Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 9
Глава 2. Материалы и методы исследования 28
2.1. Материалы исследования 28
2.2. Морфологический метод исследования 29
2.3. Иммуногистохимический метод исследования (ИГХ) 30
2.4. Ультразвуковой метод исследования 32
2.5. Статистический метод 33
Глава 3. Клинические особенности нодулярной базалиомы 34
Особенности локализации опухоли 37
Клинические примеры 39
Глава 4. Особенности морфологического строения нодулярной базалиомы
Пролиферативная активность клеток нодулярной формы базалиомы 47
Глава 5. Лечение нодулярной базалиомы 66
Клинические примеры 72
Заключение 79
Выводы 89
Список литературы 91
- Морфологический метод исследования
- Ультразвуковой метод исследования
- Клинические примеры
- Пролиферативная активность клеток нодулярной формы базалиомы
Морфологический метод исследования
Базальноклеточный рак кожи (син.: базалиома, базальноклеточная карцинома, базальноклеточная эпителиома) - наиболее распространенный рак кожи, играющий существенную роль в общей онкологической заболеваемости [11]. Он не представляет, как правило, угрозы для жизни пациентов, но обладает значительным местнодеструирующим ростом, в силу чего является важной проблемой здравоохранения [55].
Доля БКР среди злокачественных эпителиальных опухолей кожи составляет 45-95%, а ежегодный прирост его частоты оценивают в 10% [13,15,26,27,79,96,99]. Столь существенная частота опухоли и ее преимущественное расположение на открытых участках кожи требуют разработки методов ее лечения, обеспечивающих не только высокие показатели ближайшего и отдаленного ответа организма на его проведение, но и приемлемые косметические результаты для сохранения качества жизни пациента [32]. Это тем более важно, поскольку БКР является существенным фактором развития связанных с ним психических нарушений у пациента, выраженность которых нарастает с увеличением продолжительности болезни [14]. БКР встречается преимущественно у лиц старше 50 лет, значительно реже в более молодом возрасте [90]. В тоже время встречаются описания его развития и у детей [55]. Частота его развития у лиц обоего пола примерно одинакова [26]. В 80-85% случае БКР солитарный, в 10-20% множественный, в случаях когда он носит множественный характер базалиомы возникают либо последовательно, либо, что встречается гораздо реже, одновременно [27,106] . Преимущественно базалиома локализуется на открытых участках кожного покрова, причем в 75,9-97,8% случаев на коже головы (нос, носогубная складка, периорбитальная и периаурикулярная области, лоб, волосистая часть головы) и шеи [67,85,106]. При этом на коже носа он встречается в 39% случаев, щек -в 16,5%, периорбитальной области -в 12,7%, на коже ушной раковины и околоушной области - в 11,4% случаев [27,94]. Реже БКР поражает туловище, конечности, половые органы, перианальную область [52,57]. Локализация на слизистых оболочках, коже ладоней и подошв носит уникальный характер.
Важная роль в развитии БКР отводится ультрафиолетовому излучению (УФИ). Его роль в этиологии базалиомы доказана молекулярными методами исследования. Подтверждает ведущую роль УФИ в развитии заболевания и высокая частота его возникновения у лиц с 1-3 фототипом по Фицпатрику, т.е. чаще всего поражаются лица со светлой кожей и голубыми глазами. Значительная роль в этиопатогенезе отводиться также химическим канцерогенам и ионизирующей радиации [105]. В последние годы появились исследования свидетельствующие о роли ВПЧ в возникновении базалиомы. Ряд авторов указывают на ВПЧ - 5, 8 типов и некоторые другие типы ВПЧ рода beta, которые в биоптатах опухоли были обнаружены в 21-60% случаев, у пациентов с выраженной иммуносупрессией - в 33 до 87% [45,109].
