Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 . Некоторые аспекты патогенеза атопического дерматита Естественные антитела к биологически активным веществам 9
1.2.Методы лечения больных атопическим дерматитом 20
Глава 2 Материалы и методы исследования
2.1 . Объем и материалы исследований 28
2.2.Методы лечения больных и способы оценки терапевтической эффективности 33
Глава 3 Собственные результаты исследования
3.1 .Клиническая характеристика больных 35
3.2.Результаты исследования естественных антител к брадикинину и вазопрессину 43
3.3.Ближайшие результаты лечения больных атопическим
дерматитом методом средне-длинноволновой фототерапии и динамика показателей уровня естественных антител к брадикинину и вазопрессину 51
3.4.Отдаленные результаты средне-длинноволновой фототерапии больных атопическим дерматитом 71
Заключение 73
Выводы 84
Указатель литературы 86
- Некоторые аспекты патогенеза атопического дерматита Естественные антитела к биологически активным веществам
- Объем и материалы исследований
- .Клиническая характеристика больных
Введение к работе
Атопический дерматит (АтД) является одним из наиболее распространенных заболеваний в дерматологии. Накоплено значительное количество исследований, посвященных различным аспектам патогенеза атопического дерматита (Самсонов В.А., 1984; Матушевская Е.В., 1987; Гребенюк В.Н., с соавт. 1991; Федоров СМ. с соавт., 1996; Cooper K.D., 1994; Hanifin J.M., Chan J.S., 1996; Суворова К.Н., 1998; Leung D., 1999; Kinet J.P. 1999; Reich K.etal., 2004).
В литературе приводятся убедительные доказательства нарушений различных^ отделов^ центральной и вегетативной нервной системы (Глухенький Б.Т. с соавт., 1984; Каламкарян А.А. с соавт., 1983; Остришко В.В. с соавт., 1998; Hanifm J.M., 1982; Bosse К., 1986; Hashiro М., Okumura М., 1997).
Вместе с тем большое внимание обращается на актуальность изучения биологически активных веществ - гистамина, серотонина, кининовой системы и системы ацетилхолин-холинэстераза, производных арахидоновой кислоты, которые участвуют в патохимической фазе аллергических реакций (Скрипкин Ю.К. с соавт., 1988; Грандо С.А., 1984; Кулага В.А., 1972; Гребенников В.А., 1988; Koppert W. et al., 2001; Shremmer-Danninger E. et al., 1999).
Установлено, что у больных атопическим дерматитом наблюдается повышенное содержание серотонина, ацетилхолина в крови, активация кининовой системы (Гребенников В.А., 1979).
Важная роль при обострении атопического дерматита отводится стрессовой ситуации и психоэмоциональному перенапряжению (Choi Е.Н., Brown В.Е., Crumrine D., 2005; . Lonne-Rahm S. et al., 2004; Stephan M. et al., 2004).
Функциональные изменения нервной системы могут служить фоном, для усиления секреции биологически активных веществ (Потоцкий И.И., Гребенников В.А., 1986).
Реакция организма в условиях стрессовых ситуаций сопровождается
секрецией в центральной нервной и иммунных системах одних и тех же
веществ пептидной природы - иммуноглобулинов, интерлейкинов,
катехоламинов (Chrousos G.P., 1995; Marchetti В., 2001). Например, пептид
вазопрессин, образующийся в центральной нервной системе, участвует в
модуляции деятельности иммунокомпетентных клеток (Судаков К.В., 2003;
Geenen V.G., 1990). Имеются единичные работы, указывающие о роли
вазопрессина в патогенезе атопического дерматита (Taniguchi Н. et al., 1999;
"Aoki Т.72005).
Трудности в изучении роли низкомолекулярных пептидов в патогенезе заболевания связаны с тем, что данные пептиды в активном состоянии быстро метаболизируются, что затрудняет их выявление в сыворотке крови. Об их присутствии у больных атопическим дерматитом можно судить по уровню естественных антител к ним (Мягкова М.А., 2001).
