ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СТРУКТУР ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА В ПОРАЖЕННОЙ КОЖЕ БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛЫМИ ФОРМАМИ ПСОРИАЗА НА ФОНЕ СИСТЕМНОЙ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ (ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Катунина, Оксана Рахимовна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Катунина, Оксана Рахимовна. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СТРУКТУР ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА В ПОРАЖЕННОЙ КОЖЕ БОЛЬНЫХ ТЯЖЕЛЫМИ ФОРМАМИ ПСОРИАЗА НА ФОНЕ СИСТЕМНОЙ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ (ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) : диссертация ... доктора медицинских наук : 14.01.10 / Катунина Оксана Рахимовна; [Место защиты: Федеральное государственное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии"].- Москва, 2012.- 148 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 16

1.1 Современные представления об участии кожи в иммунных процессах 16

1.2 Участие компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза 36

1.3 Сведения о влиянии анти-ФНО-а - терапии на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при псориазе 48

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51

Результаты собственных исследований 60

Глава 3. Клинико-морфологическая характеристика больных 60

Глава 4. Результаты исследования иммунных процессов в пораженной коже больных псориазом 63

4.1 Рецепторы врожденного иммунитета и антигенпрезентирующие клетки в коже больных псориазом 63

4.2 Содержание и распределение провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а в коже больных псориазом 72

4.3 Содержание и распределение молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина в коже больных псориазом 77

4.4 Показатели адаптивного иммунитета в коже больных псориазом 83

ГЛАВА 5. Терапевтическая эффективность лечения больных псориазом (результаты ближайшего и отдаленного наблюдения) 88

ГЛАВА 6. Влияние терапии на иммунные процессы в коже больных псориазом 99

6.1 Динамика показателей врожденного иммунитета в процессе терапии инфликсимабом 99

6.2 Динамика содержания и распределения провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а в процессе терапии инфликсимабом 108

6.3 Динамика содержания и распределения молекул межклеточной адгезии 1С AM-1 и Е-селектина в процессе терапии инфликсимабом 115

6.4 Динамика показателей адаптивного иммунитета в процессе терапии инфликсимабом 119

6.5 Динамика исследуемых показателей в группе сравнения 128

Заключение 134

Выводы 156

Практические рекомендации 158

Указтель литературы

Участие компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза
Клинико-морфологическая характеристика больных
Содержание и распределение провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а в коже больных псориазом
Динамика содержания и распределения молекул межклеточной адгезии 1С AM-1 и Е-селектина в процессе терапии инфликсимабом

Введение к работе

Актуальность проблемы. Псориаз - один из тяжелых дерматозов мультифакториальной природы, имеющий наследственную предрасположенность. Заболевание характеризуется рецидивирующим течением с частыми обострениями (Griffiths C.E., 2007; Lowes M.A., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009; Nestle F.O., 2009; Navarini A.A., 2010). Нередко сочетается с патологией органов желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой системы, вовлечением в патологический процесс суставов (Neimann A.L., 2006; Katsambas A., 2008; Navarini A.A., 2010).

Кожные высыпания при псориазе формируются за счет гиперпролиферации и нарушения дифференцировки кератиноцитов, развития воспалительной инфильтрации в дерме, опосредованной активированными Т лимфоцитами (Liu Y.,Krueger J.G. et.al., 2007; Griffithc C.E., Barker J.N., 2007; Скрипкин Ю.К., Бутов Ю.С., 2009 и др.). Существуют данные, что появление основных патоморфологических феноменов в очагах пораженной кожи больных псориазом (акантоза эпидермиса, паракератоза, микроабсцессов Мунро, воспалительной инфильтрации дермы) опосредовано биологическим эффектом продукта активированных клеток кожи - провоспалительного цитокина - фактора некроза опухоли альфа (ФНО-) (Nickoloff B.J., 1991; Griffiths C.E., 2007; Lin J., 2008). Относительно клеток-продуцентов ФНО-, его рецепторов, клеток-мишеней и биологических эффектов этого цитокина, имеются многочисленные публикации в научной литературе, однако они касаются процессов, происходящих только в органах иммунной системы. Данные о степени экспрессии ФНО-, как показателя активированного состояния клеток непосредственно в очагах пораженной кожи, в отечественной литературе отсутствуют.

Клетки кожи с разнообразными распознающими рецепторами - кератиноциты эпидермиса, антигенпрезентирующие клетки кожи (клетки Лангерганса), нейтрофильные лейкоциты, антибактериальные пептиды - относятся к структурам врожденного иммунитета и участвуют, прежде всего, в осуществлении барьерных функций. Если при внедрении патогена эти структуры не могут обеспечить его элиминации, то врожденные механизмы защиты обеспечивают обработку патогена для взаимодействия с Т лимфоцитами с последующим развитием адаптивного иммунного ответа. (Barral D.C., Brenner M.B., 2007; Ярилин А.А., 2010, и др.). Данные литературы о количестве клеток Лангерганса при псориазе весьма противоречивы (Deguchi M., Alba S. еt. al., 2002; Lowes M.A., Chamian F. еt.al., 2005). Исследования по изучению роли толл-подобных рецепторов в патогенезе псориаза в Российской Федерации не проводились.