Иммунные нарушения у пациентов, страдающих базалиомой, обычно протекают с явными изменениями в клеточном звене иммунитета [128]. В подавляющем большинстве случаев (40-88%) при обращении больного к врачу размер опухоли не превышает 2-х см, гигантских размеров она достигает обычно при значительной иммуносупрессии [5,27,56]. В этих случаях она течет агрессивно, может проникать в подлежащие ткани, разрушая их, чаще рецидивирует и даже метастазирует [47,72,83,116]. Нередко в подобной ситуации отмечается трансформация базалиомы в метатипический рак кожи [131].
Риск рецидива (продленного опухолевого роста или персистенции) и метастазирования нарастает параллельно с увеличением степени локальной инвазии в нервы, хрящ, кости, полость синусов, череп, орбиту и т.д. [46,119]. Подобное течение обычно описывают у опухолей нодулярной клиничекой формы, в случаях прорастания подлежащих тканей рецидивы отмечают почти в 20% [59] . Высокий процент рецидива обычно наблюдается в случаях высокого инвазивного роста, который связан как с клинической формой опухоли, так и с ее морфологическим строением. По данным F.M..Sexton и соавт., частота рецидивов при удалении поверхностных и нодулярных БКР составляет 3,6%-6,4%, а микронодулярных - 18,6% [108]. Значительное рецидивирование наблюдают и при метатипическом раке кожи - особом морфологическом типе БКР [107]. Важными факторами влияющими на частоту рецидивирования также являются анатомическая локализация, размер, неадекватные методы терапии.
Так, крупные базалиомы труднее поддаются терапии, чем мелкие, что обусловлено их склонностью к распространению глубь и по периферии [47,63]. Ряд авторов указывают на прямую зависимость частоты рецидивов от диаметра БКР. Так, R.D. Sweet после электрокоагуляции и кюретажа наблюдал развитие рецидивов при БКР диаметром менее 2 см в 7,1% случаев, при диаметре от 2 до 3 см- 18,7%, от 3 до 4 см - в 40%, а при диаметре более 4см - в 71% случаев [120]. Аналогичная зависимость была отмечена и другими исследователями, которые применяли для лечения базалиомы и другие методы, в частности хирургическую эксцизию, лучевой терапию, микрографическую операцию по Моосу [60,64, 101, 114,115].
Высокая зависимость частоты рецидивов отмечена при определенной локализации процесса. Прежде всего речь идет о волосистой части головы, ушной раковине, периорбитальной области, кожи носа, слухового прохода [38,78,81,115,133]. В данных областях трудно добиться полного удаления опухолевых масс, т.к. тяжи клеток базалиомы обычно распространяются глубоко вниз по ходу волосяных фолликулов, представленных в данных анатомических зонах в огромном количестве [104].
Ультразвуковой метод исследования
В исследование вошли 237 больных солитарной нодулярной базалиомой, проходивших обследование и лечение в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ и Московском областном кожно-венерологическом диспансере за пять лет (2008 - 2012 гг). Среди них было 137 женщины и 100 мужчин в возрасте от 28 до 80 лет (в среднем 60,2 ± 10,3 лет). Автором самостоятельно было обследовано 75 больных, также был собран материал в результате изучения историй болезней и амбулаторных карт 162 пациентов.
Клинический диагноз базалиомы в каждом случае устанавливали в результате суммирования данных анамнеза и осмотра пациента с учетом клинической картины заболевания с обязательной оценкой размеров очага поражения. Клинический диагноз у каждого пациента подтверждали результатами либо цитологического, либо гистологического исследований. Для цитологического исследования материал получали выполняя соскоб с очага поражения ложкой Фолькмана или скальпелем, для гистологического исследования забирали кусок ткани по следующей методике: под местной анестезией 2% раствором новокаина или лидокаина проводилась биопсия кожи с помощью одноразового бора диаметром 0,6 см, либо 0,8 см. Биоптаты фиксировали в 10% растворе формалина. На область биопсии накладывали давящую повязку на 16-18 часов.