Имеющиеся данные об исследовании естественных антител методом иммуноферментного анализа к простагландинам, катехоламинам, гистамину у здоровых людей и больных с различными заболеваниями подтвердили возможность использования этого метода (Крупник В.Е. с соавт., 1987; Яшаева И.Г., Самсонов В.А., 1988; Нероев Е.В. с соавт., 2004; Кульчиева О.В., 2001; Arnaud Е. et. al., 1994).
У больных атопическим дерматитом естественные антитела к таким пептидам как брадикинин и вазопрессин не исследовались.
По-прежнему актуальной проблемой является терапия больных атопическим дерматитом. В последние годы большое значение уделяется использованию преформированных физических факторов. Среди всех физиотерапевтических методов основное место занимает ультрафиолетовое лечение, среди них наиболее часто применяемыми методами является
ПУВА-терапия и селективная фототерапия (СФТ) больных атопическим
дерматитом. Ряд авторов указывает на успешное применение общей
фотохимиотерапии, основанной на использовании длинноволнового
излучения при упорных и тяжелых случаях АтД (Скрипкин Ю.К. с соавт.,
1984; Krutmann J., 1999; Мошнина З.И., Мошнин М.В., 2005). Но ряд
противопоказаний (патология желудочно-кишечного тракта, эндокринной
системы, органов зрения), которые нередко сопровождает атопический
дерматит и побочных эффектов при приеме препаратов фурокумаринового
ряда ограничивает применение этого метода. Селективная (средневолновая)
фототерапия чаще применяется в лечении относительно легких и
ограниченных форм этого дерматоза (Яшаева И.Г., 1988; Shropl F., 1984;
Krutmann J— 1999); -
Между тем, в последние годы показана достаточно высокая эффективность сочетанной средне-длинноволновой фототерапии, с одновременным воздействием средневолнового (УФВ) и длинноволнового (УФА) спектров излучения у больных с псориазом (Jekler J. 1990; Pasic A. et al. 2003). Результаты лечения больных атопическим дерматитом этими спектрами ультрафиолета отличаются противоречивостью. (Midlefart К., Stenveld S. Е., et. al, 1985; Larko О., 1996; Piletta P.A. et. al., 1996; Kobuletzki G., Freitag M. et al. 1999; Valkova S.,Velkova A., 2004).
Отсутствие данных в отечественной литературе о результатах лечения больных методом средне-длинноволновой фототерапии, роли естественных антител к брадикинину и вазопрессину в патогенезе атопического дерматита определило цель исследования - оценку эффективности средне-длинноволновой фототерапии больных атопическим дерматитом с учетом показателей уровня естественных антител к низкомолекулярным пептидам.
Задачи исследования:
1. Изучить ближайшие и отдаленные результаты средне-длинноволновой
фототерапии больных атопическим дерматитом в сравнении с группой
больных атопическим дерматитом, получавших селективную терапию.
Изучить уровень естественных антител к низкомолекулярным пептидам у больных атопическим дерматитом до и после средне-длинноволновой фототерапии.
Изучить возможность использования результатов определения уровня свободных и связанных естественных антител в оценке эффективности лечения и активности патологического процесса
Научная новизна: /
Установлена эффективность средне-длинноволновой фототерапии у больных атопическим дерматитом при среднетяжелом и относительно легком течении заболевания на основании оценки ближайших результатов лечения. Показано, что транзиторные побочные реакции у больных, получающих средне-длинноволновую фототерапию, наблюдаются достоверно реже, чем при селективной фототерапии.
Впервые у больных атопическим дерматитом проведено исследование уровня свободных и связанных циркулирующих естественных антител к брадикинину и вазопрессину. Установлено, что у больных с увеличением тяжести клинических проявлений повышается и содержание свободных естественных антител класса М к брадикинину и вазопрессину. Практическая значимость:
Разработаны научно - обоснованные показания к применению средне-длинноволновой фототерапии в комплексном лечении больных атопическим дерматитом, заключающиеся в использовании этого метода преимущественно при среднетяжелом и относительно легком течении заболевания.
Показана целесообразность исследования содержания циркулирующих свободных естественных антител к брадикинину и вазопрессину для определения активности кожного процесса и оценки эффективности лечения больных атопическим дерматитом.