Интерлейкин 1 (ИЛ-1) экспрессируется в коже человека для выполнения ряда физиологических функций (регуляция синтеза и деградации коллагеновых волокон и гиалуроновой кислоты в дерме и др.) (Помыткин И., 2010). В то же время известно, что ИЛ-1, обладая плейотропным характером биологической активности, регулирует все стороны воспалительной реакции. Изучение роли и функции ИЛ-1 при псориазе привело к противоречивым результатам (Cooper K, Hammerberg C. et al.,1990; Debets R., Hegmans J.P. et al., 1995; Громов А.Ю., Чаплыгин А.В. и др., 2005). Поэтому интерес к изучению экспрессии ИЛ-1 непосредственно в пораженной коже больных псориазом возникает как с позиции получения нового иммуноморфологического параметра для оценки активированного состояния клеток кожи, так и для определения эффективности лечения.

Повышенное количество Т лимфоцитов, являющихся составляющей адаптивного иммунитета, обнаруживается в дермальных воспалительных инфильтратах (Охлопков В.А., 2004; Пинсон И.Я., 2006). Циркуляция лимфоцитов между структурами кожи и регионарными лимфатическими узлами строго регулируется молекулами межклеточной адгезии (Ярилин А.А., 2009). Поэтому характеристика таких адгезивных молекул, как ICАM-1 и Е-селектин, в коже больных псориазом, несомненно, имеет большое значение для понимания механизма формирования воспалительного инфильтрата.

Существующие методы системной терапии псориаза недостаточно эффективны, так как они направлены лишь на удлинение периодов ремиссии, снижение степени тяжести заболевания и не приводят к полному излечению больных (Nijsten T., 2005). Повышение эффективности лечения псориаза остается одной из важных проблем дерматологии, решение которой зависит от результатов исследований, направленных на углубление знаний о механизмах патогенеза этого заболевания.

Достижения в сфере молекулярных и клеточных биотехнологий позволили разработать новый класс лекарственных препаратов, являющихся рецепторными или химическими антагонистами различных медиаторов воспаления. Один из механизмов действия биологических препаратов заключается в нарушении связывания эндогенного лиганда с соответствующим рецептором, приводящем к модификации биологических реакций из-за блокирования системы внутриклеточной передачи сигнала (Jackson J.M., 2007; Козлов И.Г., 2009).

В последние годы в терапии псориаза стали использовать генно-инженерные биологические препараты (Sterry W., 2004; Purcell R.T., 2008; Nestle F.O., 2009; Navarini A.A., 2010). В России зарегистрированным и разрешенным к применению для лечения псориаза и псориатического артрита является препарат инфликсимаб (Ремикейд). По наблюдениям отечественных и зарубежных исследователей, терапия инфликсимабом у большинства больных более эффективна, чем при лечении другими системными методами терапии (Boehncke W.H., 2007; Menter A., 2007; Кубанов А.А., Матушевская Ю.И., 2008; Castelo-Soccio L., 2009; Курдина М.И., 2010). Однако инфликсимаб в терапии больных псориазом применятся сравнительно недавно, поэтому механизм реализации его терапевтической эффективности нельзя считать полностью изученным. Работы, посвященные изучению изменений морфологической картины в коже больных псориазом под влиянием терапии биологическими модификаторами иммунных реакций немногочисленны. Данные об иммуноморфологических показателях врожденного и адаптивного иммунитета в процессе биологической терапии приводятся в единичных работах.

Комплексный клинико-иммуноморфологический анализ структурной характеристики и особенностей функционирования врожденного и адаптивного иммунитета необходим для получения новых данных о механизмах развития воспалительного процесса при псориазе и достижения эффекта терапии биологическими модификаторами иммунного ответа, что определяет актуальность, своевременность и целесообразность проведения настоящего исследования.

Цель работы: изучить роль и особенности функционирования компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза и оценить динамику показателей иммунного воспаления в коже больных псориазом в процессе терапии биологическим модификатором иммунного ответа - инфликсимабом.

Задачи:

Провести оценку содержания компонентов врожденного иммунитета морфометрическим методом по показателям экспрессии и распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом: толл-подобных рецепторов 2,4 и 9 типов, провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-, количества клеток Лангерганса.
Исследовать морфометрические параметры экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина, а также содержания компонентов адаптивного иммунитета с учетом показателей распределения в эпидермисе и дерме пораженной кожи больных псориазом субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD45RO+).
Изучить динамику клинической картины заболевания у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом, по результатам ближайших и отдаленных наблюдений (по истечении 2-х месяцев и 1-го года).
Провести анализ динамики показателей врожденного и адаптивного иммунитета в коже больных псориазом в процессе терапии инфликсимабом.
Определить взаимосвязь между клиническими проявлениями на коже больных псориазом, патоморфологической картиной и показателями врожденного и адаптивного иммунитета в процессе отдаленных наблюдений.
Оценить прогностическую значимость показателей врожденного и адаптивного иммунитета у больных псориазом, получающих терапию инфликсимабом.