Общее обследование пациентов включало клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, ЭКГ. Другие исследования проводили по показаниям. При необходимости пациентов консультировали со смежными специалистами.
Клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови у всех пациентов были в пределах референсных значений. У 38 пациентов, что составило 76%, были выявлены сопутствующие заболевания. Чаще всего регистрировались болезни сердечно-сосудистой системы: гипертоническая болезнь различной степени тяжести у 14 пациентов, ишемическая болезнь сердца у 7 пациентов, стенокардия напряжения у четырех пациентов. На втором месте стояла патология органов желудочно-кишечного тракта: хронический гастрит - трое больных, хронический холецистит -четверо, из которых у одного холецистит носил калькулезный характер, язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки у трех пациентов, хронический панкреатит у одного, хронический колит у одного больного. Также отмечали хронический пиелонефрит у одного больного, вегетососудистую дистонию у трех и остеохондроз различных отделов позвоночника в шести случаях. В ряде случаев у одного больного отмечали два и более сопутствующих заболеваний.
Биопсийный материал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. 2.3. Иммуногистохимический метод исследования (ИГХ).
Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартному протоколу. Уровень пролиферации определяли на основании экспрессии в ядрах белка КІ67 (антитела к КІ67, производитель фирма DAKO Inc., разведение 1:75).
Подготовка срезов. С парафиновых блоков, сделанных по стандартной методике, делали серийные срезы толщиной не более 5 мкм, которые размещали на полилизиновые стекла с адгезивным покрытием. Выполняли депарафинизацию срезов по стандартной методике, промывая их в спиртах с экспозицией по 3-5 мин. В заключении срезы промывали 5 минут в деионизированной дистиллированной воде, следующие 5 мин в фосфатном буфере, имеющем уровень рН не более 7,4.
Постановка реакции. Срезы погружали в цитратный буфер (рН не более 6,0) и инкубировали в микроволновой печи два раза по 5 мин. Мощность микроволновой обработки 690 Вт. Данная методика была разработана Taylor С. R., Cote R. и Stemberger L.A. [124], модифицирована Shi S.R, предложившего способ восстановления антигенных детерминант ткани с помощью микроволновой обработки [123]. В дальнейшем срезы, помещенные в цитратный буфер, охлаждали при комнатной температуре. Перед нанесением первичных антител срезы подсущивали, затем наносили антитела к КІ67. Срезы с нанесенными антителами инкубировали в водяной камере при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого водяную камеру со срезами помещали в холодильник и инкубировали в течение 14-18 часов при температуре 4С. Срезы промывали в буфере, подсушивали и наносили систему En Vision (антитела противомышиные и противокроличьи, производитель DAKO Inc.). С системой EnVision срезы инкубировали в водяной камере в течение 40 мин. После этого срезы промывали в буфере 2-3 раза, высушивали. В заключении на срезы наносили DAB+ (3, 3 -диаминобензидин). Срезы помещали под микроскоп и при увеличении 200 контролировали интенсивность коричневого окрашивания, которое свидетельствовало о положительной реакции. После того как ядра клеток приобретали интенсивную коричневую окраску срезы помещали несколько раз в дистиллированную воду. После подсушивания срезы инкубировали не более 5 мин при комнатной температуре с гематоксилином Майера. Смывали гематоксилин Майера в проточной воде с добавлением 1-2 мл нашатырного спирта. Срезы обезвоживали последовательно помещая их в спирт 70 два раза и в ксилол два раза. Стекла высущивали, срезы заключались в бальзам и фиксировались покровным стеклом.
В целях контроля реакции на контрольные стекла наносили антитела к гладкомышечному альфа-актину (DAKO Inc., разведение 1:100). Реакцию оценивали как положительную при визуализации сосудов в дерме, экспрессирующих гладкомышечный альфа-актин.