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии и клинической микологии с курсом лабораторной диагностики и лабораторной микологии ГОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Росздрава.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на IX Всероссийском-съезде дерматовенерологов, Москва, 2005; Научно-практической конференции ГУ «ЦНИКВИ Росздрава», Москва, 2006.
Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих материалы и методы исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 188 источников, из них 111 - отечественных и 77 -иностранных. Работа изложена на 104 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 31 таблицей.
Некоторые аспекты патогенеза атопического дерматита Естественные антитела к биологически активным веществам
Атопический дерматит (АтД) - распространенное заболевание кожи, встречающееся в различных возрастных группах, характеризующееся неуклонным ростом заболеваемости, хроническим рецидивирующим течением и торпидностью к проводимой терапии.
В настоящее время в научной литературе имеется много работ, посвященных различным аспектам патогенеза атопического дерматита.
Одним из ведущих факторов в этиологии и патогенезе дерматоза является наследственная предрасположенность. Установлено, что 60% детей, родители которых болеют атопическим дерматитом, также страдают этим заболеванием. Патология развивается у 81% детей, если больны оба родителя, у 59% - если болен только один из родителей, а другой имеет признаки атопического поражения дыхательных путей и у 56% - если болен один из родителей (Centner J., de Week A.L., 1995; Shaw J.C., 2001; Leung D., 1999).
Ряд исследователей отмечают связь системы HLA-антигенов с наличием заболевания, определяющих не только развитие этой патологии, но и тяжесть течения заболевания. Отмечена ассоциация с HLA А 24, определяющая как фактор риска развития атопического дерматита. Аллели HLA А25, А26, АЗЗ выделяют как факторы резистентности к этому заболеванию (Писаренко М.Ф. с соавт., 1984; Алиева П.М. с соавт., 1993; Потекаев Н.С. с соавт., 1995; Шортонбаева Ж.А.,1998). Выявлены ассоциации антигенов HLA В5, В12, В8, В22, что позволило выделить их в качестве факторов риска возникновения атопического дерматита. Среди локусов HLA DR отмечаются достоверные ассоциации с HLA DR4, DR5, DR6 (Кубанова А.А. с соавт., 1986; Алиева П.М. с соавт., 1993).
Одним из звеньев патогенеза является генетически детерминированная реактивность организма, связанная с гиперпродукцией общего и специфического Ig Е антител в ответ на действие окружающей среды (Назаров П.Г., Горланов И.А., Милявская И.Р., 1999; Hanifin М., Rajka G., 1980; Мао X.Q. et al., 1996; Смирнова Г.И., 1998). Взаимодействие Ig Е антител с аллергеном на клетках - мишенях вызывает изменение структурно - функциональных свойств цитоплазматических мембран и высвобождение биологически активных соединений: гистамина, брадикинина, простагландинов, лейкотриенов и т.д., которые неопсредственно и реализуют развитие аллергических реакций (Leung D.Y., 1997; Cooper К., 1994; 2004; Колюжная Л.Д., Ворбьева Е.А., Стычинская., Л.П., 1989; Матушевская Е.В., 1987; Потекаев Н.С., Курдина М.И., Горшкова Н.Н., 1984; Гребенников В.А., 1986).
Основные особенности функционирования иммунной системы — больных атопическим дерматитом лежат на уровне дифференцировки субпопуляций Т-лимфоцитов. Доказано, что антигенная стимуляция ThO при АтД приводит к дифференцировке их больше в сторону Th2, обеспечивая продукцию аллергенспецифических антител, в частности, IgE (Leung D.Y., 1997; Hamid Q. et al., 1997; Вавилов A.M., Лезвинская E.M., 1997; Суворова K.H., 1998; Grewe M. et al., 1998). В острую фазу АтД преобладает активность Тп2-лимфоцитов, сопровождающихся повышенной выработкой интерлейкинов (ИЛ) 4,5,13 и общего IgE и сниженной продукцией у-интерферона (Leung D.Y., 1995; Renhvold U. et al., 1989). Хронизация дерматоза сопровождается изменением цитокинового профиля, длительно текущая воспалительная реакция приводит к повышению уровня эозинофилов, макрофагов и гиперпродукции ГМ-КСФ, ИЛ-12, ИФ- у (Смирнова Г.И., 1998).
