., 2009]. В воспалительных инфильтратах клетки продуцируют цитокины, индуцирующие и ингибирующие апоптоз, с которым тесно связана регуляция иммунокомпетентных клеток, включая макрофаги и лимфоциты. Роль апоптоза в воспалительном процессе считается доказанным [Фильченков А.А., 2003], а его значение в лимитировании выраженности реакции воспаления на ранних сроках наблюдения не вызывает сомнения. В то же время, образование микроядер свидетельствует не только об активации апоптоза, но и о наличии повреждений хромосом [Калаев В.Н., 2009]. Поскольку апоптоз иммунокомпетентных клеток играет важную регуляторную роль, то его адекватная активация и регуляция оказывают значительное влияние на исход воспаления [Agostini С, 2007], что вызывает практический интерес к затрагиваемой проблеме. Существуют два морфологических варианта реализации апоптоза многоядерных клеток. Проявления апоптоза могут быть связаны с нарушением структуры отдельных ядер, следующих за разрывом цитоплазматической мембраны, а крупные фрагменты клеточного детрита индуцируют воспалительную реакцию. Следовательно, апоптоз имеет важное значение для развития воспалительного процесса [Agostini С, 2007] и проявляется, в том числе и формированием микроядер [Yan В., 2009]. Поэтому указанный морфологический признак целесообразно учитывать при диагностике воспалительных заболеваний. Показатель численности клеток, содержащих микроядра, было предложено применять для ранней диагностики воспалительных заболеваний в качестве дополнительного критерия. Свое предложение авторы обосновывали повышением количества эпителиальных клеток с микроядрами при воспалительном процессе, поскольку нарушение митотического деления при неблагоприятных условиях влечет за собой потерю части генетического материала, и морфологически выражается в формировании микроядер. Воспаление и активация клеточной пролиферации играет большую роль в повышении уровня генетической нестабильности в клетках, находящихся в непосредственной близости от воспалительного очага. Однако хромосомные повреждения не всегда наблюдаются при хроническом воспалении. Действие некоторых химических соединений вызывает воспалительную реакцию повреждение хромосом, сопровождающееся формированием микроядер, и индуцирует апоптоз. При этом показан дозозависимый эффект воздействия токсических веществ на образование микроядер [Калаев В.Н., 2009; Agostini С, 2007; ].
Размеры микроядер показывают наличие причин, лежащих в основе их образования, что дает возможность объективно оценить целый комплекс явлений, индуцирующих их возникновение. Согласно литературным данным формирование микроядер крупных размеров наблюдается при патологии митотического деления клеток, а структурные аберрации хромосом влекут за собой образование мелких микроядер. При апоптозе могут регистрироваться микроядра различного размера, что связано с фрагментацией клеточного ядра. Связь между образованием микроядер и апоптозом наглядно демонстрирует их появление при воспалении, и отражает начало смены клеточных элементов при данном процессе.
Оценка степени тяжести ДЦП
Для оценки выраженности клинической картины у всех детей основной группы изучена спастичность по шкале Ashworth, и степень тяжести двигательных нарушений по шкалам Клуба Моторики и Ривермид (приложение № 4). При оценке по шкале Ashworth 70% (87 чел.) всех обследованных детей страдает средней степенью тяжести заболевания (табл. 5). У 9% (12чел.) обследованных тяжесть неврологического дефицита оценивалась как тяжелая.
У всех детей со спастической диплегией определена средняя тяжесть заболевания. Этот показатель достоверно преобладает над числом детей со средней степенью при двойной гемиплегии и гемипаретической форме (р 0,01). Легкая степень заболевания представлена только гемипаретической формой и выявлена у более половины (26 чел.- 59%) обследованных с этой формой ДЦП. Тяжелая степень выраженности клинических проявлений обнаруживалась только у больных с двойной гемиплегией (12 чел. - 57%о обследованных с двойной гемиплегией).
Больные со средней степенью тяжести заболевания согласно шкале Клуба Моторики (табл. 6) составили преобладающее большинство - 70%) обследованных. Доля детей со спастической диплегией со средней тяжестью достоверно преобладала над гемипаретической - 58% и 31% соответственно (р 0,05). Детей с двойной гемиплегией со средней степенью тяжести оказалось меньшинство (11%) (р 0,05). Легкая степень выраженности двигательных нарушений была выявлена только в группах детей со спастической диплегией и гемипарезом (43,5% и 56,5% соответственно), тяжелая - в группе с двойной гемиплегией (11 чел. — 7% всех обследованных).