Оценка экспрессии КІ67 и подсчет индекса КІ67. Ядра клеток, экспрессирующих КІ67, имели коричневое окрашивание. Клетки не экспрессирующие КІ67 содержали ядра голубого цвета. Подсчет ядер, экспрессирующих КІ67, проводили под микроскопом при увеличении 400, перемещая препарат сверху вниз и слева направо. Ядра клеток, локализующихся по периферии препарата, как правило, не учитывали, т.к. в данных участках превалировало фоновое окрашивание и реальную положительную реакцию было установить затруднительно.
Клинические примеры
Вторая группа исследованных случаев гистологически была представлена опухолями, которые морфологически содержали микронодулярный компонент. Микронодулярный тип был представлен в 3-х случаях, сочетание солидного и микронодулярного строения также отмечали в трех случаях, в двух отмечалось сочетание микронодулярного и аденоидного компонента. Данные изучения индекса КІ67 представлены в таблице 4.5. Индекс КІ67 распределялся в пределах от 13,7% до 35,4%, при этом среднее значение индекса КІ67 составило 21,72±3,91. Половина опухолей имела индекс пролиферации определенный как высокий. Клетки, экспрессирующие маркер КІ67, в 75% случаев диффузно распределялись по клеточным комплексам, в 25% случаев наблюдали их группировку преимущественно по периферии последних. Средний индекс КІ67 в базалиоме нодулярной формы, которая морфологически была представлена солидным, солидно-аденоидным, аденоидным и солидно-инфильтративным типами, составил 15,02±4,91%, его разброс наблюдали в пределах от 8,6% до 32,1%. Ранее при изучении уровня пролиферации БКР с помощью антител к антигену ядер пролиферирующих клеток было показано, что нодулярная базалиома превосходит по пролиферативной активности клеток поверхностную форму [14]. А.Н.Хлебникова, при изучении уровня пролиферативной активности клеток нодулярной базалиомы показала, что он находиться в пределах 41,03+5,21% и также превышает аналогичный показатель поверхностной формы [34]. Кроме того А.Н.Хлебникова также показала, что нодулярная базалиома по уровню пролиферации уступает язвенной форме опухоли, при которой индекс пролиферации составлял 53,96+3,89 [34]. Следует подчеркнуть, что А.Н.Хлебникова в своей работе использовала маркер пролиферации PCNA (антиген ядер пролиферирующих клеток), который в отличие от КІ67 реагирует с клетками в Gl, S, G2 и М-фазе клеточного цикла, а следовательно экспрессируются большим числом клеток. Различия в уровне пролиферации клинических форм базалиомы также были получены и при изучении митотического индекса клеток поверхностной, узелковой и язвенной формы [8].
Различный индекс пролиферации клеток наблюдали при разных гистологических типах базалиомы. Наиболее высокий (38%) отмечали при инфильтративном типе, типе морфеа (37%) и поверхностном мультицентрическом (35,7%). В то время как при солидном и опухолях с пилоидной дифференцировкой индекс составлял 21,7% и 18,6% соответственно [136]. Следует отметить, что ранее наиболее низкий индекс пролиферации находили в поверхностном мультицентрическом типе, а наиболее высокий в метатипической базалиоме [19].
Базалиомы микронодулярного строения отличаются агрессивным течением [27]. При изучении индекса КІ67 в подобных опухолях мы установили, что среднее его значение составило 21,72±3,91, что 1,5 раза превосходило аналогичный показатель опухолей, имеющих солидный, аденоидный и солидно-аденоидный тип строения (р 0,05). Полученные данные свидетельствуют, что базалиомы с микронодулярным компонентом в гистологическом строении , по сравнению с солидными и аденоидными опухолями, пролиферируют значительно быстрее, а следовательно могут характеризоваться агрессивным характером роста.
Таким образом, средний индекс КІ67 нодулярной формы базалиомы, имеющей солидное, аденоидное, солидно-аденоидное и солидно-инфильтративное строение, составлял 15,02±4,91%, его разброс наблюдали в пределах от 8,6% до 32,1%, большинство опухолей имели средний индекс пролиферации. Нодулярная базалиома, представленная гистологически микронодулярным типом или содержащая микронодулярный компонент при сложном строении, имела средний индекс КІ67 21,72±3,91, который варьировал в разных опухолях от 13,7% до 35,4%, при этом в половине случаев отмечался высокий индекс пролиферации.