Важная роль в реализации иммунных реакций принадлежит антигенпрезентирующим клеткам, моноцитам, макрофагам, клеткам Лангерганса, эозинофилам, тучным клеткам (Cooper K.D., 1994; Hogan A.D. et al., 1995; Hanifin J.M., et al, 1995; Маннанов A.M., 1987; Niggeman В., et al., 1994; Shroder J.M., et al., 1996; Liefermann K.M., et al., 1989; Sampson H.A., 1988;MagnarinM., 1995; ЯшаеваИ.П, 1988; 1992).
При атопическом дерматите обнаружено повышение функциональной активности В-клеток, что объясняет гиперактивацию гуморального звена иммунной системы (Бережная Н.М., 1997), обнаружено повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов при тяжелых диффузных процессах, в основном за счет IgA и IgG (Сергеев Ю.В. с соавт., 1990).
Аллергены являются важнейшими причинами развития атопического дерматита. В раннем детском и дошкольном возрасте наиболее частыми аллергенами являются пищевые, а в старших возрастных группах возрастает роль поливалентной сенсибилизации (Балаболкин И.И., Гребенюк-В.Н., 1999; Владимиров В.В. с соавт., 1989; Смирнова Г.И., 1998; Hofman Т. с соавт., 1992; Самсонов В.А., 1984; Plats-Mills Т., с соавт., 1983; Sando Т., с соавт., 1992).
В литературе приводятся убедительные доказательства нарушений различных отделов центральной и вегетативной нервной системы в патогенезе дерматоза (Розентул М.А. с соавт., 1961; Сафонова Е.А., 1982; Смелов Н.С. с соавт., 1972; Федоров СМ. с соавт., 1996; Глухенький Б.Т. с соавт., 1984; Hanifin J.M., 1982; Каламкарян А.А. с соавт., 1983; Ведрова И.Н., Баландина Л.П., 1980; Остришко В.В. с соавт., 1998; Кульчиева О.В., 2001). Функциональные изменения нервной системы служат фоном, усиливающим продукцию биологически активных веществ, которые способствуют развитию воспалительной реакции кожи (Потоцкий И.И., Гребенников В.А., Коляденко В.Г., 1986).
Объем и материалы исследований
Под наблюдением находилось 54 больных атопическим дерматитом в возрасте от 15 до 45 лет, из них мужчин было - 23 (42,6%), женщин - 31 (57,4%). Всем больным проводилось клинико-лабораторное обследование, включающее изучение жалоб и анамнеза, оценку общего и локального статуса, клинические анализы крови, мочи, биохимические анализы сыворотки крови. Все больные были консультированы терапевтом, эндокринологом, окулистом для исключения противопоказаний для проведения процедур ультрафиолетового облучения (средне-длинноволновой и селективной фототерапии).
В зависимости от метода лечения больные были разделены на две группы: основную (36 человек) получавшую средне-длинноволновую фототерапию, и группу сравнения (18 человек), которой проводилась селективная фототерапия.
Определение уровня циркулирующих естественных антител к брадикинину и вазопрессину методом иммуноферментного анализа проводили у всех 54 больных в сыворотке крови до и после лечения, реакцию разрушения иммунных комплексов при помощи органических растворителей для изучения уровня связанных естественных антител к брадикинину и вазопрессину до и после лечения проводили у 26 (18 человек из основной группы и 8 человек из группы сравнения) больных.
Контрольную группу составили 25 практически здоровых доноров в возрасте от 18 до 38 лет, из них мужчин было 10 (40%), женщин - 15 (60%).
Наблюдение за отдаленными результатами лечения больных проведено у 25 пациентов основной группы и у 13 - из группы сравнения. Сроки наблюдений составили от 4 месяцев до 2 лет. Метод иммуноферментного анализа.