Научная новизна:

Впервые у больных псориазом проведено иммуноморфологическое исследование, включающее одновременное комплексное определение состояния структур врожденного и адаптивного иммунитета, что является новым перспективным направлением, позволяющим более эффективно изучать закономерности развития воспаления в коже больных и реализации эффективности терапии.

Результаты исследования, основанные на анализе распределения толл-подобных рецепторов разных типов, клеток Лангерганса, относящихся к структурам врожденного иммунитета, субпопуляций Т-лимфоцитов, относящихся к структурами адаптивного иммунитета, молекул, обеспечивающих рекруитмент клеток адаптивного иммунитета в очаг поражения (адгезивные молекулы) и определяющих активацию клеток кожи (провоспалительные цитокины), позволили расширить представления о роли врожденного иммунитета и показать, что такие его структуры, как толл-подобные рецепторы 2 и 4 типов и клетки Лангерганса не только участвуют в запуске иммунного воспаления, но и способны регулировать интенсивность иммунной реакции в коже больных, доказательством чего является наличие корреляционной связи между этими показателями. Изучение параметров содержания компонентов врожденного и адаптивного иммунитета позволило установить, что кератиноциты эпидермиса и эндотелиоциты сосудов непосредственно участвуют в иммунных реакциях при развитии воспалительного процесса в пораженной коже больных псориазом.

Установлено, что воспалительный процесс в коже развивается при значительном увеличении молекул межклеточной адгезии ICAM-1 (на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов, клетках воспалительного инфильтрата) и Е-селектина (на эндотелиоцитах сосудов), необходимых для обеспечения межклеточных взаимодействий. Показано, что в коже здоровых лиц не возникает необходимости в экспрессии молекулы ICAM-1.

Выявлены особенности экспрессии провоспалительных цитокинов в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления установлено увеличение экспрессии ИЛ-1 на кератиноцитах эпидермиса, эндотелиоцитах сосудов и клетках воспалительного инфильтрата, в то время как, иммуногистохимическим методом признаков экспрессии ФНО- обнаружено не было.

Вскрыты неизвестные ранее механизмы действия инфликсимаба, заключающиеся в уменьшении экспрессии распознающих рецепторов TLR2 и TLR4, провоспалительного цитокина ИЛ-1, молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина.

Практическая значимость работы:

Изучение показателей врожденного и адаптивного иммунитета, непосредственно в пораженном органе, в процессе антицитокиновой терапии, позволило установить, что этот метод лечения обладает стабильно нормализующим влиянием на патогенетические компоненты хронического воспаления, сопровождающимся разрешением высыпаний на коже больных. Данные, полученные в ходе исследования, позволили, в соответствии с правилами доказательной медицины, объективно оценить и обосновать эффективность терапии инфликсимабом.

Результаты исследования по определению в коже больных количества толл-подобных рецепторов 2 и 4 типов, клеток Лангерганса, молекул межклеточной адгезии, провоспалительного цитокина ИЛ-1, основных субпопуляций Т лимфоцитов, в перспективе могут быть использованы для научно-обоснованной оптимизации существующих методов системной терапии и являются основой для разработки новых методов лечения псориаза, а также в исследованиях, ориентированных на поиск антигенов, вызывающих развитие иммунного воспаления у больных псориазом.

Основные положения, выносимые на защиту.

Защитные функции кожи, находящейся в непрерывном взаимодействии с внешней средой, и развитие иммунного воспаления при псориазе осуществляются одними и теми же структурами врожденного иммунитета: толл - подобными рецепторами 2 и 4 типов и клетками Лангерганса. Разница между этими процессами заключается в количестве, различном распределении в компартментах кожи и степени активации структур. Патофизиологическая стадия при развитии воспалительного процесса у больных псориазом сопровождается увеличением числа активированных структур врожденного иммунитета, о чем свидетельствует повышение экспрессии распознающих рецепторов TLR2 и TLR4 и количества антигенпрезентирующих клеток Лангерганса (CD1a) в эпидермисе и дерме пораженной кожи.
Формирование воспалительных инфильтратов в пораженной коже больных псориазом происходит на фоне увеличения экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 и Е-селектина, которые в коже у здоровых лиц продуцируются в незначительном количестве.
Связывание провоспалительного цитокина ФНО- при введении инфликсимаба приводит к существенному уменьшению числа толл-подобных рецепторов, количества активированных клеток адаптивного иммунитета, адгезивных молекул в коже. В то же время, в разрешающихся высыпаниях количество активированных клеток Лангерганса остается повышенным, что является предрасполагающим фактором, способствующим обострению патологического процесса.
Появление в отдаленном периоде папулезных элементов у больных псориазом, получающих инфликсимаб сопровождается увеличением числа CD4+ и CD8+ лимфоцитов.
Биологическая терапия является перспективным методом терапии псориаза. Предложенный алгоритм исследования является основой для разработки новых таргентных препаратов.