Полученные нами данные свидетельствуют, что в отличие от базалиомы в целом, при которой преобладает однотипное строение, нодулярная ее форма примерно в половине случаев имеет сложное морфологическое строение. При этом в два раза чаще при нодулярной форме встречается микронодулярный компонент. Опухоли подобного строения, как правило, отличаются высоким инвазивным потенциалом и включены в группу риска по развитию рецидивов. Наши исследования по изучению пролиферативной активности клеток подтвердило более агрессивный потенциал микронодулярных базалиом, в которых индекс пролиферации был значительно выше, по сравнению с опухолями иных гистологических типов. Полученные результаты диктуют необходимость разработки нового метода лечения нодулярной базалиомы, эффективного при опухолях различного морфологического строения, в том числе и агрессивных, и позволяющего обеспечить приемлемый косметический результат лечения, важность которого объясняется преимущественной локализацией опухоли на открытых участках кожного покрова.
Пролиферативная активность клеток нодулярной формы базалиомы
При изучении базалиом различных клинических типов было установлено, что самым частым типом был нодулярный, он встречался в 58 случаях, что составляло 46,4%. Внутри нодулярного типа отдельно выделяли солидные опухоли - 46 случаев (36,8%), аденоидные опухоли - 12 случаев (9,6%). На третьей позиции находился поверхностный мультицентрический тип - 11 случаев (8,8%). Значительно реже встречались микронодулярный, инфильтративный склерозирующий, базосквамозные типы, с пилоидной дифференцировкой. Опухоли, в которых наблюдали только один морфологический тип наблюдали в 87 случаях, что составило (69,6%). При изучении сочетаний различных морфологических типов в одном гистологическом препарате было установлено, что чаще всего встречалось сочетание солидного и аденоидного типов. Подобное сочетание наблюдали в 13 случаях, что составляло 10,4%. При этом в ряде случаев преобладал солидный компонент, в других аденоидный компонент. Реже всего встречалось равное соотношение того и другого типа в одном гистологическом препарате. Несколько реже наблюдали сочетание солидного и микронодулярного типов (крупные округлые комплексы сочетались с мелкими округлыми комплексами, распределяющимися в нижных отделах дермы). Подобное сочетание было отмечено в 7 случаях, что составило 5,6%. Также в 7 случаях (5,6%) было диагностировано сочетание солидного и инфильтративного типа. При этом отмечено преобладание солидного компонента в половине случаев, инфильтративного компонента в другой половине случаев. В 5 случаях, что составило 4,0%, наблюдали солидные комплексы в центре препарата и мелкие инфильтративно-склерозирующие комплексы по периферии основного очага. Сочетание микронодулярного типа и аденоидного отмечено в 3 случаях (2,4%), при этом преобладал во всех случаях микронодулярный компонент. В единичных случаях констатировали одновременное присутствие в препарате поверхностного мультицентрического типа и солидных комплексов, солидные комплексы в сочетании с комплексами имеющими пилоидную дифференцировку. Сочетание двух различных морфологических типа в одном гистологическом препарате констатировали в 38 случаях, что составило 30,4%.
Основной задачей нашего исследование было изучение морфологического строения нодулярной клинической формы опухоли. Мы подвергли анализу гистологические препараты, приготовленные из биопсийного материала, взятого у больных нодулярной базалиомой.
В случаях клинически нодулярной базалиомы встречались следующие морфологические типы: нодулярный (солидный, аденоидный), микронодулярный, инфильтративный, инфильтративный склерозирующий, с пилоидной дифференцировкой. Также отмечали опухоли имеющие однотипное строение и опухоли, в которых сочеталось два и более гистологических типа.