При распределении детей по степеням тяжести ДЦП, оцененной шкалой Ривермид группы распределились следующим образом (табл. 7). 65% больных с двойной гемиплегией страдали тяжелой степенью двигательного дефицита (р 0,01). Число детей с легкой степенью клинических проявлений при гемипаретической форме (83%) - 37 чел.) достоверно преобладало над числом больных со спастической диплегией (17% - 8чел.) (р 0,05). В группе обследованных больных ДЦП со средней степенью тяжести, оцененной шкалой Ривермид, достоверно (р 0,005) преобладало число детей со спастической диплегией, по сравнению с числом детей с другими формами.
Таким образом, степень спастичности, оцененной по шкале Ashworth, и степень тяжести неврологического дефицита у детей основной группы, оцененная по шкалам Клуба Моторики и Ривермид, при всех формах достоверно отличалась. Легкая степень клинической картины преобладала при гемипаретической форме, а у больных с двойной гемиплегией не наблюдалась вовсе. Средняя степень тяжести чаще выявлена у пациентов со спастической диплегией. Тяжелая степень - при оценке всеми использованными шкалами выявлена только у детей с . двойной гемиплегией.
Как было отмечено ранее, в исследование были отобраны дети без клинических и лабораторных признаков внутриутробного инфицирования и инфекционно - воспалительных проявлений при рождении и в период новорожденности. В то же время в исследование включались дети с указанием на однократное обострение хронической соматической патологии или однократное ОРЗ во время беременности у матери. Хроническая соматическая патология и ОРЗ, даже однократные, могут стать факторами риска развития ПВЛ и, как следствие ее исхода, различных синдромов ДЦП. Принимая во внимание вышеизложенное, все обследованные дети основной группы были разделены на 2 группы: группу обследованных, у которых в анамнезе не было указаний на какие-либо заболевания матери во время беременности и группу больных ДЦП с однократными ОРЗ, либо однократными обострениями хронической соматической патологии у матери во время беременности ребенком с ДЦП. Тяжесть неврологических нарушений у детей этих групп представлена в табл.8.
У детей, родившихся от беременности с указаниями на однократное ОРЗ во время беременности, неврологический дефицит при оценке по шкале Ashworth достоверно чаще проявляется тяжелой степенью выраженности (р 0,05) по сравнению с детьми, родившимися от беременности без перенесенного матерью ОРЗ, у которых неврологическая симптоматика проявляется средней степенью тяжести.
При оценке по шкалам Клуба Моторики и Ривермид у детей, родившихся от беременности без указания на простудные и однократное обострение хронического соматического заболевания, неврологическая симптоматика достоверно менее выражена по сравнению с группой детей, рожденных от беременности, протекавшей на фоне однократного ОРЗ (р 0,05). Следовательно, тяжесть клинических проявлений ДЦП в исходе ПВЛ у детей с соматической отягощенностью беременности более выражена, чем у больных ДЦП, в исходе ПВЛ, родившихся от неотягощенной беременности. В то же время необходимо отметить, что у детей, родившихся от беременности без указаний на однократное ОРЗ и обострение хронической соматической патологии, ДЦП формировался, причем и средней, и тяжелой степени тяжести. Следует уточнить, что травматические, инфекционные и метаболические факторы риска ДЦП исключались у обследованных детей на этапе включения в исследование. Следовательно, в организме детей с ДЦП, например в ПВО, могут протекать неизвестные нейродеструктивные механизмы, приводящие к тяжелому неврологическому дефициту.
Результаты корреляционного анализа
Нами проведено изучение корреляционной связи между содержанием TNF-a в сыворотке крови и слюнной жидкости и отдельными иммунологическими показателями, а также выраженностью клинических симптомов у детей с ДЦП. Так, у детей с ПВЛ обнаружена прямая корреляционная зависимость степени тяжести ДЦП, оцененной по шкале Ривермид от содержания TNF-a в сыворотке крови (R=0,45). У детей без каких-либо изменений в ПВО обнаружена отрицательная корреляция уровня TNF-a в сыворотке крови со степенью тяжести по шкале Ривермид (R= - 0,54). Аналогичный характер корреляционной зависимости установлен между показателями TNF-a в слюнной жидкости и степенью тяжести по шкале Ривермид (у детей с ПВЛ - R=0,67; у детей без изменений в ПВО -R=-0,31).