Апробация работы.

Основные положения работы представлены и обсуждены в ходе проведения:

-II Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Санкт-Петербург, 25-28 сентября 2007 г.);

-III Всероссийского конгресса дерматовенерологов (г. Казань, 5-9 ноября 2009 г.);

-научно-практических конференциях ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России (г. Москва, 25 сентября 2009 г. и 28 мая 2010 г.);

-пленарном заседании Московского общества дерматовенерологов им. А.И. Поспелова (г. Москва, 18 февраля 2010 г.);

-XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (г. Екатеринбург, 9-12 ноября 2010 г.);

-VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 11-12 ноября 2010 г.);

-22-м Мировом Конгрессе дерматологов (Корея, г. Сеул, 24-29 мая 2011 г.);

-II Континентальном конгрессе дерматологов международного дерматологического общества/ IV Всероссийском конгрессе дерматологов (г. Санкт-Петербург, 5-9 июля 2011 г.).

Внедрение результатов исследования. Иммуноморфологические методы исследования внедрены в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и болезней кожи ФГБУ «ГНЦДК» Минздравсоцразвития России.

Полученные в ходе выполнения исследования результаты, используются в обучающих программах сертификационных курсов для дерматовенерологов, на занятиях с клиническими ординаторами и аспирантами, на циклах общего и тематического усовершенствования.

Результаты исследования, касающиеся характеристики иммунопатологических реакций в коже при псориазе были использованы при составлении глав в руководствах для врачей: Клиническая дерматовенерология: 2 т./под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, 2009г. и Дерматовенерология. Национальное руководство/под редакцией Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова, О.Л. Иванова, 2011г.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 25 научных работах, из которых 16 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных литературных источников по теме исследования, разработан дизайн исследования. Проведена гистологическая обработка биопсийного материала, изготовлены срезы биоптатов, на которых в последующем осуществлена постановка иммуногистохимической реакции. С помощью светового микроскопа проведен анализ полученных гистологических и иммуногистохимических препаратов, проведено фотодокументирование патоморфологической картины. С применением компьютерной программы анализа изображения ImageJ проведен морфометрический анализ исследуемых показателей. С помощью прикладной программы осуществлена статистическая обработка полученных материалов. Проведена интерпретация данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 185 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 47 рисунками (80 фотографий). Состоит из введения, 6 глав с описанием данных литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего 55 источников на русском и 191 источник на иностранных языках.

Участие компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе псориаза

Согласно современной концепции фундаментальной иммунологии, под адаптивным иммунитетом понимают «совокупность свойств и взаимодействий лимфоцитов, обеспечивающих специфическое распознавание антигенов», прочие механизмы защиты от повреждений называют врожденными механизмами защиты. В 30-70 годы эти механизмы именовались неспецифическими факторами резистентности, доиммунными механизмами защиты, позднее они получили название - врожденный иммунитет (Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. и соавт., 2010).

Адаптивный (синонимы: приобретенный, лимфоцитарный) иммунитет присутствует лишь у 1,5% от всех видов организмов, существующих на Земле. Способность Т лимфоцитов реагировать на широкий круг потенциальных антигенов посредством экспонирования на их поверхности специализированных рецепторов для антигенов и продукции ими антител, специфичных к конкретному антигену, в филогенезе появилась только у позвоночных (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2009; Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. и соавт., 2010). Этот механизм является мощной целенаправленной защитой, обеспечивающей патоген-специфический иммунный ответ с формированием иммунологической памяти (Gibson J., Gow N. et al., 2010), функция которой заключается в более быстром и эффективном ответе при повторном поступлении в организм патогена (Cooper M.D., Alder M.N., 2006). В коже человека адаптивный иммунитет формируется в течение всей жизни как совокупность иммунных реакций, и основывается на воспроизведении Т- и В-лимфоцитов (Абелев Г.И., 1998), экспонирующих структурно уникальные рецепторы, специфичные по отношению к каждому конкретному антигену.

Врожденный иммунитет (синонимы: неспецифические факторы иммунитета, система врожденной защиты) является филогенетически более древней системой защиты, не обладает строгой специфичностью по отношению к патогенам и не способен сохранять память о контакте с ними. Присутствует почти у всех многоклеточных организмов, в том числе у растений, беспозвоночных, и даже, одноклеточных эукариот (Clark R., Kupper Т., 2005; Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2009; Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. и соавт., 2010). В процессе эволюции структуры врожденного иммунитета возникли раньше появления адаптивного, а включение этих структур в защитные процессы живого организма происходит гораздо раньше формирования лимфоцитзависимых процессов (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2009; Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. и соавт., 2010). Адаптивный иммунитет являлся предметом пристального изучения закономерностей развития иммунных реакций в коже в течение нескольких последних десятилетий. Механизмы распознавания патогенов структурами врожденной защиты остаются менее изученными (Takeda К., Kaisho Т. et al., 2003; Толстопятова М.А., Буслаева Г.А. и соавт., 2009). К настоящему времени накоплено значительное количество научных фактов, свидетельствующих о том, что основными функциями врожденного иммунитета являются распознавание патогенов и их уничтожение при помощи фагоцитоза или с использованием эндогенно-синтезируемых антибактериальных пептидов. Если эти механизмы не приводят к утрате свойств патогена и не обеспечивают его элиминации, то врожденные механизмы защиты обеспечивают обработку патогена для взаимодействия с Т-лимфоцитами с последующим развитием адаптивного иммунного ответа. В отличие от адаптивного иммунитета, функционирование которого обеспечивают Т и В лимфоциты, механизмы врожденной защиты не имеют какой-либо одной дифференцированной системы клеток, а представляют собой разнообразные рецепторы, молекулы и их комплексы, которые конституционально присутствуют на разных клетках и имеют одинаковое функциональное предназначение (Хаитов P.M., Игнатьева Г.А. и соавт., 2010).