Для проведения иммуноферментного анализа у исследуемых лиц осуществляли забор 5мл венозной крови натощак до начала, и после окончания лечения. Пробирки с кровью помещали в термостат на 30 мин. при t=+37C, затем пробирку с образовавшимся сгустком оставляли на 18 часов при t=+4C. Образовавшуюся сыворотку центрифугировали при 3000 об/мин. Далее полученные образцы сывороток хранили при t=-20C до момента тестирования.
В работе использованы следующие биохимические реагенты: коньюгаты кроличьих антител против иммуноглобулинов человека, меченых — пероксидазой хрена, тетраметилбензидин, перекись водорода 30%, твин-20 (Sigma). Коньюгированные антигены эндогенных биорегуляторов: брадикинина и вазопрессина синтезировали на полимерном носителе по методу, описанному ранее (Мягкова М.А. 2001).
Определение уровня свободных и связанных естественных антител (е-Ат) к брадикинину и вазопрессину методом иммуноферментного анализа (ИФА) проводили у больных в сыворотке крови до, и после лечения. Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили на 96-луночных планшетах фирмы "Nunc" (Дания). Учет результатов ИФА осуществляли на спектрофотометре с вертикальным сканированием фирмы "Multiskan" (Финляндия) при длине волны 450 нм.
Для определения антител к брадикинину (БК) и вазопрессину (ВП) полистирольные планшеты сенсибилизировали раствором (100 мкл в лунку) коньюгата БК в концентрации 2 мкг/мл и ВП в концентрации 1 мкг/мл. Разведение коньюгатов проводили в 0.02 М карбонатном буфере (рН 9.5). Затем после проведения сорбции планшеты трижды отмывали 0.005% раствором твин-20 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и вносили в лунки в двух повторах по 100 мкл исследуемой сыворотки в ЗФР, содержащем 0.1% твин-20 в разведении 1:200 для брадикинина и 1:400 для вазопрессина. Планшеты инкубировали в течение часа при температуре 37С, отмывали и добавляли в лунки по 100 мкл раствора антивидовых антител против IgM человека, меченых пероксидазой хрена, в разведении 1:2000. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при температуре 37С, промывали, как описано выше, и заполняли субстратной смесью, содержащей 0,4% тетраметилбензидина и 0,4% перекиси водорода в 0.05 М фосфатно-цитратном буфере. После 20-минутного инкубирования в темноте добавляли по 50 мкл 10% раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм.
На основании результатов ИФА проводили анализ содержания антител к БК и ВП в индивидуальных сыворотках больных и доноров. За величину
порогового уровня, разделяющего сыворотки доноров и больных, имеющих - повышенный, либо пониженный уровень антител к исследуемому антигену, принимали значение оптической плотности (OD450) в ИФА, отличающегося от среднего значения OD450 в ИФА для группы доноров на величину трехкратного стандартного отклонения.
Результаты определения антител выражали в оптических плотностях, при этом, чем были выше показатели, тем больше было содержание антител.
Реакция разрушения иммунных комплексов в сыворотке крови.
На первом этапе проводили разрушение сыворотки с помощью органического растворителя (95% этилового спирта). Для этого к 1мл сыворотки добавляли по каплям 1 мл этилового спирта. Образующийся осадок центрифугировали 15-20 мин. при 3000 об/мин., затем супернатант сливали, полученный осадок подсушивали на воздухе. Далее осадок растворяли в 1 мл фосфатно-солевого буфера и оставляли на 8-12 часов при t=+4C. Полученный раствор с разрушенным иммунным комплексом использовали для проведения ИФА.
.Клиническая характеристика больных
В последние годы в научной литературе появились многочисленные исследования по изучению естественных антител к различным антигенным компонентам собственных клеток организма в норме и патологии (Стрюк Р.Н., Токмачев Ю.К., Петрова Р.В., 1995; Нероев Е.В. с соавт., 2004; Ruf J. et al., 1993; ArnoudE. et al., 1994).
Развитие заболевания сопровождается изменениями на молекулярном уровне. Это в свою очередь, находит отражение в сывороточном содержании тех или иных аутоантител, что рассматривается как маркерный признак разных форм патологии-(Ковалев И.Е.,ДолеваяО.Ю., 1985; Полетаев А.Б., 2004).