Наряду с этим, выявлена средняя положительная корреляция между содержанием TNF-a в слюнной жидкости и степенью тяжести ДЦП, оцененной по шкале Ashworth (R=0,48) и средняя отрицательная корреляция между аналогичными показателями при оценке шкалой Клуба Моторики (R= - 0,56).
Одновременно установлена сильная положительная корреляционная зависимость между уровнем TNF-a в сыворотке крови и слюнной жидкости и абсолютным содержанием лимфоцитов в периферической крови (соответственно R=0,71 и R=0,67) (рис. 12,13) у детей, перенесших ПВЛ.
У детей без изменений в ПВО имела место отрицательная корреляционная связь между аналогичными показателями (R=-0,83 и R= 0,38 соответственно) (рис. 14,15), как и у детей контрольной группы (R=-0,45).
Эти данные свидетельствуют об отчетливой взаимосвязи уровня лимфоцитов и выработки TNF-a у детей с патологией ПВО: возможно, процессы при ПВЛ стимулируют активацию лимфоцитов к синтезу TNF-a.
В результате корреляционного анализа обнаружена однотипная положительная корреляционная зависимость между уровнем TNF-a в сыворотке крови и содержанием СОЗ+С08+-лимфоцитов у детей, перенесших ПВЛ, и контрольной группы (соответственно R=0,55 и R=0,37), в то время как у детей без патологии перивентрикулярной области обнаружена сильная отрицательная корреляционная связь (R= - 0.83).
В то же время показатели TNF-a в слюнной жидкости у детей с ДЦП без патологии перивентрикулярной области коррелировали с содержанием СОЗ+С08+-лимфоцитов однотипно с таковыми у детей контрольной группы (соответственно R= - 0,33 и R= - 0,38). Однако, у детей, перенесших ПВЛ, отмечалась сильная положительная корреляционная зависимость данных показателей (R=0,61).
Корреляция уровня TNF-a в сыворотке крови и слюнной жидкости у детей с ДЦП без патологии перивентрикулярной области с содержанием CD 19+ - лимфоцитов не отличалась от таковой у детей контрольной группы (соответственно R= - 0,84; R= - 0,45 и R= - 0,81), в то время как у детей с ПВЛ с исходом в ДЦП выявлена положительная корреляционная связь средней силы (для уровня TNF-a в сыворотке крови и содержание CD 19+ -лимфоцитов - R=0,54; для уровня TNF-a в слюнной жидкости и CD 19+ -лимфоцитов - R=0,45).
Содержание TNF-a в сыворотке крови и слюнной жидкости у детей с ДЦП, независимо от наличия изменений в ПВО умеренно коррелировало с показателем цитогенетических нарушений в эритроцитах, а именно: сила корреляционной связи между TNF-a в сыворотке крови и ЭМ составило у детей с ДЦП без ПВЛ R= - 0,29 (рис. 18); у детей с ПВЛ - R=0,82 (рис. 16); между TNF-a в слюнной жидкости и ЭМ у детей с ПВЛ - R=0,64 (рис. 17), в то время как в контрольной группе выявлена отрицательная сильная корреляционная связь между этими показателями (R= - 1,0).
Таким образом, проанализировав полученные результаты, можно сделать выводы:
- У детей с ДЦП без перенесенной ПВЛ выявлена отрицательная корреляционная связь уровня TNF-a в сыворотке крови, слюнной жидкости со степенью тяжести клинической картины по шкале Ривермид. Содержание TNF-a в слюнной жидкости коррелировало со степенью тяжести ДЦП (R=0,38).
- Уровень TNF-a в сыворотке крови и слюнной жидкости имел положительную корреляционную связь с содержанием лимфоцитов в периферической крови у больных ДЦП в исходе ПВЛ, при этом у детей без ПВЛ и здоровых детей имела место отрицательная коррреляционная связь.
- При увеличении уровня TNF-a у детей с ДЦП в исходе ПВЛ отмечается увеличение эритроцитов с микроядрами (сильная положительная корреляционная связь), у детей без изменений в ПВО и детей контрольной группы выявлена отрицательная корреляционная связь между этими показателями.