Чаще всего встречались опухоли, имеющие нодулярный гистологический тип, было выявлено 16 опухолей, что составило 45,6%. Опухоли, имеющие нодулярное гистологическое строение были представлены в 10 случаях солидным строением, что составило 28,5%, и в 6 случаях аденоидным строением, что составило 17,1%. В 3 препаратах (8,6%) констатировали базалиомы микронодулярного гистологического типа. Таким образом, однотипное строение наблюдалось в 19 клинически нодулярных базалиомах, что составляло 54,2%. При клинически нодулярной базалиоме наблюдали сочетание двух гистологических типов в одном препарате, при этом были отмечены следующие комбинации: солидные комплексы в сочетании с аденоидными участками - 6 случаев (17,2%), преимущественно во всех случаях преобладал солидный компонент. Несколько реже наблюдали сочетание солидного и микронодулярного компонентов. Такая комбинация была в 3 случаях, что составило 8,7%. Количество микронодулярных комплексов значительно превышало солидный компонент. Сочетание солидного компонента с инфильтративным и инфильтративно-склерозирующим наблюдали в 4 случаях (5,7% и 5,7% соответственно). В двух препаратах (5,7%) наблюдали сочетание микронодулярного гистологического типа и полей аденоидного строения, с явным преобладанием микронодулярного компонента. Сочетание двух гистологических типов в одном препарате было констатировано в 16 клинически нодулярных базалиомах, что составляло 45,8%. Было отмечено шесть вариантов различных комбинаций.
При сопоставлении морфологии клинически нодулярной базалиомы с базалиомами различного клинического строения были выявлены ряд особенностей нодулярной формы. Гистологически она была представлена пятью морфологическими типами: нодулярный (солидный, аденоидный), микронодулярный, инфильтративный, инфильтративный склерозирующий, с пилоидной дифференцировкой. Базалиома в целом имела более разнообразное гистологическое строение, мы наблюдали семь морфологических типов. В клинически нодулярной базалиоме никогда не встречался поверхностный мультицентрический тип и базосквамозный тип. Обращает на себя внимание высокая частота случаев клинически нодулярной базалиомы, имеющих сложное морфологические строение - 45,8% (преобладали солидно-аденоидные и солидно-микронодулярные опухоли). Частота сложного гистологического типа в базалиоме в целом не превышала 30%.
Отдельно мы проанализировали частоту неблагоприятных в прогностическом отношении гистологических типов, встречающихся при клинически нодулярной форме. Прогностически неблагоприятными большинство авторов рассматривают микронодулярный, инфильтративный, инфильтративно-склерозирующий, базосквамозный. Опухоли данного морфологического строения чаще всего рецидивируют после любых методов терапии. При нодулярной базалиоме агрессивные гистологические типы встречались микронодулярный (8,6%), солидно-микронодулярный (8,7%), солидно-инфильтративный (5,7%), солидно-инфильтративно-склерозирующий (5,7%), микронодулярно-аденоидный (5,7%). В целом агрессивные типы встречались в нодулярной базалиоме в 34,4% случаев. При разных клинических формах базалиомы агрессивные типы отмечались в 30,4% случаев: микронодулярный (4,8%), инфильтративный склерозирующий (4,0%), базосквамозный (3,2%), инфильтративный (0,8%), солидно-микронодулярный (5,6%), солидно-инфильтративный (5,6%), солидно-инфильтративно-склерозирующий (4,0%), микронодулярно-аденоидный (2,4%). Обращает на себя внимание значительное преобладание микронодулярного компонентв в нодулярной базалиоме, по сравнению с базалиомой в целом 23,1% и 12,8% соответственно (р 0,05). Хотелось бы подчеркнуть, что высокая частота микронодулярного компонента в клинически нодулярной базалиоме установлена нами впервые. Отсутствие микронодулярного компонента в нодулярных базалиомах в более ранних исследованиях, скорее всего можно объяснить использованием авторами устаревших гистологических классификаций.