Известно, что естественные антитела к различным низкомолекулярным пептидам существуют не только в свободно циркулирующем виде, но и в связанном состоянии. При избыточном количестве эндогенного медиатора, задействованного в патологии, происходит связывание в иммунные комплексы, выведение и транспорт для нейтрализации его действия (Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1981; Яшаева И.Г. 1988; Мягкова М.А. 2004).
Учитывая вышеизложенное, в нашем исследовании, мы сочли целесообразным провести изучение содержания свободных и связанных естественных антител к брадикинину и вазопрессину, их сравнительный анализ в норме и у больных атопическим дерматитом для определения их роли в патогенезе заболевания.
Определение свободных естественных антител к брадикинину и вазопрессину методом твердофазного иммуноферментного анализа проведено у 54 больных атопическим дерматитом.
Результаты проведенных исследований показали, что в общей группе больных атопическим дерматитом, содержание свободных естественных антител (е-Ат) к брадикинину (БК), относящихся к иммуноглобулинам класса М, было достоверно выше (р 0,001), чем у лиц контрольной группы (практически здоровые доноры) и составило в среднем 0,888±0,04 ед.опт.плотн. (от 0,415 до 1,738). В контрольной группе среднее значение — 0,726±0,03 ед.опт.плотн., (пределы колебаний от 0,630 до 0,811). Корреляционный анализ выявил положительную связь между показателями индекса SCORAD, средняя величина которого составила 54,8±2,1 баллов и показателями свободных е-Ат к брадикинину (г=0,7).
Необходимо отметить, что содержание свободных естественных антител к брадикинину у 54 больных атопическим дерматитом было различным.
Так, у 18 больных (33,3%) отмечен более высокий уровень е-Ат к БК в среднем - 1,159±0,04 (колебание в пределах от 0,928 до 1,738 ед.опт.плотн.) по сравнению с показателями общей группы (р 0,001) и группы контроля (р 0,001). Индекс SCORAD у этих больных равнялся в среднем 56,7±3,86 баллов (от 48,7 до 80,6). Коэффициент корреляции между показателем, отражающим тяжесть кожного процесса, и уровнем е-Ат к БК был равен (г=0,7). В этой группе отмечено тяжелое и среднетяжелое течение заболевания. Кожный процесс имел универсальный и распространенный характер поражения, с наличием эритематозно-сквамозных, множественных папулезных элементов с обширными участками выраженной инфильтрации, лихенизации, большим количеством экскориаций, серозно-геморрагических корочек, явлениями экссудации. Всех больных беспокоил постоянный или периодический выраженный зуд, сухость кожи и нарушение сна.
У части больных, в эту подгруппу вошли 11 человек, содержание е-Ат к БК определяли в пределах такового общей группы 0,857±0,01 ед.опт.плотн. (р 0,05), которое колебалось в пределах от 0,815 до 0,900 и было достоверно выше, чем у лиц контрольной группы (р 0,001). Среднее значение индекса SCORAD было 51,6±2,9 (от 43,9 до 65,1). Коэффициент корреляции составил 0,3. В этой группе отмечено среднетяжелое течение, с распространенным характером поражения кожных покровов, с умеренной, реже выраженной инфильтрацией и эритемой, более ограниченными участками лихенизации, большим количеством экскориаций. Больные предъявляли жалобы на зуд различной степени интенсивности: отсредневыраженнргодо интенсивного. У 12 (22,2%) больных отмечено более низкое содержание е-Ат к БК по сравнению с общей группой (р 0,001) и не существенное отличие от показателей группы контроля (р 0,05), равное в среднем 0,752±0,01 (колебание составило от 0,709 до 0,783 ед. опт. плотн.). Для этих больных было характерно среднетяжелое и относительно легкое течение процесса, с распространенным и ограниченным поражением кожных покровов, с умеренной инфильтрацией, эритемой и лихенизацией, незначительным количеством экскориаций, серозно-геморрагических корочек, явлениями экссудации у 2-х. Больные предъявляли жалобы на зуд умеренной интенсивности, слабо выраженное нарушение сна.