Распознавание каждого отдельно взятого антигена структурами врожденного иммунитета невозможно по причине существования бесконечного множества антигенных структур. Поэтому, стратегией врожденных механизмов защиты является распознавание сходных фрагментов молекул, присутствующих у различных патогенов (Меджитов Р., Джаневей Ч., 2004). Для объяснения механизма врожденной защиты Janeway С.А. в конце XX века сформулировал гипотезу о патоген-ассоциированных молекулярных образах (pathogen-associated molecular patterns - PAMPs), которые закодированы в геноме микроорганизмов, и отсутствуют в геноме макроорганизмов. PAMPs представляют собой эволюционно консервативные молекулярные структуры, передающиеся у микроорганизмов из поколения в поколение (Janeway С.А., 1989; Medzhitov R., 2001; Takeda К., Akira S., 2005). Наиболее изученными PAMPs являются липополисахариды бактериальной стенки, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, липотейхоевые кислоты, маннаны, зимозан грибов, ДНК и РНК бактерий и вирусов (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2009; Быкова В.П., Калинин Д.В., 2009). Результаты исследований последних лет показали, что в качестве PAMPs могут выступать не только молекулярные структуры микроорганизмов, но и иные вещества, в том числе молекулярные структуры растений, экстракты домашней пыли, никель (Kawasaki К., Akashi S. et al., 2000; Sabroe R.F., Read R.C. et al., 2003; Jared В., Chisholm D. et al., 2005; Schmidt M., Raghavan B. et al., 2010). Кроме того, было доказано, что к PAMPs можно отнести и различные эндогенные соединения макроорганизма, высвобождающихся при повреждении клеток (так называемые молекулярные паттерны, связанные с повреждением - damage associated molecular patterns (DAMPs)) (Хаитов P.M., Пащенков M.B. и соавт. 2009). Ими могут являться белки теплового шока, фибронектин, дефензины, фибриноген и другие вещества (Ohashi К., Burkart V. et al. 2000; Okamura Y., Watari M. et. al. 2001; Smiley S.T., King J.A. et al. 2001; Sabroe R.F., Read R.C. et al. 2003). Несмотря на значительные различия в химической структуре, все PAMPs имеют общее свойство: их компоненты кардинально отличаются от собственных молекулярных структур любой клетки макроорганизма (Симбирцев А.С. 2005; Лебедев К.А., Понякина И.Д. 2009), они важны для выживания и/или вирулентности микроорганизмов, и обычно представляют собой инвариантные структуры, присущие конкретному классу патогенов (Лебедев К.А., Понякина И.Д. 2009).

Клинико-морфологическая характеристика больных

Больные основной группы получали препарат инфликсимаб (химерное соединение на основе гибридных и человеческих IgGl моноклональных антител), являющийся селективным иммунодепрессантом, связывающим как растворимую, так и трансмембранную формы ФНО-а человека. До начала лечения больных основной группы тщательно обследовали для исключения новообразований, туберкулеза, тяжелых хронических инфекций, сердечнососудистой недостаточности. Женщины детородного возраста включались в исследование после получения отрицательного результата теста на беременность, при условии использования высокоэффективных методов контрацепции. Инфликсимаб вводили в дозе 5 мг/кг массы тела внутривенно капельно. Повторные введения препарата осуществляли через 2 и 6 недель после первого введения и далее каждые 8 недель. Непосредственно перед каждым введением препарата всем больным проводили общие анализы крови и мочи, биохимический анализ крови (исследование уровня трансаминаз, общего и связанного билирубина, продуктов азотистого обмена). После расчета дозы препарата содержимое каждого флакона растворяли в 10 миллилитрах воды для инъекций, после чего общий объем приготовленной дозы доводили 0,9% раствором натрия хлорида для инъекций до 250 миллилитров. Сразу после приготовления раствор вводили внутривенно капельно в течение не менее 2-х часов, со скоростью не более 2 мл/минуту. Во время проведения инфузии каждые 30 минут больным измеряли частоту сердечных сокращений, частоту дыхательных движений, артериальное давление. По окончании проведения инфузии эти показатели измеряли каждые 30 минут в течение 2-х часов, затем больной оставался под наблюдением дежурного врача.

Группу сравнения составили 42 человека, которые получали фотохимиотерапию, ретиноиды, метотрексат, в различных комбинациях в соответствии с клиническими рекомендациями Российского общества дерматовенерологов (РОДВ). Выбор метода терапии был обусловлен тяжестью кожного процесса, предыдущим использованием различных методов лечения и их эффективностью, наличием сопутствующей патологии. С учетом выбранного метода лечения всех больных группы сравнения до начала терапии тщательно обследовали для исключения противопоказаний к лечению: назначали общие анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, консультации специалистов.

Патоморфологические исследования. У всех больных (80 человек) проведено рутинное гистологическое исследование кожи (окраска гематоксилин-эозином). У 30 больных псориазом (15 человек из основной группы, 15 человек из группы сравнения), из них 12 женщин и 18 мужчин в возрасте от 19 до 68 лет проведены иммуноморфологические исследования кожи.

Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев, не имевших клинических признаков заболеваний кожи, у которых биоптаты кожи были получены во время проведения хирургических операций.

До начала лечения биоптаты брали из центра очагов поражения под местной анестезией 2% раствором лидокаина. Через 2 месяца биоптаты брали из участков, расположенных в непосредственной близости от места первой биопсии. У 6 человек из 15 больных основной группы забор 3-й биопсии проводился через 1 год от начала терапии. В этом случае биопсийный материал брали из имеющихся на момент осмотра очагов поражения.

Биоптаты подвергали стандартной гистологической обработке. Фиксацию биопсийного материала осуществляли в 10% растворе забуференного формалина в течение 12-24 часов при комнатной температуре. После отмывания фиксатора в проточной воде проводилась стандартная гистологическая проводка биоптатов в автоматизированной вакуумной системе обработки тканей Leica ASP300 (Германия) путем обезвоживания в 96% этиловом спирте. Далее кусочки ткани пропитывали парафином, заливали в парафиновые блоки, из которых на ротационном микротоме Leica RM2125RT (Германия) изготавливали срезы толщиной 5 мкм, растягивали их на предметных стеклах. Для иммуноморфологических исследований использовали предметные стекла с полилизиновым покрытием Vision biosystems plus slides (Великобритания). Окраску гематоксилин-эозином проводили в автоматическом устройстве для окрашивания срезов тканей Leica Autostainer XL ST5010 (Германия).

Изучение количества и распределения в структурах кожи основных субпопуляций Т-клеток - CD4+ (Т хелперов/индукторов), CD8+ (цитотоксических Т лимфоцитов) и CD45RO+ (Т-клеток памяти), антигенпрезентирующих клеток (CDla+ клеток Лангерганса), толл-подобных рецепторов 2, 4 и 9 классов (TLR2, TLR4 и TLR9), молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина, провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а проводили непрямым иммунопероксидазным иммуногистохимическим методом. Для иммунофенотипирования использовали мышиные моноклональные антитела против CD4 (клон 1F6), CD8 (клон 1А5), CD45RO (клон UCHL1), CDla (клон МТВ1), CD54 (клон 23G12) и CD62-E (клон 16G4) человека производства фирмы Vision biosystems novocastra (Великобритания), кроличьи поликлональные антитела против TLR2 (регистрационный № 060603), TLR4 (регистрационный № 000206), TLR9 (регистрационный № аЬ53396), ИЛ-1а (регистрационный № Р01583) и ФНО-а (регистрационный № Р01375) человека производства фирмы Abbiotec (США), а также пероксидазную детекционную систему Novocastra Peroxidase Detection System, производства «Leica Microsystems» (Великобритания), включающую вторичные универсальные биотинилированные антитела и стрептавидин-пероксидазный комплекс. Визуализация реакции осуществлялась DAB-хромогеном. Постановку иммуногистохимической реакции осуществляли согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам.

Высокотемпературная антигенная демаскировка проводилась путем кипячения в цитратном буфере (рН - 6,0) в СВЧ - печи при максимальной мощности 900 Вт тремя циклами по 5 минут с 1-минутными перерывами. Остывшие препараты промывали в растворе ТРИС - буфера (рН 7,54-7,58), обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода на метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидазной активности. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 60 минут при комнатной температуре (23С), с вторичными антителами - в течение 30 минут в термостате при температуре 37С. Для завершения окрашивания осуществляли фоновое контрастирование срезов гематоксилином Майера. Полученные гистологические и иммуногистохимические препараты заключали под покровное стекло и изучали с помощью светового микроскопа Leica DM4000B (Германия). Всего было изучено 940 препаратов (170 - гистологических и 770 -иммуногистохимических).

Содержание и распределение провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а в коже больных псориазом

Исследуемую группу больных составили 80 больных псориазом, из них 46 мужчин и 34 женщины. Возраст больных составлял от 19 до 75 лет (медиана 40,5), продолжительность заболевания варьировала от 1 года до 42 лет (медиана 18).

При анализе данных анамнеза было установлено, что дебют заболевания приходился на возраст от 4 до 65 лет (медиана 22). У 29 человек выявлен отягощенный наследственный анамнез. Начало заболевания у 31 больного было связано со стрессовой ситуацией, у 2 - со злоупотреблением алкоголем, у 1 больной с наступлением беременности, у 5 - с переохлаждением и перенесенной вирусной респираторной инфекцией. 1 больной отметил, что заболевание у него возникло после пребывания на Чернобыльской АЭС, где он работал в качестве ликвидатора аварии. У 40 больных возможную причину заболевания выявить не удалось.

У 16 больных отмечалась сезонная зависимость: у 12 - обострение заболевания наблюдалось в осенне-зимний период, у 4 - в весенне-летний. У 64 человек наблюдалось внесезонное течение заболевания. Среди сопутствующей патологии следует отметить заболевания сердечно-сосудистой системы (22 человека), желудочно-кишечного тракта (34 человека), мочеполовой системы (4 человека), эндокринной системы (9 человек). У 11 больных наблюдалась железодефицитная анемия.

Вульгарный псориаз диагностирован у 56 (70%) больных, на коже которых имелись распространенные мономорфные папулезные высыпания розового или красного цвета, покрытые рыхлыми серебристо-белыми чешуйками, четко отграниченные от здоровой кожи. В результате периферического роста папулы местами сливались в бляшки различных очертаний, диаметром от 5 до 20 см (рис. 3.1 А). У 24 (30%) больных была отмечена эритродермия. При этом патологический процесс локализовался практически на всей поверхности кожного покрова. Кожные покровы были от розовато-красного до ярко-красного цвета, инфильтрированы, с умеренным крупно- и мелкопластинчатым шелушением (рис. 3.1 Б). У части больных отмечалось увеличение периферических лимфатических узлов. А) Больная М., 56 лет, распространенные высыпания на коже туловища, представленные папулами, сливающимися в крупные бляшки неправильных очертаний Б) Больная К., 42 лет, псориатическая эритродермия, кожные покровы ярко-красного цвета, инфильтрированы Величина индекса PASI колебалась от 10 до 65,4 баллов (медиана 35,1 балла). У 46 (57,5%) больных помимо кожного процесса диагностирован псориатический полиартрит с вовлечением в процесс лучезапястных, локтевых, коленных, голеностопных, плюсневых, плюснефаланговых и межфаланговых суставов. У 35 (43,7%) больных наблюдались патологические изменения ногтевых пластин в виде их утолщения и деформации, изменения цвета, появления подногтевого гиперкератоза, симптома «наперстка».

Большая часть пациентов ранее неоднократно получала лечение различными методами системной терапии, включая ретиноиды (неотигазон, тигазон), цитостатические препараты (метотрексат, циклоспорин, циклофосфан), фототерапию (общая фотохимиотерапия с пероральным приемом фотосенсибилизатора, локальная фотохимиотерапия, ПУВА-ванны, узкополосная фотохимиотерапия), глюкокортикостероидные препараты для парентерального введения и для наружного применения (дипроспан, преднизолон, кремы и мази, содержащие кортикостероиды).

Результаты гистологического исследования показали характерные для заболевания патологические признаки: акантоз эпидермиса, нарушение дифференцировки кератиноцитов в виде паракератоза, наличие микроабсцессов Мунро внутри паракератотических чешуек, густая периваскулярная инфильтрация в дерме преимущественно из лимфоцитов и гистиоцитов, в биоптатах полученных из очагов пораженной кожи до начала лечения (рис. 3.2).

Динамика содержания и распределения молекул межклеточной адгезии 1С AM-1 и Е-селектина в процессе терапии инфликсимабом

Изучение содержания и распределения провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а проводилось до начала лечения у 30 больных псориазом (12 женщин и 18 мужчин) и у 10 здоровых добровольцев. Экспрессия провоспалительного цитокина ИЛ-1а в пораженной коже больных псориазом выявлялась в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, в шиповатом слое была выражена наиболее интенсивно, отсутствовала в паракератотическом и роговом слоях (рис. 4.7А). Площадь экспрессии ИЛ-1а в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 957,5мкм2 [821,6-1084,5] (Р 0,001).

В дерме экспрессия ИЛ-1а наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов, клетках воспалительных инфильтратов. Для оценки содержания ИЛ-1а в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых обнаруживалась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией ИЛ-1а до 8,5% [6,1-10,7] (Р 0,001) (рис. 4.7 Б) (табл. 4.3).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия ИЛ-1а в эпидермисе была выражена очень слабо, на эндотелии сосудов дермы отсутствовала, выявлялись единичные позитивно окрашенные клетки, локализованные вокруг сосудов поверхностного сплетения (рис. 4.7 В, Г).

При проведении корреляционного анализа установлена прямая связь между увеличением площади экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ-1а и повышением площади экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (TLR2 и TLR4) в эпидермисе и дерме (табл. 4.4).

Экспрессия провоспалительного цитокина ИЛ-1а в коже больного псориазом (верхний ряд) и в коже здорового добровольца (нижний ряд). А,В - в эпидермисе; Б,Г - в дерме. ИГХ реакция с поликлональными антителами к ИЛ-1а; А,В х ув.100; Б,Г х ув.200

Содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-la и ФНО-а в пораженной коже больных псориазом и у здоровых лиц показатель больные псориазом (п=30) здоровыедобровольцы(п=10) Р1 ИЛ-1аЭ3(мкм2) 957,5 [821,6-1084,5]2 0 0,001 ИЛ-1аД4(%) 8,5 [6,1-10,7] 0 0,001 ФНО-а Э (мкм2) 0 0 ФНО-а Д (%) 0 0 Примечание: !Р - уровень статистической значимости при сравнении показателей больных псориазом и здоровых добровольцев 2 медиана значений, в скобках приведены границы интерквартильных отрезков 3Э - эпидермис, 4Д - дерма

Примечание: во всех случаях уровень статистической значимости Р 0,05, 1Э - эпидермис, 2Д - дерма Реакция с моноклональными антителами к ФНО-а была расценена нами как отрицательная в эпидермисе и дерме как у больных псориазом (рис. 4.8) , так и у здоровых лиц (рис. 4.9).

Для подтверждения полученных результатов была проведена постановка иммуногистохимической реакции с поликлональными антителами к ФНО-а в образцах ткани низкодифференцированного рака толстой кишки (аутопсийный материал), где положительная очаговая экспрессия исследуемого маркера наблюдалась в опухолевых клетках, а также в клетках инфильтрата соединительнотканной стромы (рис. 4.10).

Экспрессия провоспалительного цитокина ФНО-а в ткани опухоли толстой кишки. ИГХ с поликлональными антителами к ФНО-а; ув. х 400 Полученные результаты выявили следующие особенности экспрессии провоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ФНО-а в структурах пораженной кожи больных псориазом: при наличии клинических признаков воспаления в очагах пораженной кожи установлено увеличение экспрессии ИЛ-1а, в то время как признаков экспрессии ФНО-а не было обнаружено. Полученные результаты можно объяснить возможностью депонирования ИЛ-1а в коже и локальным функционированием ФНО-а в низких концентрациях, не определяющихся иммуногистохимическим методом.

Изучение содержания и распределения молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина проводилось до начала лечения у 30 больных псориазом (12 женщин и 18 мужчин) и у 10 здоровых добровольцев.

Экспрессия молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в биоптатах, полученных из очагов поражения больных псориазом, наблюдалась в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, отсутствовала в паракератотическом и роговом слоях (рис. 4.11 А). Площадь экспрессии молекулы межклеточной адгезии ICAM-1 в эпидермисе на отрезке длиной 0,5 мм была достоверно повышена до 968,9 мкм 2 [853,1 1073,1] (Р 0,001).

В дерме экспрессия ICAM-1 была обнаружена на эндотелии кровеносных сосудов, клетках воспалительных инфильтратов. Для оценки содержания ICAM-1 в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых выявлялась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией ICAM-1 до 8,1% [6,1- -10,6] (Р 0,001) (рис. 4.11 Б), (табл. 4.5). В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия ICAM-1 в эпидермисе и на эндотелии сосудов дермы отсутствовала, выявлялись лишь единичные позитивно окрашенные клетки, локализованные вокруг сосудов поверхностного сплетения (рис. 4.11 В, Г).

Экспрессия молекулы Е-селектина в эпидермисе у больных псориазом до начала лечения отсутствовала (рис. 4.12 А). В дерме экспрессия молекулы Е-селектин наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов. Для оценки содержания молекулы Е-селектин в дерме осуществлялся подсчет площади сосудов, на эндотелии которых наблюдалась экспрессия исследуемого маркера, которая затем выражалась в процентах по отношению к площади поля зрения. Изучение этого показателя выявило достоверное повышение площади сосудов с положительной экспрессией Е-селектина до 8,5% [6,5-10,2] (Р 0,001) (рис. 4.12 Б).

В биоптатах кожи, полученных от здоровых лиц, экспрессия молекулы Е-селектина в эпидермисе отсутствовала (рис. 4.12 В). В дерме у здоровых лиц экспрессия Е-селектина наблюдалась на эндотелии кровеносных сосудов. Содержание сосудов с положительной экспрессией Е-селектина у здоровых лиц составило в среднем 2,4 % [1,9-КЗ,2] (рис. 4.12 Г), (табл. 4.5).

При проведении корреляционного анализа установлена прямая связь между увеличением площади экспрессии молекулы межклеточной экспрессии ICAM-1 в эпидермисе и дерме больных псориазом (г = 0,66; Р 0,05). Повышение площади экспрессии Е-селектина в дерме коррелировало с увеличением площади экспрессии ICAM-1 в эпидермисе (г = 0,65; Р 0,05) и в дерме (г = 0,93; Р 0,05). Кроме того повышение площади экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и Е-селектина было связано с повышением площади экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4 (TLR2 и TLR4) и провоспалительного цитокина ИЛ- 1а в эпидермисе и дерме (табл. 4.6).